Name: determining the toxicity of uv radiation and chemicals on primary and immortalized human corneal epithelial cells
Uploaded: 2021-07-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells at JoVE.com

המחברים לא קיבלו מימון לעבודה זו.

1. תרבות של pHCECs ו- iHCECs
<ol><li>לגדל את pHCECs ו- iHCECs בתווך אפיתל עיני אנושי (HOEM) עם התוספים הבאים: 6 mM L-גלוטמין, 0.002% תוסף מדיה התאית O (טבלה של חומרים), 1.0 μM אפינפרין, 0.4% תוסף מדיה התאית P (טבלה של חומרים), 5 מיקרוגרם / מ"ל אינסולין rh, 5 מיקרוגרם / מ"ל apo-transferrin, ו 100 ng / mL הידרוקורטיזון hemisuccinate ?...

<ol>
	<li>McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+human+corneal+epithelial+cell+line+for+screening+the+safety+of+contact+lens+care+solutions+in+vitro.">Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro.</a> Eye &amp; Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).</li><li>Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+effects+of+ophthalmic+solutions+on+human+corneal+epithelial+cells+using+fluorescent+dyes.">Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).</li><li>Youn, H. Y., McCanna, D. J., Sivak, J. G., Jones, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+ultraviolet-induced+damage+in+human+corneal,+lens,+and+retinal+pigment+epithelial+cells.">In vitro ultraviolet-induced damage in human corneal, lens, and retinal pigment epithelial cells.</a> Molecular Vision. 17, 237-246 (2011).</li><li>Hakkarainen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+cytotoxic+effects+of+marketed+ophthalmic+formulations+on+human+corneal+epithelial+cells.">Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells.</a> International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).</li><li>Spurr, S. J., Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+corneal+epithelium+with+Dispase+II+or+EDTA.+Effects+on+the+basement+membrane+zone.">Isolation of corneal epithelium with Dispase II or EDTA. Effects on the basement membrane zone.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 26 (6), 818-827 (1985).</li><li>Kahn, C. R., Young, E., Lee, I. H., Rhim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+corneal+epithelial+primary+cultures+and+cell+lines+with+extended+life+span:+in+vitro+model+for+ocular+studies.">Human corneal epithelial primary cultures and cell lines with extended life span: in vitro model for ocular studies.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 34 (12), 3429-3441 (1993).</li><li>Araki-Sasaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+SV40-immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+its+characterization.">An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).</li><li>Griffith, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+human+corneal+equivalents+constructed+from+cell+lines.">Functional human corneal equivalents constructed from cell lines.</a> Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).</li><li>Toouli, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+mammary+epithelial+cells+immortalized+by+simian+virus+40+T-Antigen+or+by+the+telomerase+catalytic+subunit.">Comparison of human mammary epithelial cells immortalized by simian virus 40 T-Antigen or by the telomerase catalytic subunit.</a> Oncogene. 21 (1), 128-139 (2002).</li><li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines:+Valuable+tools+or+useless+artifacts.">Cell lines: Valuable tools or useless artifacts.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li><li>Zorn-Kruppa, M., Tykhonova, S., Belge, G., Diehl, H. A., Engelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+corneal+cell+cultures+in+cytotoxicity+testing.">Comparison of human corneal cell cultures in cytotoxicity testing.</a> Altex. 21 (3), 129-134 (2004).</li><li>Huhtala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+an+immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+rabbit+corneal+epithelial+cell+culture+in+cytotoxicity+testing.">Comparison of an immortalized human corneal epithelial cell line and rabbit corneal epithelial cell culture in cytotoxicity testing.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 18 (2), 163-175 (2002).</li><li>Pisella, P. J., Fillacier, K., Elena, P. P., Debbasch, C., Baudouin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+effects+of+preserved+and+unpreserved+formulations+of+timolol+on+the+ocular+surface+of+albino+rabbits.">Comparison of the effects of preserved and unpreserved formulations of timolol on the ocular surface of albino rabbits.</a> Ophthalmic Research. 32 (1), 3-8 (2000).</li><li>Youn, H. Y., Moran, K. L., Oriowo, O. M., Bols, N. C., Sivak, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactant+and+UV-B-induced+damage+of+the+cultured+bovine+lens.">Surfactant and UV-B-induced damage of the cultured bovine lens.</a> Toxicology in vitro. 18 (6), 841-852 (2004).