Name: determining the toxicity of uv radiation and chemicals on primary and immortalized human corneal epithelial cells
Uploaded: 2021-07-22T13:00:00
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1. Kultivierung von pHCECs und iHCECs
<ol><li>Züchten Sie die pHCECs und iHCECs in humanem okulärem Epithelmedium (HOEM) mit den folgenden Nahrungsergänzungsmitteln: 6 mM L-Glutamin, 0,002 % Zellmedienergänzung O (Materialtabelle), 1,0 μM Epinephrin, 0,4 % Zellmedienergänzung P (Materialtabelle), 5 μg/ml rh Insulin, 5 μg/ml Apotransferrin und 100 ng/ml Hydrocortisonhemisuccinat in Kollagen-1-beschichteten Kulturflaschen (18 ml in einem 75 cm2 Kulturkolben).</li>
	<li...

<ol>
	<li>McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+human+corneal+epithelial+cell+line+for+screening+the+safety+of+contact+lens+care+solutions+in+vitro.">Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro.</a> Eye &amp; Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).</li><li>Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+effects+of+ophthalmic+solutions+on+human+corneal+epithelial+cells+using+fluorescent+dyes.">Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).</li><li>Youn, H. Y., McCanna, D. J., Sivak, J. G., Jones, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+ultraviolet-induced+damage+in+human+corneal,+lens,+and+retinal+pigment+epithelial+cells.">In vitro ultraviolet-induced damage in human corneal, lens, and retinal pigment epithelial cells.</a> Molecular Vision. 17, 237-246 (2011).</li><li>Hakkarainen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+cytotoxic+effects+of+marketed+ophthalmic+formulations+on+human+corneal+epithelial+cells.">Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells.</a> International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).</li><li>Spurr, S. J., Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+corneal+epithelium+with+Dispase+II+or+EDTA.+Effects+on+the+basement+membrane+zone.">Isolation of corneal epithelium with Dispase II or EDTA. Effects on the basement membrane zone.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 26 (6), 818-827 (1985).</li><li>Kahn, C. R., Young, E., Lee, I. H., Rhim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+corneal+epithelial+primary+cultures+and+cell+lines+with+extended+life+span:+in+vitro+model+for+ocular+studies.">Human corneal epithelial primary cultures and cell lines with extended life span: in vitro model for ocular studies.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 34 (12), 3429-3441 (1993).</li><li>Araki-Sasaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+SV40-immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+its+characterization.">An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).</li><li>Griffith, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+human+corneal+equivalents+constructed+from+cell+lines.">Functional human corneal equivalents constructed from cell lines.</a> Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).</li><li>Toouli, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+mammary+epithelial+cells+immortalized+by+simian+virus+40+T-Antigen+or+by+the+telomerase+catalytic+subunit.">Comparison of human mammary epithelial cells immortalized by simian virus 40 T-Antigen or by the telomerase catalytic subunit.</a> Oncogene. 21 (1), 128-139 (2002).</li><li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines:+Valuable+tools+or+useless+artifacts.">Cell lines: Valuable tools or useless artifacts.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li><li>Zorn-Kruppa, M., Tykhonova, S., Belge, G., Diehl, H. A., Engelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+corneal+cell+cultures+in+cytotoxicity+testing.">Comparison of human corneal cell cultures in cytotoxicity testing.</a> Altex. 21 (3), 129-134 (2004).</li><li>Huhtala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+an+immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+rabbit+corneal+epithelial+cell+culture+in+cytotoxicity+testing.">Comparison of an immortalized human corneal epithelial cell line and rabbit corneal epithelial cell culture in cytotoxicity testing.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 18 (2), 163-175 (2002).</li><li>Pisella, P. J., Fillacier, K., Elena, P. P., Debbasch, C., Baudouin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+effects+of+preserved+and+unpreserved+formulations+of+timolol+on+the+ocular+surface+of+albino+rabbits.">Comparison of the effects of preserved and unpreserved formulations of timolol on the ocular surface of albino rabbits.</a> Ophthalmic Research. 32 (1), 3-8 (2000).</li><li>Youn, H. Y., Moran, K. L., Oriowo, O. M., Bols, N. C., Sivak, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactant+and+UV-B-induced+damage+of+the+cultured+bovine+lens.">Surfactant and UV-B-induced damage of the cultured bovine lens.</a> Toxicology in vitro. 18 (6), 841-852 (2004).