Name: determining the toxicity of uv radiation and chemicals on primary and immortalized human corneal epithelial cells
Uploaded: 2021-07-22T13:00:00
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लेखकों को इस काम के लिए कोई धन नहीं मिला।

1. पीएचईसी और आईएचसीईसी की संस्कृति
<ol><li>निम्नलिखित पूरक के साथ मानव ओकुलर एपिथेलियल माध्यम (एचओईएम) में पीएचईसी और आईएचसीईसी विकसित करें: 6 एमएम एल-ग्लूटामाइन, 0.002% सेल मीडिया पूरक ओ (सामग्री की तालिका), 1.0 μM ...

<ol>
	<li>McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+human+corneal+epithelial+cell+line+for+screening+the+safety+of+contact+lens+care+solutions+in+vitro.">Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro.</a> Eye &amp; Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).</li><li>Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+effects+of+ophthalmic+solutions+on+human+corneal+epithelial+cells+using+fluorescent+dyes.">Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).</li><li>Youn, H. Y., McCanna, D. J., Sivak, J. G., Jones, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+ultraviolet-induced+damage+in+human+corneal,+lens,+and+retinal+pigment+epithelial+cells.">In vitro ultraviolet-induced damage in human corneal, lens, and retinal pigment epithelial cells.</a> Molecular Vision. 17, 237-246 (2011).</li><li>Hakkarainen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+cytotoxic+effects+of+marketed+ophthalmic+formulations+on+human+corneal+epithelial+cells.">Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells.</a> International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).</li><li>Spurr, S. J., Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+corneal+epithelium+with+Dispase+II+or+EDTA.+Effects+on+the+basement+membrane+zone.">Isolation of corneal epithelium with Dispase II or EDTA. Effects on the basement membrane zone.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 26 (6), 818-827 (1985).</li><li>Kahn, C. R., Young, E., Lee, I. H., Rhim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+corneal+epithelial+primary+cultures+and+cell+lines+with+extended+life+span:+in+vitro+model+for+ocular+studies.">Human corneal epithelial primary cultures and cell lines with extended life span: in vitro model for ocular studies.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 34 (12), 3429-3441 (1993).</li><li>Araki-Sasaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+SV40-immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+its+characterization.">An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).</li><li>Griffith, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+human+corneal+equivalents+constructed+from+cell+lines.">Functional human corneal equivalents constructed from cell lines.</a> Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).</li><li>Toouli, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+mammary+epithelial+cells+immortalized+by+simian+virus+40+T-Antigen+or+by+the+telomerase+catalytic+subunit.">Comparison of human mammary epithelial cells immortalized by simian virus 40 T-Antigen or by the telomerase catalytic subunit.</a> Oncogene. 21 (1), 128-139 (2002).</li><li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines:+Valuable+tools+or+useless+artifacts.">Cell lines: Valuable tools or useless artifacts.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li><li>Zorn-Kruppa, M., Tykhonova, S., Belge, G., Diehl, H. A., Engelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+corneal+cell+cultures+in+cytotoxicity+testing.">Comparison of human corneal cell cultures in cytotoxicity testing.</a> Altex. 21 (3), 129-134 (2004).</li><li>Huhtala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+an+immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+rabbit+corneal+epithelial+cell+culture+in+cytotoxicity+testing.">Comparison of an immortalized human corneal epithelial cell line and rabbit corneal epithelial cell culture in cytotoxicity testing.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 18 (2), 163-175 (2002).</li><li>Pisella, P. J., Fillacier, K., Elena, P. P., Debbasch, C., Baudouin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+effects+of+preserved+and+unpreserved+formulations+of+timolol+on+the+ocular+surface+of+albino+rabbits.">Comparison of the effects of preserved and unpreserved formulations of timolol on the ocular surface of albino rabbits.</a> Ophthalmic Research. 32 (1), 3-8 (2000).</li><li>Youn, H. Y., Moran, K. L., Oriowo, O. M., Bols, N. C., Sivak, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactant+and+UV-B-induced+damage+of+the+cultured+bovine+lens.">Surfactant and UV-B-induced damage of the cultured bovine lens.</a> Toxicology in vitro. 18 (6), 841-852 (2004).</li><li>Hughes, R., Kilvington, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+hydrogen+peroxide+contact+lens+disinfection+systems+and+solutions+against+Acanthamoeba+polyphaga.">Comparison of hydrogen peroxide contact lens disinfection systems and solutions against Acanthamoeba polyphaga.