</li><li>Hughes, R., Kilvington, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+hydrogen+peroxide+contact+lens+disinfection+systems+and+solutions+against+Acanthamoeba+polyphaga.">Comparison of hydrogen peroxide contact lens disinfection systems and solutions against Acanthamoeba polyphaga.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (7), 2038-2043 (2001).</li><li>Delic, N. C., Lyons, J. G., Di Girolamo, N., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damaging+effects+of+ultraviolet+radiation+on+the+cornea.">Damaging effects of ultraviolet radiation on the cornea.</a> Photochemistry and Photobiology. 93 (4), 920-929 (2017).</li><li>Ahuja, D., Saenz-Robles, M. T., Pipas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SV40+large+T+antigen+targets+multiple+cellular+pathways+to+elicit+cellular+transformation.">SV40 large T antigen targets multiple cellular pathways to elicit cellular transformation.</a> Oncogene. 24 (52), 7729-7745 (2005).</li><li>Tong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pin1+inhibits+PP2A-mediated+Rb+dephosphorylation+in+regulation+of+cell+cycle+and+S-phase+DNA+damage.">Pin1 inhibits PP2A-mediated Rb dephosphorylation in regulation of cell cycle and S-phase DNA damage.</a> Cell Death &amp; Disease. 6, 1640 (2015).</li><li>Muller, P. A., Vousden, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+mutations+in+cancer.">p53 mutations in cancer.</a> Nature Cell Biology. 15 (1), 2-8 (2013).</li><li>Seshacharyulu, P., Pandey, P., Datta, K., Batra, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatase:+PP2A+structural+importance,+regulation+and+its+aberrant+expression+in+cancer.">Phosphatase: PP2A structural importance, regulation and its aberrant expression in cancer.</a> Cancer Letters. 335 (1), 9-18 (2013).</li><li>Yang, D., Okamura, H., Morimoto, H., Teramachi, J., Haneji, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+2A+Calpha+regulates+proliferation,+migration,+and+metastasis+of+osteosarcoma+cells.">Protein phosphatase 2A Calpha regulates proliferation, migration, and metastasis of osteosarcoma cells.</a> Laboratory nvestigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1050-1062 (2016).</li><li>Xie, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+and+inactivation+of+the+PP2A+complex+promotes+the+proliferation+and+angiogenesis+of+hemangioma+endothelial+cells+through+activating+AKT+and+ERK.">Disruption and inactivation of the PP2A complex promotes the proliferation and angiogenesis of hemangioma endothelial cells through activating AKT and ERK.</a> Oncotarget. 6 (28), 25660-25676 (2015).</li><li>Mallet, J. D., Rochette, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wavelength-dependent+ultraviolet+induction+of+cyclobutane+pyrimidine+dimers+in+the+human+cornea.">Wavelength-dependent ultraviolet induction of cyclobutane pyrimidine dimers in the human cornea.</a> Photochemical &amp; Photobiological Sciences. 12 (8), 1310-1318 (2013).</li><li>Cejkova, J., Cejka, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+oxidative+stress+in+corneal+diseases+and+injuries.">The role of oxidative stress in corneal diseases and injuries.</a> Histology and Histopathology. 30 (8), 893-900 (2015).</li><li>Wang, S. Q., Balagula, Y., Osterwalder, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoprotection:+a+review+of+the+current+and+future+technologies.">Photoprotection: a review of the current and future technologies.</a> Dermatologic Therapy. 23 (1), 31-47 (2010).</li><li>Svobodova, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+after+acute+exposure+of+mice+skin+to+physiological+doses+of+UVB+and+UVA+light.">DNA damage after acute exposure of mice skin to physiological doses of UVB and UVA light.</a> Archives of Dermatological Research. 304 (5), 407-412 (2012).</li><li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+irradiation+induces+the+production+of+multiple+cytokines+by+human+corneal+cells.">Ultraviolet irradiation induces the production of multiple cytokines by human corneal cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 38 (12), 2483-2491 (1997).</li><li>Kode, A., Yang, S. R., Rahman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+cigarette+smoke+on+oxidative+stress+and+proinflammatory+cytokine+release+in+primary+human+airway+epithelial+cells+and+in+a+variety+of+transformed+alveolar+epithelial+cells.">Differential effects of cigarette smoke on oxidative stress and proinflammatory cytokine release in primary human airway epithelial cells and in a variety of transformed alveolar epithelial cells.</a> Respiratory Research. 7, 132 (2006).</li><li>Epstein, S. P., Chen, D., Asbell, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+biomarkers+of+inflammation+in+response+to+benzalkonium+chloride+on+corneal+and+conjunctival+epithelial+cells.">Evaluation of biomarkers of inflammation in response to benzalkonium chloride on corneal and conjunctival epithelial cells.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 25 (5), 415-424 (2009).</li></ol>