</li><li>Hughes, R., Kilvington, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+hydrogen+peroxide+contact+lens+disinfection+systems+and+solutions+against+Acanthamoeba+polyphaga.">Comparison of hydrogen peroxide contact lens disinfection systems and solutions against Acanthamoeba polyphaga.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (7), 2038-2043 (2001).</li><li>Delic, N. C., Lyons, J. G., Di Girolamo, N., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damaging+effects+of+ultraviolet+radiation+on+the+cornea.">Damaging effects of ultraviolet radiation on the cornea.</a> Photochemistry and Photobiology. 93 (4), 920-929 (2017).</li><li>Ahuja, D., Saenz-Robles, M. T., Pipas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SV40+large+T+antigen+targets+multiple+cellular+pathways+to+elicit+cellular+transformation.">SV40 large T antigen targets multiple cellular pathways to elicit cellular transformation.</a> Oncogene. 24 (52), 7729-7745 (2005).</li><li>Tong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pin1+inhibits+PP2A-mediated+Rb+dephosphorylation+in+regulation+of+cell+cycle+and+S-phase+DNA+damage.">Pin1 inhibits PP2A-mediated Rb dephosphorylation in regulation of cell cycle and S-phase DNA damage.</a> Cell Death &amp; Disease. 6, 1640 (2015).</li><li>Muller, P. A., Vousden, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+mutations+in+cancer.">p53 mutations in cancer.</a> Nature Cell Biology. 15 (1), 2-8 (2013).</li><li>Seshacharyulu, P., Pandey, P., Datta, K., Batra, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatase:+PP2A+structural+importance,+regulation+and+its+aberrant+expression+in+cancer.">Phosphatase: PP2A structural importance, regulation and its aberrant expression in cancer.</a> Cancer Letters. 335 (1), 9-18 (2013).</li><li>Yang, D., Okamura, H., Morimoto, H., Teramachi, J., Haneji, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+2A+Calpha+regulates+proliferation,+migration,+and+metastasis+of+osteosarcoma+cells.">Protein phosphatase 2A Calpha regulates proliferation, migration, and metastasis of osteosarcoma cells.</a> Laboratory nvestigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1050-1062 (2016).</li><li>Xie, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+and+inactivation+of+the+PP2A+complex+promotes+the+proliferation+and+angiogenesis+of+hemangioma+endothelial+cells+through+activating+AKT+and+ERK.">Disruption and inactivation of the PP2A complex promotes the proliferation and angiogenesis of hemangioma endothelial cells through activating AKT and ERK.</a> Oncotarget. 6 (28), 25660-25676 (2015).</li><li>Mallet, J. D., Rochette, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wavelength-dependent+ultraviolet+induction+of+cyclobutane+pyrimidine+dimers+in+the+human+cornea.">Wavelength-dependent ultraviolet induction of cyclobutane pyrimidine dimers in the human cornea.</a> Photochemical &amp; Photobiological Sciences. 12 (8), 1310-1318 (2013).</li><li>Cejkova, J., Cejka, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+oxidative+stress+in+corneal+diseases+and+injuries.">The role of oxidative stress in corneal diseases and injuries.</a> Histology and Histopathology. 30 (8), 893-900 (2015).</li><li>Wang, S. Q., Balagula, Y., Osterwalder, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoprotection:+a+review+of+the+current+and+future+technologies.">Photoprotection: a review of the current and future technologies.</a> Dermatologic Therapy. 23 (1), 31-47 (2010).</li><li>Svobodova, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+after+acute+exposure+of+mice+skin+to+physiological+doses+of+UVB+and+UVA+light.">DNA damage after acute exposure of mice skin to physiological doses of UVB and UVA light.</a> Archives of Dermatological Research. 304 (5), 407-412 (2012).</li><li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+irradiation+induces+the+production+of+multiple+cytokines+by+human+corneal+cells.">Ultraviolet irradiation induces the production of multiple cytokines by human corneal cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 38 (12), 2483-2491 (1997).</li><li>Kode, A., Yang, S. R., Rahman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+cigarette+smoke+on+oxidative+stress+and+proinflammatory+cytokine+release+in+primary+human+airway+epithelial+cells+and+in+a+variety+of+transformed+alveolar+epithelial+cells.">Differential effects of cigarette smoke on oxidative stress and proinflammatory cytokine release in primary human airway epithelial cells and in a variety of transformed alveolar epithelial cells.</a> Respiratory Research. 7, 132 (2006).</li><li>Epstein, S. P., Chen, D., Asbell, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+biomarkers+of+inflammation+in+response+to+benzalkonium+chloride+on+corneal+and+conjunctival+epithelial+cells.">Evaluation of biomarkers of inflammation in response to benzalkonium chloride on corneal and conjunctival epithelial cells.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 25 (5), 415-424 (2009).</li></ol>