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (7), 2038-2043 (2001).</li><li>Delic, N. C., Lyons, J. G., Di Girolamo, N., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damaging+effects+of+ultraviolet+radiation+on+the+cornea.">Damaging effects of ultraviolet radiation on the cornea.</a> Photochemistry and Photobiology. 93 (4), 920-929 (2017).</li><li>Ahuja, D., Saenz-Robles, M. T., Pipas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SV40+large+T+antigen+targets+multiple+cellular+pathways+to+elicit+cellular+transformation.">SV40 large T antigen targets multiple cellular pathways to elicit cellular transformation.</a> Oncogene. 24 (52), 7729-7745 (2005).</li><li>Tong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pin1+inhibits+PP2A-mediated+Rb+dephosphorylation+in+regulation+of+cell+cycle+and+S-phase+DNA+damage.">Pin1 inhibits PP2A-mediated Rb dephosphorylation in regulation of cell cycle and S-phase DNA damage.</a> Cell Death &amp; Disease. 6, 1640 (2015).</li><li>Muller, P. A., Vousden, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+mutations+in+cancer.">p53 mutations in cancer.</a> Nature Cell Biology. 15 (1), 2-8 (2013).</li><li>Seshacharyulu, P., Pandey, P., Datta, K., Batra, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatase:+PP2A+structural+importance,+regulation+and+its+aberrant+expression+in+cancer.">Phosphatase: PP2A structural importance, regulation and its aberrant expression in cancer.</a> Cancer Letters. 335 (1), 9-18 (2013).</li><li>Yang, D., Okamura, H., Morimoto, H., Teramachi, J., Haneji, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+2A+Calpha+regulates+proliferation,+migration,+and+metastasis+of+osteosarcoma+cells.">Protein phosphatase 2A Calpha regulates proliferation, migration, and metastasis of osteosarcoma cells.</a> Laboratory nvestigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1050-1062 (2016).</li><li>Xie, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+and+inactivation+of+the+PP2A+complex+promotes+the+proliferation+and+angiogenesis+of+hemangioma+endothelial+cells+through+activating+AKT+and+ERK.">Disruption and inactivation of the PP2A complex promotes the proliferation and angiogenesis of hemangioma endothelial cells through activating AKT and ERK.</a> Oncotarget. 6 (28), 25660-25676 (2015).</li><li>Mallet, J. D., Rochette, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wavelength-dependent+ultraviolet+induction+of+cyclobutane+pyrimidine+dimers+in+the+human+cornea.">Wavelength-dependent ultraviolet induction of cyclobutane pyrimidine dimers in the human cornea.</a> Photochemical &amp; Photobiological Sciences. 12 (8), 1310-1318 (2013).</li><li>Cejkova, J., Cejka, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+oxidative+stress+in+corneal+diseases+and+injuries.">The role of oxidative stress in corneal diseases and injuries.</a> Histology and Histopathology. 30 (8), 893-900 (2015).</li><li>Wang, S. Q., Balagula, Y., Osterwalder, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoprotection:+a+review+of+the+current+and+future+technologies.">Photoprotection: a review of the current and future technologies.</a> Dermatologic Therapy. 23 (1), 31-47 (2010).</li><li>Svobodova, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+after+acute+exposure+of+mice+skin+to+physiological+doses+of+UVB+and+UVA+light.">DNA damage after acute exposure of mice skin to physiological doses of UVB and UVA light.</a> Archives of Dermatological Research. 304 (5), 407-412 (2012).</li><li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+irradiation+induces+the+production+of+multiple+cytokines+by+human+corneal+cells.">Ultraviolet irradiation induces the production of multiple cytokines by human corneal cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 38 (12), 2483-2491 (1997).</li><li>Kode, A., Yang, S. R., Rahman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+cigarette+smoke+on+oxidative+stress+and+proinflammatory+cytokine+release+in+primary+human+airway+epithelial+cells+and+in+a+variety+of+transformed+alveolar+epithelial+cells.">Differential effects of cigarette smoke on oxidative stress and proinflammatory cytokine release in primary human airway epithelial cells and in a variety of transformed alveolar epithelial cells.</a> Respiratory Research. 7, 132 (2006).</li><li>Epstein, S. P., Chen, D., Asbell, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+biomarkers+of+inflammation+in+response+to+benzalkonium+chloride+on+corneal+and+conjunctival+epithelial+cells.">Evaluation of biomarkers of inflammation in response to benzalkonium chloride on corneal and conjunctival epithelial cells.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 25 (5), 415-424 (2009).</li></ol>

दो प्रकार के एचसीईसी के उपयोग में संभावित अंतर का आकलन किया गया था। कोशिकाओं को कोशिकाओं की समान सांद्रता पर एक ही माध्यम (एचओईएम) में रखा गया था और फिर यूवी विकिरण और तीन ओकुलर विषाक्त पदार्थों की छोटी ?...