הוערכו הבדלים פוטנציאליים בשימוש בשני סוגים של HCEC. התאים מוקמו באותו תווך (HOEM) בריכוזים זהים של תאים ולאחר מכן נחשפו לפרקי זמן קצרים וארוכים של קרינת UV ושלושה רעלנים עיניים. מינונים של קרינת UV וכימיקלים נבחרו על סמך ההשפעות הפיזיולוגיות שלהם, שהיו מזיקות מספיק לתאים כדי לייצר תגובות ביניי?...

מחקרי טוקסיקולוגיה חוץ גופית מבוצעים כדי לחזות את ההשפעות הרעילות של כימיקלים וחומרים אחרים שיכולים לגרום נזק לתאים. בהערכת רעילות לקרנית, תאי אפיתל של הקרנית האנושית (HCECs) שימשו במודלים להערכת השפעות אלה 1,2,3,4. מודלים אלה בדרך כלל מעריכים השפעות פיזיולוגיות כגון שינויים בפעילות המטבולית של התא, התפשטות תאים, ותפקודי תאים אחרים כגון ייצור ושחרור של ציטוקינים דלקתיים. עבור מחקרים טוקסיקולוגיים אלה, תאים ממקורות שונים נבחרו כדי להעריך את ההשפעות המזיקות של כימיקלים וקרינת UV על HCECs 2,3. קווי pHCEC זמינים מחברות המספקות תאים אלה מרקמות תורם של מבוגרים. תאים ראשוניים ניתן לטפל עם dispase בעדינות לגרד את הקרנית עבור תרבית5. התאים נבדקים לאחר מכן עבור וירוסים וזיהום ולאחר מכן נשלח cryopreserved ב 10% dimethyl sulfoxide.
היתרון של קווי תאים ראשוניים הוא שהתאים זהים גנטית לתאי התורם. זה אידיאלי, כמו מודל in vitro צריך לחקות את רקמת in vivo ככל האפשר. החיסרון של קווי תאים ראשוניים הוא שיש להם מספר מוגבל של חלוקות תאים או מעברים6. מספר התאים המוגבל הזמין מגביל את מספר הניסויים שניתן לבצע בתרבית ראשונית אחת, ומייקר את עלות הניסויים.
קווי תאים אימורטליים שימשו גם במודלים של רעילות תרביות תאים. עם זאת, בניגוד לקו התאים הראשוני המתקבל מרקמת in vivo, קו התאים האימורטלי השתנה גנטית. תאים אימורטליים נוצרים על ידי שילוב גנים של וירוס בדנ"א של תאים ראשוניים 6,7,8. תאים עם שילוב מוצלח של גנים נגיפיים נבחרים לקו התאים האימורטלי. היתרון של אימורטליזציה הוא שהיא מאפשרת התפשטות מהירה ללא הגבלת זמן, ומספקת מספר בלתי מוגבל של תאים לביצוע ניסויים מרובים באמצעות אותו קו תאים. זה מאפשר עקביות בין ניסויים ומפחית את העלות.
בנוסף לשינויים בגנים שהגבילו את התפשטות התאים, שינויים בביטוי גנים בעלי פונקציונליות קריטית יכולים להתרחש גם9. לכן, החיסרון בשימוש בתאים אימורטליים הוא שהם עשויים כבר לא לייצג את תאי in vivo המקוריים מבחינת התגובה שלהם לגירויים חיצוניים שונים10. ההשוואות כללו התבוננות בהשפעות הרעילות של כימיקלים על קרטוציטים ראשוניים ואימורטליים של הקרנית האנושית11, כמו גם HCECs אימורטליים ותאים ראשוניים של אפיתל קרנית ארנבת12. ההשוואה בין ההשפעות של רעלים על קרטוציטים אנושיים ראשוניים לבין קרטוציטים אלמותיים לא הראתה הבדלים משמעותיים11. באמצעות השיטות המפורטות במאמר זה, תיקבע היעילות של בדיקות אלה להערכת הרעילות של קרינת UV ורעלני עיניים על pHCECs ו- iHCECs.
נבחרו שלושה רעלנים עיניים הנפוצים בבדיקות מבחנה: BAK, H 2 O2ו- SDS. BAK הוא חומר משמר קטיוני הנפוץ בתמיסות עיניים 13,14, H 2 O2משמש בדרך כלל לחיטוי עדשות מגע 15, ו-SDS הוא חומר פעילי שטח אניוני המצוי בדטרגנטים ושמפו 14. בדומה לרעלני עיניים, קרינת UV יכולה גם לגרום נזק משמעותי ל- HCECs3. בנוסף, חשיפת יתר לקרינת UV עלולה לגרום למצב עיני המכונה פוטוקרטיטיס המאופיין בתסמינים של קריעה, רגישות לאור ותחושת גרגריות16.