Mögliche Unterschiede in der Verwendung von zwei Arten von HCECs wurden bewertet. Die Zellen wurden in das gleiche Medium (HOEM) mit identischen Zellkonzentrationen eingebracht und dann kurzen und langen Perioden von UV-Strahlung und drei Augentoxinen ausgesetzt. Die Dosen von UV-Strahlung und Chemikalien wurden auf der Grundlage ihrer physiologischen Wirkungen ausgewählt, die für die Zellen schädlich genug waren, um Zwischenreaktionen hervorzurufen, die verglichen werden konnten. Expositionszeiten von 5 und 20 min f...

In-vitro-toxikologische Studien werden durchgeführt, um die toxischen Wirkungen von Chemikalien und anderen Wirkstoffen vorherzusagen, die Zellen schädigen können. Bei der Bewertung der Toxizität für die Hornhaut wurden humane Hornhautepithelzellen (HCECs) in Modellen zur Bewertung dieser Effekte verwendet 1,2,3,4. Diese Modelle bewerten in der Regel physiologische Effekte wie Veränderungen der Stoffwechselaktivität der Zelle, Zellproliferation und andere Zellfunktionen wie die Produktion und Freisetzung von entzündlichen Zytokinen. Für diese toxikologischen Studien wurden Zellen aus verschiedenen Quellen ausgewählt, um die schädlichen Auswirkungen von Chemikalien und UV-Strahlung auf HCECs zu bewerten 2,3. pHCEC-Linien sind von Unternehmen erhältlich, die diese Zellen aus Spendergewebe von Erwachsenen liefern. Primärzellen können mit Dispase behandelt und für die Kultur schonend von der Hornhaut abgekratzt werden5. Die Zellen werden dann auf Viren und Verunreinigungen getestet und dann kryokonserviert in 10% Dimethylsulfoxid verschickt.
Der Vorteil von primären Zelllinien besteht darin, dass die Zellen genetisch identisch mit den Zellen des Spenders sind. Dies ist ideal, da ein In-vitro-Modell das In-vivo-Gewebe so weit wie möglich nachahmen sollte. Der Nachteil von primären Zelllinien besteht darin, dass sie eine begrenzte Anzahl von Zellteilungen oder -passagenaufweisen 6. Die begrenzte Anzahl der verfügbaren Zellen schränkt die Anzahl der Experimente ein, die mit einer einzigen Primärkultur durchgeführt werden können, was die Kosten der Experimente erhöht.
Immortalisierte Zelllinien wurden auch in Toxizitätsmodellen für Zellkulturen verwendet. Im Gegensatz zur primären Zelllinie, die aus In-vivo-Gewebe gewonnen wird, wurde die immortalisierte Zelllinie jedoch genetisch verändert. Immortalisierte Zellen entstehen, indem die Gene eines Virus in die DNA von Primärzellen eingebautwerden 6,7,8. Zellen mit erfolgreicher viraler Geninkorporation werden für die immortalisierte Zelllinie ausgewählt. Der Vorteil der Immortalisierung besteht darin, dass sie eine unbegrenzte schnelle Proliferation ermöglicht und eine unbegrenzte Anzahl von Zellen zur Verfügung stellt, um mehrere Experimente mit derselben Zelllinie durchzuführen. Dies ermöglicht Konsistenz zwischen den Experimenten und senkt die Kosten.
Zusätzlich zu den Veränderungen in den Genen, die die Zellproliferation einschränken, können auch Veränderungen in der Expression von Genen mit kritischer Funktionalität auftreten9. Der Nachteil der Verwendung von immortalisierten Zellen besteht daher darin, dass sie in Bezug auf ihre Reaktion auf verschiedene äußere Reize möglicherweise nicht mehr die ursprünglichen In-vivo-Zellen darstellen10. Bei den Vergleichen wurden die toxischen Wirkungen von Chemikalien auf primäre und immortalisierte menschliche Hornhautkeratozyten11 sowie auf immortalisierte HCECs und Kaninchen-Hornhautepithel-Primärzellen12 beobachtet. Der Vergleich zwischen den Effekten von Toxinen auf primäre humane Keratozyten und immortalisierte Keratozyten zeigte keine signifikanten Unterschiede11. Mit den in diesem Artikel beschriebenen Methoden wird die Wirksamkeit dieser Assays zur Beurteilung der Toxizität von UV-Strahlung und Augentoxinen auf pHCECs und iHCECs bestimmt.