इन विट्रो टॉक्सिकोलॉजी अध्ययन रसायनों और अन्य एजेंटों के विषाक्त प्रभावों की भविष्यवाणी करने के लिए किया जाता है जो कोशिकाओं को नुकसान पहुंचा सकते हैं। कॉर्निया के लिए विषाक्तता के आकलन में, मानव कॉर्नियल उपकला कोशिकाओं (एचसीईसी) का उपयोग इन प्रभावों के मूल्यांकन के लिए मॉडल में किया गया है 1,2,3,4। ये मॉडल आमतौर पर शारीरिक प्रभावों का मूल्यांकन करते हैं जैसे कि सेल की चयापचय गतिविधि, सेल प्रसार, और अन्य सेल कार्यों जैसे कि भड़काऊ साइटोकिन्स का उत्पादन और रिलीज। इन विष विज्ञान अध्ययनों के लिए, एचसीईसी 2,3 पर रसायनों और यूवी विकिरण के हानिकारक प्रभावों का आकलन करने के लिए विभिन्न स्रोतों से कोशिकाओं का चयन किया गया है। पीएचईसी लाइनें उन कंपनियों से उपलब्ध हैं जो वयस्कों के दाता ऊतकों से इन कोशिकाओं को प्रदान करती हैं। प्राथमिक कोशिकाओं को डिस्पेस के साथ इलाज किया जा सकता है और धीरे से कल्चर5 के लिए कॉर्निया से स्क्रैप किया जा सकता है। कोशिकाओं को तब वायरस और संदूषण के लिए परीक्षण किया जाता है और फिर 10% डाइमिथाइल सल्फोक्साइड में क्रायोसंरक्षित भेज दिया जाता है।
प्राथमिक सेल लाइनों का लाभ यह है कि कोशिकाएं आनुवंशिक रूप से दाता की कोशिकाओं के समान होती हैं। यह आदर्श है, क्योंकि एक इन विट्रो मॉडल को जितना संभव हो सके विवो ऊतक की नकल करनी चाहिए। प्राथमिक सेल लाइनों का नुकसान यह है कि उनके पास सीमित संख्या में कोशिका विभाजन या मार्ग6 हैं। उपलब्ध कोशिकाओं की सीमित संख्या उन प्रयोगों की संख्या को प्रतिबंधित करती है जिन्हें एकल प्राथमिक संस्कृति के साथ आयोजित किया जा सकता है, जिससे प्रयोगों की लागत बढ़ जाती है।
अमर सेल लाइनों का उपयोग सेल कल्चर विषाक्तता मॉडल में भी किया गया है। हालांकि, विवो ऊतक से प्राप्त प्राथमिक सेल लाइन के विपरीत, अमर सेल लाइन को आनुवंशिक रूप से बदल दिया गया है। अमर कोशिकाओं को प्राथमिक कोशिकाओं 6,7,8 के डीएनए में वायरस के जीन को शामिल करके बनाया जाता है। सफल वायरल जीन निगमन वाली कोशिकाओं को अमर सेल लाइन के लिए चुना जाता है। अमरीकरण का लाभ यह है कि यह अनिश्चित तेजी से प्रसार की अनुमति देता है, एक ही सेल लाइन का उपयोग करके कई प्रयोगों को करने के लिए असीमित संख्या में कोशिकाओं को प्रदान करता है। यह प्रयोगों के बीच स्थिरता की अनुमति देता है और लागत को कम करता है।
कोशिका प्रसार को सीमित करने वाले जीन में परिवर्तन के अलावा, महत्वपूर्ण कार्यक्षमता के जीन की अभिव्यक्ति में परिवर्तनभी हो सकता है। इसलिए, अमर कोशिकाओं का उपयोग करने का नुकसान यह है कि वे अब विभिन्न बाहरी उत्तेजनाओं के प्रति उनकी प्रतिक्रिया के संदर्भ में विवो कोशिकाओं में मूल का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकतेहैं। तुलना में प्राथमिक और अमर मानव कॉर्नियल केराटोसाइट्स11, साथ ही अमर एचसीईसी और खरगोश कॉर्नियल उपकला प्राथमिक कोशिकाओं12 पर रसायनों के विषाक्त प्रभावों को देखना शामिल है। प्राथमिक मानव केराटोसाइट्स और अमर केराटोसाइट्स पर विषाक्त पदार्थों के प्रभावों के बीच तुलना ने कोईमहत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया। इस लेख में विस्तृत तरीकों का उपयोग करते हुए, पीएचईसी और आईएचसीईसी पर यूवी विकिरण और ओकुलर विषाक्त पदार्थों की विषाक्तता का आकलन करने के लिए इन परखों की प्रभावशीलता निर्धारित की जाएगी।
आमतौर पर इन विट्रो परख में उपयोग किए जाने वाले तीन ओकुलर विषाक्त पदार्थों का चयन किया गया था: बीएके, एच 2 ओ2, और एसडीएस। बीएके आमतौर पर नेत्र समाधान 13,14 में उपयोग किया जाने वाला एक धनिक संरक्षक है,एच 2 ओ2 का उपयोग आमतौर पर संपर्क लेंस 15 को कीटाणुरहित करने के लिए किया जाता है, और एसडीएस एक आयनिक सर्फेक्टेंट है जो डिटर्जेंट और शैंपू 14 में पाया जाता है। ओकुलर विषाक्त पदार्थों के समान, यूवी विकिरण भी एचसीईसी3 को महत्वपूर्ण नुकसान पहुंचा सकता है। इसके अलावा, यूवी के लिए ओवरएक्सपोजर एक ओकुलर स्थिति पैदा कर सकता है जिसे फोटोकेराटाइटिस के रूप में जाना जाता है जो फाड़ने, प्रकाश संवेदनशीलता औरकिरकिरापन की भावना के लक्षणों की विशेषता है।