יש מספר בלתי מוגבל של תרביות תאים ראשוניות שניתן להשתמש בהן וקווי תאים אימורטליים שונים שפותחו. לכן, נערך מחקר כדי להשוות HCEC ראשוניים לקו HCEC אימורטלי כדי לקבוע דמיון והבדלים בין מודלים המשלבים סוגים אלה של תאים.
מחקר זה השתמש במיקרוסקופ כדי להעריך הבדלים אפשריים בין pHCECs ו- iHCECs על התגובה הפיזיולוגית של התא לקרינת UV ורעלנים. כמו כן נבדקו ההשפעות של קרינת UV וכימיקלים על הפעילות המטבולית של התא ושחרור ציטוקינים דלקתיים עבור שני קווי התא. החשיבות של קביעת ההבדלים בין שני קווי התאים היא להבין את השימוש המיטבי בקווי תאים אלה להערכה: 1) ההשפעה של קרינת UV על תאים, 2) ההשפעות של רעלים על תאים, 3) השינויים הנובעים מכך בחילוף החומרים, בכדאיות התא ובשחרור ציטוקינים בתאים למחקרים עתידיים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>75 cm2 Vented Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354485</td>
			<td>This is the BioCoat brand, collagen-coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>costar</td>
			<td>3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alamarBlue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>dal 1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin Staining buffer solution</td>
			<td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V</td>
			<td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system</td>
			<td>Carl Zeiss Inc., Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 48 Well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354505</td>
			<td>This is the BioCoat brand, collagen-coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>CYT5MPV</td>
			<td>Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hycone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass bottom coverslips</td>
			<td>MatTek Corporation, Ashland, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Corneal Epithelial Cells</td>
			<td>University of Ottawa</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements:</td>
			<td>Millipore, Billerica, MA, USA</td>
			<td>SCMC001</td>
			<td>Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 &#956;M Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 &#956;g/mL rh Insulin, 5 &#956;g/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Dead calcien and ethidium homodimer</td>
			<td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument</td>
			<td>Rockville, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay</td>
			<td>Rockville, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Corneal Epithelial Cells</td>
			<td>Millipore, Billerica, MA, USA</td>
			<td>SCCE016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax fluorescence multi-well plate reader</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell disassociation solution)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12605036</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining the toxicity of uv radiation and chemicals on primary and immortalized human corneal epithelial cells