Es wurden drei okuläre Toxine ausgewählt, die üblicherweise in In-vitro-Assays verwendet werden: BAK,H2O2und SDS. BAK ist ein kationisches Konservierungsmittel, das häufig in ophthalmologischen Lösungen verwendet wird 13,14,H2O2wird häufig zur Desinfektion von Kontaktlinsen 15 verwendet, und SDS ist ein anionisches Tensid, das in Waschmitteln und Shampoos 14 vorkommt. Ähnlich wie Augentoxine kann auch UV-Strahlung HCECs erheblich schädigen3. Darüber hinaus kann eine übermäßige UV-Strahlung eine Augenerkrankung verursachen, die als Photokeratitis bekannt ist und durch Symptome wie Tränenfluss, Lichtempfindlichkeit und ein Gefühl der Körnigkeit gekennzeichnet ist16.
Es gibt eine unbegrenzte Anzahl von primären Zellkulturen, die verwendet werden können, und verschiedene immortalisierte Zelllinien, die entwickelt wurden. Daher wurde eine Untersuchung durchgeführt, um primäre HCECs mit einer immortalisierten HCEC-Linie zu vergleichen, um Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen Modellen zu ermitteln, die diese Zelltypen enthalten.
Diese Untersuchung nutzte die Mikroskopie, um mögliche Unterschiede zwischen pHCECs und iHCECs in Bezug auf die physiologische Reaktion der Zellen auf UV-Strahlung und Toxine zu bewerten. Die Auswirkungen von UV-Strahlung und Chemikalien auf die Zellstoffwechselaktivität und die inflammatorische Zytokinfreisetzung für die beiden Zelllinien wurden ebenfalls untersucht. Die Bedeutung der Bestimmung der Unterschiede zwischen den beiden Zelllinien besteht darin, die optimale Verwendung dieser Zelllinien für die Bewertung zu verstehen: 1) die Wirkung von UV-Strahlung auf Zellen, 2) die Auswirkungen von Toxinen auf Zellen und 3) die daraus resultierenden Veränderungen des Stoffwechsels, der Zelllebensfähigkeit und der Zellzytokinfreisetzung für zukünftige Studien.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>75 cm2 Vented Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354485</td>
			<td>This is the BioCoat brand, collagen-coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>costar</td>
			<td>3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alamarBlue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>dal 1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin Staining buffer solution</td>
			<td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V</td>
			<td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system</td>
			<td>Carl Zeiss Inc., Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 48 Well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354505</td>
			<td>This is the BioCoat brand, collagen-coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>CYT5MPV</td>
			<td>Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hycone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass bottom coverslips</td>
			<td>MatTek Corporation, Ashland, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Corneal Epithelial Cells</td>
			<td>University of Ottawa</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements:</td>
			<td>Millipore, Billerica, MA, USA</td>
			<td>SCMC001</td>
			<td>Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 &#956;M Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 &#956;g/mL rh Insulin, 5 &#956;g/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Dead calcien and ethidium homodimer</td>
			<td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument</td>
			<td>Rockville, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay</td>
			<td>Rockville, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Corneal Epithelial Cells</td>
			<td>Millipore, Billerica, MA, USA</td>
			<td>SCCE016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax fluorescence multi-well plate reader</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell disassociation solution)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12605036</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining the toxicity of uv radiation and chemicals on primary and immortalized human corneal epithelial cells