प्राथमिक सेल संस्कृतियों की एक असीमित संख्या है जिसका उपयोग किया जा सकता है और विभिन्न अमर सेल लाइनें विकसित की गई हैं। इसलिए, इन प्रकार की कोशिकाओं को शामिल करने वाले मॉडलों के बीच समानता और अंतर निर्धारित करने के लिए प्राथमिक एचसीईसी की तुलना एक अमर एचसीईसी लाइन से करने के लिए एक जांच की गई थी।
इस जांच ने यूवी और विषाक्त पदार्थों के लिए सेल शारीरिक प्रतिक्रिया पर पीएचईसी और आईएचसीईसी के बीच संभावित अंतर का आकलन करने के लिए माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया। सेल चयापचय गतिविधि और दो सेल लाइनों के लिए भड़काऊ साइटोकिन रिलीज पर यूवी विकिरण और रसायनों के प्रभावों का भी मूल्यांकन किया गया था। दो सेल लाइनों के बीच अंतर निर्धारित करने का महत्व मूल्यांकन के लिए इन सेल लाइनों के इष्टतम उपयोग को समझना है: 1) कोशिकाओं पर यूवी विकिरण का प्रभाव, 2) कोशिकाओं पर विषाक्त पदार्थों का प्रभाव, और 3) भविष्य के अध्ययनों के लिए चयापचय, सेल व्यवहार्यता और सेल साइटोकिन रिलीज में परिणामी परिवर्तन।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>75 cm2 Vented Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354485</td>
			<td>This is the BioCoat brand, collagen-coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>costar</td>
			<td>3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alamarBlue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>dal 1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin Staining buffer solution</td>
			<td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V</td>
			<td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system</td>
			<td>Carl Zeiss Inc., Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 48 Well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354505</td>
			<td>This is the BioCoat brand, collagen-coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>CYT5MPV</td>
			<td>Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hycone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass bottom coverslips</td>
			<td>MatTek Corporation, Ashland, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Corneal Epithelial Cells</td>
			<td>University of Ottawa</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements:</td>
			<td>Millipore, Billerica, MA, USA</td>
			<td>SCMC001</td>
			<td>Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 &#956;M Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 &#956;g/mL rh Insulin, 5 &#956;g/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Dead calcien and ethidium homodimer</td>
			<td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument</td>
			<td>Rockville, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay</td>
			<td>Rockville, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Corneal Epithelial Cells</td>
			<td>Millipore, Billerica, MA, USA</td>
			<td>SCCE016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax fluorescence multi-well plate reader</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell disassociation solution)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12605036</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining the toxicity of uv radiation and chemicals on primary and immortalized human corneal epithelial cells