מאמר זה מתאר את השיטות למדידת הרעילות של קרינה אולטרה סגולה (UV) ורעלנים עיניים על תרביות תאי אפיתל ראשוניים (pHCEC) ומונצחים (iHCEC). התאים נחשפו לקרינת UV ולמינונים רעילים של בנזלקוניום כלוריד (BAK), מי חמצן (H 2 O2) וסודיום דודציל סולפט (SDS). הפעילות המטבולית נמדדה באמצעות בדיקה מטבולית. שחרור ציטוקינים דלקתיים נמדד באמצעות אינטרלוקין רב-תכליתי (IL)-1β, IL-6, IL-8 ובדיקת גורם נמק גידולי אלפא (TNF-α), והתאים הוערכו לכדאיות באמצעות צבעים פלואורסצנטיים.
ההשפעות המזיקות של UV על פעילות מטבולית של תאים ושחרור ציטוקינים התרחשו ב -5 דקות של חשיפה לקרינת UV עבור iHCEC ו -20 דקות עבור pHCEC. ירידות באחוזים דומים בפעילות המטבולית של iHCEC ו-pHCEC התרחשו לאחר חשיפה ל-BAK, H 2O2 או SDS, והשינויים המשמעותיים ביותר בשחרור ציטוקינים התרחשו עבור IL-6 ו-IL-8. מיקרוסקופיה של תאים שנחשפו ל-iHCEC ו-pHCEC שנחשפו ל-BAK עם כתמים פלואורסצנטיים הראתה מוות תאי בחשיפה של 0.005% ל-BAK, אם כי מידת צביעת האתידיום הייתה גדולה יותר ב-iHCEC מאשר ב-pHCECs. באמצעות שיטות מרובות להערכת השפעות רעילות באמצעות מיקרוסקופיה, הערכות של פעילות מטבולית וייצור ציטוקינים, ניתן לקבוע את הרעילות של קרינת UV ורעלים כימיים הן עבור קווי תאים ראשוניים והן עבור קווי תאים אימורטליים.

גודל תא HCECs הראשוניים והמונצחים הודגמו באמצעות שלושה צבעים פלואורסצנטיים, המשקפים שלושה שלבים שונים של קיום התא. תאים חיים הם ירוקים (calcein-AM), תאים מתים הם אדומים (ethidium homodimer-1), ותאים אפופטוטיים הם צהובים (annexin V-מחשב מותאם צבע עבור הדמיה טובה יותר של אות פלואורסצנטי). תאים חיים מכיל?...

Watch this Scientific Journal Video about Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells at JoVE.com

Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells

מאמר זה מתאר את ההליכים המשמשים להערכת הרעילות של קרינת UV ורעלים כימיים בקו תאים ראשוני ואימורטלי.

קביעת הרעילות של קרינת UV וכימיקלים על תאי אפיתל ראשוניים ואימורטליים של הקרנית האנושית

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) ...