Dieser Artikel beschreibt die Methoden zur Messung der Toxizität von ultravioletter (UV) Strahlung und Augentoxinen auf primären (pHCEC) und immortalisierten (iHCEC) humanen Hornhautepithelzellkulturen. Die Zellen wurden UV-Strahlung und toxischen Dosen von Benzalkoniumchlorid (BAK), Wasserstoffperoxid (H2O2) und Natriumdodecylsulfat (SDS) ausgesetzt. Die metabolische Aktivität wurde mit einem metabolischen Assay gemessen. Die Freisetzung von inflammatorischen Zytokinen wurde mit einem Multiplex-Interleukin (IL)-1β-, IL-6-, IL-8- und Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α)-Assay gemessen, und die Zellen wurden mit Fluoreszenzfarbstoffen auf ihre Lebensfähigkeit untersucht.
Die schädigenden Auswirkungen von UV-Strahlung auf die Stoffwechselaktivität und die Freisetzung von Zytokinen traten bei 5 min UV-Exposition für iHCEC und 20 min für pHCEC auf. Ähnliche prozentuale Abnahmen der metabolischen Aktivität von iHCEC und pHCEC traten nach Exposition gegenüber BAK,H2O2 oder SDS auf, und die signifikantesten Veränderungen in der Zytokinfreisetzung traten für IL-6 und IL-8 auf. Die Mikroskopie von fluoreszenzgefärbten iHCEC- und pHCEC-BAK-exponierten Zellen zeigte den Zelltod bei 0,005% BAK-Exposition, obwohl der Grad der Ethidiumfärbung bei den iHCECs größer war als bei pHCECs. Unter Verwendung mehrerer Methoden zur Beurteilung toxischer Wirkungen mittels Mikroskopie, Bewertung der Stoffwechselaktivität und Zytokinproduktion konnte die Toxizität von UV-Strahlung und chemischen Toxinen sowohl für primäre als auch für immortalisierte Zelllinien bestimmt werden.

Zellengröße Die primären und immortalisierten HCECs wurden mit drei Fluoreszenzfarbstoffen visualisiert, die drei verschiedene Stadien der Zellviabilität widerspiegeln. Lebende Zellen sind grün (Calcein-AM), tote Zellen rot (Ethidium-Homodimer-1) und apoptotische Zellen gelb (Annexin-V-Computer-angepasste Farbe zur besseren Visualisierung des Fluoreszenzsignals). Lebende Zellen enthalten Esterasen im Zellzytoplasma und wandeln Calcein-AM in Calcein um. Tote Zellen haben Zellmembranen, die für Et...

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Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells

Dieser Artikel beschreibt die Verfahren zur Bewertung der Toxizität von UV-Strahlung und chemischen Toxinen auf einer primären und immortalisierten Zelllinie.

Bestimmung der Toxizität von UV-Strahlung und Chemikalien auf primären und immortalisierten humanen Hornhautepithelzellen

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) ...