यह लेख प्राथमिक (पीएचसीईसी) और अमर (आईएचसीईसी) मानव कॉर्नियल उपकला कोशिका संस्कृतियों पर पराबैंगनी (यूवी) विकिरण और ओकुलर विषाक्त पदार्थों की विषाक्तता को मापने के तरीकों का वर्णन करता है। कोशिकाओं को यूवी विकिरण और बेंजालकोनियम क्लोराइड (बीएके), हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच 2 ओ2),और सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) की विषाक्त खुराक के संपर्क में लाया गया था। चयापचय गतिविधि को चयापचय परख का उपयोग करके मापा गया था। भड़काऊ साइटोकिन्स की रिहाई को मल्टी-प्लेक्स इंटरल्यूकिन (आईएल)-13, आईएल -6, आईएल -8, और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-अल्फा (टीएनएफ -α) परख का उपयोग करके मापा गया था, और फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करके व्यवहार्यता के लिए कोशिकाओं का मूल्यांकन किया गया था।
सेल चयापचय गतिविधि और साइटोकिन रिलीज पर यूवी के हानिकारक प्रभाव आईएचसीईसी के लिए यूवी एक्सपोजर के 5 मिनट और पीएचसीईसी के लिए 20 मिनट पर हुए। आईएचसीईसी और पीएचसीईसी की चयापचय गतिविधि में समान प्रतिशत गिरावट बीएके, एच 2 ओ2, या एसडीएस के संपर्क में आने के बाद हुई, और आईएल -6 और आईएल -8 के लिए साइटोकिन रिलीज में सबसे महत्वपूर्ण परिवर्तन हुए। फ्लोरोसेंटली सना हुआ आईएचसीईसी और पीएचईसी बीएके-उजागर कोशिकाओं की माइक्रोस्कोपी ने 0.005% बीएके एक्सपोजर पर कोशिका मृत्यु दिखाई, हालांकि पीएचईसी की तुलना में आईएचसीईसी में एथिडियम धुंधलाहोने की डिग्री अधिक थी। माइक्रोस्कोपी, चयापचय गतिविधि के आकलन और साइटोकिन उत्पादन का उपयोग करके विषाक्त प्रभावों का आकलन करने के कई तरीकों का उपयोग करते हुए, यूवी विकिरण और रासायनिक विषाक्त पदार्थों की विषाक्तता को प्राथमिक और अमर सेल लाइनों दोनों के लिए निर्धारित किया जा सकता है।