שיטה זו יכולה לשמש כדי להעריך במבחנה את הרעילות של ניסוחים חדשים של מוצרי עיניים. על ידי זיקוק ריכוזי כימיקלים ופורמולציות מוצרים באמצעות תאי עין במבחנה, ניתן למזער את השימוש בבעלי חיים להערכת בטיחות מוצרים חדשים. בדיקות In vitro מעריכות נקודות קצה רעילות שלא ניתן להעריך in vivo, כגון קביעת ההשפעה של כימיקל על תפקוד המיטוכונדריה, שלמות קרום התא ופעילות האנזים.הערכת רעילות תאים במבחנה היא המפתח להבנת מנגנונים פוטנציאליים של רעילות. זה חיוני לקביעת מינון נסבל מקסימלי של כימיקלים טיפוליים בעין. מי שידגים את ההליך יהיה ניג'אני נאגארודקומרן, חוקר ממעבדת ג'ונס.התחילו בהנחת pHCEC ו-iHCECs על צלחות פטרי מצופות קולגן עם כיסוי תחתון מזכוכית בריכוז של 1 x 10 עד ה-5 עם מיליליטר אחד של אפיתל עיני אנושי בינוני, או HOEM. לגדל pHCECs ו- iHCECs קבוצה אחת של תרביות במשך 24 שעות וקבוצה נוספת במשך 48 שעות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר הדגירה, מכתימים את התאים בתמיסת חיץ צביעה של 500 מיקרוליטר המכילה 4 קלצאין מיקרומולרי, 8 מיקרומולרי אתידיום הומודימר 1 ואנקטין 5 למשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.לאחר צביעת התאים, התאימו את מיקרוסקופ סריקת הלייזר הקונפוקלי כדי ללכוד את אורכי גל העירור והפליטה, כמתואר בכתב היד של הטקסט. השג את התמונות הדו-ממדיות והתלת ממדיות בהתאם להוראות בכתב היד. זרעו את התאים בגודל 5X10 עד 4 למיליליטר של HOEM בכל באר של צלחת תרבית מצופה קולגן 1 של 24 בארות ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 3 שעות.לאחר הדגירה, להפחית את נפח המדיום בבארות ל 300 מיקרוליטר. לאחר מכן, חשפו את התאים לקרינת UVA ב-6.48 וואט למ"ר, וקרינת UVB ב-1.82 וואט למ"ר ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5 ו-20 דקות בניסויים נפרדים. לאחר קרינת UV, יש להוסיף 200 מיקרוליטר של HOEM טרי לכל באר ולדגור במשך 20 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.למחרת, לאסוף את supernatant התא בכל באר ולהעביר אותו לתוך צינורות פוליפרופילן סטרילי 2 מיליליטר. מקפיאים את הסופרנאטנט במינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי לקבוע את רמות הציטוקינים המשתחררים על-ידי pHCECs ו-iHCECs לאחר חשיפה לקרינת על-סגול, השתמשו בבדיקת ציטוקינים מרובים ועקבו אחר הוראות הערכה כדי לכמת אינטרלוקין 6, אינטרלוקין 8, אינטרלוקין-1 בטא ו-TNF-אלפא.הכן מגיב בדיקה מטבולית 10% ב- DMEM ו- F12. החלף את מדיום התרבית בכל באר במיליליטר אחד של תמיסת הבדיקה המטבולית 10% ודגר ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 4 שעות. מדוד את הפלואורסצנטיות של כל תמיסה באמצעות קורא לוחות פלואורסצנטי באורכי גל עירור של 530 ננומטר ופליטה של 590 ננומטר.תאי זרעים בגודל 5X10 עד הרביעי למיליליטר HOEM בכל באר של צלחת תרבית מצופה קולגן 1 של 24 בארות. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 3 שעות. לאחר הדגירה, להסיר את המדיום ולחשוף את התאים 1 מיליליטר של רעלים כימיים, הכוללים 0.001% benzalkonium כלוריד, או BAK, 0.01% מי חמצן, ו 0.0025% נתרן דודציל סולפט ב PBS במשך 5 ו 15 דקות.לאחר חשיפה לרעלים הכימיים, הסר את הרעלים מהבארות, שטוף עם 1 מיליליטר של PBS, ולהוסיף 1 מיליליטר של HOEM לכל באר. לאחר 20 שעות של דגירה, בצע בדיקה מטבולית על ידי החלפת המדיום עם 1 מיליליטר של תמיסת בדיקה מטבולית 10% ודגרה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך 4 שעות. מדוד את הפלואורסצנטיות של כל תמיסה באמצעות קורא לוחות פלואורסצנטי בעירור של 530 ננומטר, ובאורכי גל של פליטה של 590 ננומטר.מעבירים את הסופרנאטנטים התאיים מהבארות לאחר הדגירה של 20 שעות לצינורות פוליפרופילן סטריליים נפרדים של 2 מיליליטר ומקפיאים אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס. השתמש באותה פלטפורמת מולטיפלקס המשמשת להערכת הציטוקינים מהתאים שטופלו ב- UV בהתאם להוראות הערכה לכימות אינטרלוקין 6, אינטרלוקין 8, אינטרלוקין-1 בטא ו- TNF-אלפא. זרעו תאים בגודל 1X10 עד 5 למיליליטר של HOEM בכל באר של צלחת תרבית מצופה קולגן 1 של 24 בארות ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 24 שעות.