Mit dieser Methode kann die Toxizität neuer ophthalmologischer Produktformulierungen in vitro bewertet werden. Durch die Verfeinerung der Konzentrationen von Chemikalien und Produktformulierungen unter Verwendung von Augenzellen in vitro kann der Einsatz von Tieren zur Beurteilung der Sicherheit neuer Produkte minimiert werden. In-vitro-Assays bewerten Toxizitätsendpunkte, die in vivo nicht bewertet werden können, wie z. B. die Bestimmung der Wirkung einer Chemikalie auf die mitochondriale Funktion, die Integrität der Zellmembran und die Enzymaktivität.Die Bewertung der Zelltoxizität in vitro ist der Schlüssel zum Verständnis potenzieller Toxizitätsmechanismen. Dies ist wichtig, um eine maximal tolerierbare Dosis therapeutischer Chemikalien im Auge zu erreichen. Das Verfahren wird von Nijani Nagaarudkumaran, einem Forscher des Jones Laboratory, demonstriert.Beginnen Sie damit, sowohl pHCECs als auch iHCECs auf kollagenbeschichtete Petrischalen mit Deckgläsern mit Glasboden in einer Konzentration von 1 x 10 bis 5 mit 1 Milliliter humanem Augenepithelmedium (HOEM) zu setzen. Züchten Sie pHCECs und iHCECs, 1 Satz Kulturen für 24 Stunden und ein weiteres Set für 48 Stunden in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Nach der Inkubation werden die Zellen mit 500 Mikrolitern Annexin-Färbepufferlösung, die 4 mikromolare Calcein, 8 mikromolare Ethidiumhomodimer 1 und Annexin 5 enthält, 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius gefärbt.Nachdem Sie die Zellen gefärbt haben, stellen Sie das konfokale Laser-Scanning-Mikroskop so ein, dass es die Anregungs- und Emissionswellenlängen erfasst, wie im Textmanuskript beschrieben. Besorgen Sie sich die zweidimensionalen und dreidimensionalen Bilder gemäß den Anweisungen im Manuskript. Die Zellen werden mit 5 x 10 bis 4 pro Milliliter HOEM in jede Vertiefung einer 24-Well-Kollagen-1-beschichteten Kulturplatte ausgesät und bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid 3 Stunden lang inkubiert.Nach der Inkubation wird das Volumen des Mediums in den Vertiefungen auf 300 Mikroliter reduziert. Als nächstes setzen Sie die Zellen in separaten Experimenten 5 und 20 Minuten lang UVA-Strahlung mit 6,48 Watt pro Quadratmeter und UVB-Strahlung mit 1,82 Watt pro Quadratmeter bei 37 Grad Celsius aus. Nach UV-Bestrahlung 200 Mikroliter frisches HOEM in jede Vertiefung geben und 20 Stunden bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid inkubieren.Am nächsten Tag wird der Zellüberstand in jeder Vertiefung gesammelt und in sterile 2-Milliliter-Polypropylenröhrchen umgefüllt. Den Überstand bei minus 80 Grad Celsius einfrieren. Um die Zytokinspiegel zu bestimmen, die von den pHCECs und iHCECs nach UV-Exposition freigesetzt werden, verwenden Sie einen Multiplex-Zytokin-Assay und befolgen Sie die Anweisungen des Kits zur Quantifizierung von Interleukin 6, Interleukin 8, Interleukin-1 beta und TNF-alpha.Bereiten Sie ein 10%metabolisches Assay-Reagenz in DMEM und F12 vor. Ersetzen Sie das Nährmedium in jeder Vertiefung durch 1 Milliliter der 10%igen metabolischen Assay-Lösung und inkubieren Sie es bei 37 Grad Celsius mit 5%Kohlendioxid für 4 Stunden. Messen Sie die Fluoreszenz jeder Lösung mit einem Fluoreszenzplatten-Lesegerät bei 530 Nanometern Anregung und 590 Nanometern Emissionswellenlänge.Samenzellen bei 5 x 10 bis zum Viertel pro Milliliter HOEM in jeder Vertiefung einer 24-Well-Kollagen-1-beschichteten Kulturplatte. Bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid 3 Stunden inkubieren. Entfernen Sie nach der Inkubation das Medium und setzen Sie die Zellen 5 und 15 Minuten lang 1 Milliliter chemischen Toxinen aus, zu denen 0,001 % Benzalkoniumchlorid oder BAK, 0,01 % Wasserstoffperoxid und 0,0025 % Natriumdodecylsulfat in PBS gehören.Entfernen Sie nach dem Kontakt mit den chemischen Toxinen die Giftstoffe aus den Vertiefungen, spülen Sie sie mit 1 Milliliter PBS ab und geben Sie 1 Milliliter HOEM in jede Vertiefung. Führen Sie nach 20 Stunden Inkubation einen metabolischen Assay durch, indem Sie das Medium durch 1 Milliliter einer 10%igen metabolischen Assay-Lösung ersetzen und 4 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5%igem Kohlendioxid inkubieren. Messen Sie die Fluoreszenz jeder Lösung mit einem Fluoreszenzplatten-Lesegerät bei einer Anregung von 530 Nanometern und einer Emissionswellenlänge von 