לאחר הדגירה, הסר את המדיום וחשף את התאים למיליליטר אחד של רעלים כימיים, כולל 0.001% BAK, 0.005% BAK ו- 0.01% BAK ב- PBS למשך 5 דקות. לאחר החשיפה, להסיר את הרעלים הכימיים, לשטוף את הבארות עם 1 מיליליטר של PBS ולהוסיף 1 מיליליטר של HOEM לכל באר. לאחר 20 שעות דגירה, יש לצבוע את התאים ב-500 מיקרוליטר של תמיסת חיץ מכתימה של אנקסין המכילה קלצאין, אתידיום הומדימר ואנקטין 5 למשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.כוונן את המיקרוסקופ למדידת עוצמות באורכי גל עירור ופליטה של 630 ו-675 ננומטר עבור נספחים 5, 495 ו-515 ננומטר עבור calcein AM, ו-528 ו-617 ננומטר עבור צביעת אתידיום 1. לאחר מכן לרכוש תמונות של התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ה- iHCECs נמצאו כתאים קטנים בטווח של 10 עד 20 מיקרומטר וה- pHCECs היו בטווח של 20 עד 50 מיקרומטר לאחר 24 שעות של גידול.הבדלים דומים בטווח הגדלים נצפו עבור iHCECs ו- pHCECs לאחר 48 שעות של צמיחה. בהשוואה לתאים שאינם חשופים לקרינת UV, הפעילות המטבולית של pHCECs מוקרנים הופחתה באופן משמעותי לאחר 20 דקות של חשיפה. עבור iHCECs, הפעילות המטבולית ירדה עבור תאים שהוקרנו הן 5 ו 20 דקות.לכן, לקח זמן חשיפה ארוך יותר כדי להפחית את הפעילות המטבולית של pHCECs מאשר iHCECs. שחרור הציטוקינים המרבי על ידי iHCECs היה 5 דקות של חשיפה לקרינת UV. שחרור הציטוקינים המרבי עבור pHCECs התרחש לאחר 20 דקות של חשיפה לקרינת UV.במונחים של הכמויות הכוללות של ציטוקינים דלקתיים ששוחררו, pHCECs שחררו הרבה יותר אינטרלוקין-1 בטא, אינטרלוקין 8 ו-TNF-אלפא מאשר iHCECs, ואילו iHCECs שחררו יותר אינטרלוקין 6. גם pHCECs וגם iHCECs הראו שינוי בשחרור אינטרלוקין 6 לאחר חשיפה לכל שלושת הכימיקלים. BAK גרם לירידה בשחרור אינטרלוקין 6 בהשוואה לביקורת עבור HCEC ראשוניים ומונצחים כאחד.מי חמצן גרמו לעלייה בשחרור אינטרלוקין 6 מ- iHCECs, ולירידה בשחרור מ- pHCECs. גם pHCEC וגם iHCECs ניזוקו באופן משמעותי ב-0.005% וב-0.1% של BAK. לאחר ביצוע הערכות חוץ גופיות של רעילות תאי העין, ניתן לבצע מודלים נוספים של רעילות עינית בבעלי חיים כדי לקבוע את ההשפעה של מוצר עיני על עצבי הקרנית או על מערכת החיסון העינית.טכניקות אלה חיוניות לקביעת המנגנונים של רעילות כימיקלים ופורמולציות מוצרים על העין ויסייעו למזער את השימוש בבעלי חיים לניסויים בפיתוח מוצרים.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

ראשי תאים אנושיים אפיתל הסימפונות גדלה מ Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

כימות γH2AX מוקדים בתגובה קרינה Ionising

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX following Ionizing Radiation

הערכת התפלגות מרחבית של γH2AX הבאים בקרינה מייננת

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

ניתוח פונקציה של GTPases קטנים על ידי Microinjection של פלסמידים לתוך תאים אפיתל מקוטב

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo התרבות של האדם תאים ראשוניים החצוצרה אפיתל

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

אינדוקציה וניתוח של אפיתל לmesenchymal מעבר

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Culturing של אדם תאי אפיתל באף בממשק האוויר הנוזלי

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

כימות של דביקות תא האנדותל<em&gt; במבחנה</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

ניתוח של SCAP<em&gt; N</em&gt; -glycosylation וסחר בבני אדם תאים

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of ...

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

מודל אדם רב-תאי המורכב מתאי אפיתל ותאי מערכת החיסון העיקריים להערכת סיכונים

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...