590 Nanometern.Nach der 20-stündigen Inkubation werden die Zellüberstände aus den Vertiefungen in separate sterile 2-Milliliter-Polypropylenröhrchen überführt und bei minus 80 Grad Celsius eingefroren. Verwenden Sie dieselbe Multiplex-Plattform, die zur Bestimmung der Zytokine aus den UV-behandelten Zellen verwendet wird, gemäß den Anweisungen des Kits zur Quantifizierung von Interleukin 6, Interleukin 8, Interleukin-1 beta und TNF-alpha. Samenzellen bei 1 x 10 bis 5 pro Milliliter HOEM in jede Vertiefung einer 24-Well-Kollagen-1-beschichteten Kulturplatte und inkubieren bei 37 Grad Celsius mit 5%Kohlendioxid für 24 Stunden.Entfernen Sie nach der Inkubation das Medium und setzen Sie die Zellen 5 Minuten lang 1 Milliliter chemischen Toxinen aus, einschließlich 0,001 % BAK, 0,005 % BAK und 0,01 % BAK in PBS. Entfernen Sie nach der Exposition die chemischen Giftstoffe, spülen Sie die Vertiefungen mit 1 Milliliter PBS aus und geben Sie 1 Milliliter HOEM in jede Vertiefung. Nach 20 Stunden Inkubation werden die Zellen mit 500 Mikrolitern Annexin-Färbepufferlösung, die Calcein, Ethidiumhomodimer und Annexin 5 enthält, 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius gefärbt.Stellen Sie das Mikroskop so ein, dass Intensitäten bei Anregungs- und Emissionswellenlängen von 630 und 675 Nanometern für Annexin 5, 495 und 515 Nanometer für Calcinein AM und 528 und 617 Nanometer für die Ethidium-1-Färbung gemessen werden. Nehmen Sie dann mit dem Fluoreszenzmikroskop Bilder der Zellen auf. Es stellte sich heraus, dass es sich bei den iHCECs um kleine Zellen handelte, die zwischen 10 und 20 Mikrometer groß waren, und die pHCECs lagen nach 24 Stunden Wachstum im Bereich von 20 bis 50 Mikrometern.Ähnliche Unterschiede im Größenbereich wurden für iHCECs und pHCECs nach 48 Stunden Wachstum beobachtet. Im Vergleich zu den nicht UV-exponierten Zellen war die Stoffwechselaktivität der bestrahlten pHCECs nach 20 Minuten Exposition signifikant reduziert. Bei iHCECs nahm die metabolische Aktivität für Zellen, die sowohl nach 5 als auch nach 20 Minuten bestrahlt wurden, ab.Daher dauerte es eine längere Expositionszeit, um die metabolische Aktivität der pHCECs zu reduzieren als die der iHCECs. Die maximale Zytokinfreisetzung durch die iHCECs lag bei 5 Minuten UV-Exposition. Die maximale Zytokinfreisetzung für pHCECs erfolgte bei 20 Minuten UV-Exposition.Gemessen an der Gesamtmenge der freigesetzten inflammatorischen Zytokine setzten die pHCECs wesentlich mehr Interleukin-1 beta, Interleukin 8 und TNF-alpha frei als die iHCECs, während die iHCECs mehr Interleukin 6 freisetzten. Sowohl pHCECs als auch iHCECs zeigten eine Veränderung in der Freisetzung von Interleukin 6 nach Exposition gegenüber allen drei Chemikalien. BAK verursachte eine Abnahme der Freisetzung von Interleukin 6 im Vergleich zur Kontrollgruppe sowohl für primäre als auch für immortalisierte HCECs.Wasserstoffperoxid bewirkte eine erhöhte Freisetzung von Interleukin 6 aus iHCECs und eine Abnahme der Freisetzung aus pHCECs. Sowohl pHCECs als auch iHCECs waren mit 0,005 % und 0,1 % des BAK signifikant geschädigt. Nach der Durchführung von In-vitro-Bewertungen der Toxizität von Augenzellen könnten weitere Tiermodelle zur Augentoxizität durchgeführt werden, um die Wirkung eines Augenprodukts auf die Hornhautnerven oder das okuläre Immunsystem zu bestimmen.Diese Techniken sind unerlässlich, um die Mechanismen der Toxizität von Chemikalien und Produktformulierungen für das Auge zu bestimmen, und tragen dazu bei, den Einsatz von Tieren für Produktentwicklungstests zu minimieren.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Primären humanen bronchialen Epithelzellen aus Explantaten Grown

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Forschung

Biologie

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Response to ionisierender Strahlung

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX following Ionizing Radiation

Auswertung der räumlichen Verteilung der γH2AX folgenden ionisierender Strahlung

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

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Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

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Ex vivo-Kultur von primären humanen Eileiter Epithelzellen

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