सेल का आकार प्राथमिक और अमर एचसीईसी को तीन फ्लोरोसेंट रंगों के साथ देखा गया था, जो सेल व्यवहार्यता के तीन अलग-अलग चरणों को दर्शाते हैं। जीवित कोशिकाएं हरी (कैल्सीन-एएम) होती हैं, मृत कोशिकाएं लाल ...

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Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells

यह लेख प्राथमिक और अमर सेल लाइन पर यूवी विकिरण और रासायनिक विषाक्त पदार्थों की विषाक्तता का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग की जाने वाली प्रक्रियाओं का वर्णन करता है।

प्राथमिक और अमर मानव कॉर्नियल उपकला कोशिकाओं पर यूवी विकिरण और रसायनों की विषाक्तता का निर्धारण

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) ...

इस विधि का उपयोग इन विट्रो में नए नेत्र उत्पाद योगों की विषाक्तता का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। विट्रो में ओकुलर कोशिकाओं का उपयोग करके रसायनों और उत्पाद योगों की सांद्रता को परिष्कृत करके, नए उत्पाद सुरक्षा का आकलन करने के लिए जानवरों के उपयोग को कम किया जा सकता है। इन विट्रो परख विषाक्तता समापन बिंदुओं का मूल्यांकन करते हैं जिन्हें विवो में मूल्यांकन नहीं किया जा सकता है, जैसे कि माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन, सेल झिल्ली अखंडता और एंजाइम गतिविधि पर एक रसायन के प्रभाव का निर्धारण करना।विट्रो में सेल विषाक्तता का मूल्यांकन विषाक्तता के संभावित तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। यह आंख में चिकित्सीय रसायनों की अधिकतम सहनीय खुराक स्थापित करने के लिए आवश्यक है। प्रक्रिया का प्रदर्शन जोन्स प्रयोगशाला के एक शोधकर्ता निजानी नागरुदकुमारन करेंगे।कोलेजन लेपित पेट्री व्यंजनों पर पीएचसीईसी और आईएचसीईसी दोनों को बैठने से शुरू करें, जिसमें ग्लास बॉटम कवर स्लिप 1 x 10 से 5 वें तक 1 मिलीलीटर मानव ओकुलर एपिथेलियम माध्यम, या एचओईएम की एकाग्रता पर होता है। पीएचसीईसी और आईएचसीईसी 1 सेट संस्कृतियों को 24 घंटे के लिए विकसित करें और दूसरा सेट 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 48 घंटे के लिए विकसित करें। इनक्यूबेशन के बाद, कोशिकाओं को 500 माइक्रोलीटर एनेक्सीन स्टेनिंग बफर घोल के साथ दाग दें जिसमें 4 माइक्रोमोलर कैल्सीन, 8 माइक्रोमोलर एथिडियम होमोडीमर 1, और एनेक्सिन 5 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए होता है।कोशिकाओं को धुंधला करने के बाद, उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य को पकड़ने के लिए कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप को समायोजित करें, जैसा कि पाठ पांडुलिपि में वर्णित है। पांडुलिपि में दिए गए निर्देशों का पालन करते हुए दो-आयामी और तीन-आयामी चित्र प्राप्त करें। कोशिकाओं को 24-अच्छी कोलेजन 1 लेपित कल्चर प्लेट के प्रत्येक कुएं में एचओईएम के 5 x 10 से 4 वें प्रति मिलीलीटर पर बीज दें और 3 घंटे के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।इनक्यूबेशन बाद, कुओं में माध्यम की मात्रा को 300 माइक्रोलीटर तक कम करें। इसके बाद, कोशिकाओं को अलग-अलग प्रयोगों में 5 और 20 मिनट के लिए 6.48 वाट प्रति वर्ग मीटर पर यूवीए विकिरण और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1.82 वाट प्रति वर्ग मीटर पर यूवीबी विकिरण को उजागर करें। यूवी विकिरण के बाद, प्रत्येक कुएं में 200 माइक्रोलीटर ताजा एचओईएम जोड़ें और 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।अगले दिन, प्रत्येक कुएं में सेल सुपरनैटेंट इकट्ठा करें और इसे बाँझ 2-मिलीलीटर पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूबों में स्थानांतरित करें। सतह पर तैरनेवाला को शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस नीचे रखें। यूवी एक्सपोजर के बाद पीएचईसी और आईएचसीईसी द्वारा जारी साइटोकिन स्तर निर्धारित करने के लिए, मल्टीप्लेक्स साइटोकिन परख का उपयोग करें और इंटरल्यूकिन 6, इंटरल्यूकिन 8, इंटरल्यूकिन -1 बीटा और टीएनएफ-अल्फा को मापने के लिए किट के निर्देशों का पालन करें।डीएमईएम और एफ 12 में 10% चयापचय परख अभिकर्मक तैयार करें। प्रत्येक कुएं में कल्चर माध्यम को 10% चयापचय परख समाधान के 1 मिलीलीटर के साथ बदलें और 4 घंटे के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। 530 नैनोमीटर उत्तेजना और 590 नैनोमीटर उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य पर फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर का उपयोग करके प्रत्येक समाधान की प्रतिदीप्ति को मापें।24-वेल कोलेजन 1 लेपित कल्चर प्लेट के प्रत्येक कुएं में एचओईएम के 5 x 10 से चौथे प्रति मिलीलीटर पर बीज कोशिकाएं। 3घंटे के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, माध्यम को हटा दें और कोशिकाओं को 1 मिलीलीटर रासायनिक विषाक्त पदार्थों के संपर्क में लाएं, जिसमें 5 और 15 मिनट के लिए पीबीएस में 0.001% बेंजलकोनियम क्लोराइड, या बीएके, 0.01% हाइड्रोजन पेरोक्साइड और 0.0025% सोडियम डोडेसिल सल्फेट शामिल हैं।रासायनिक विषाक्त पदार्थों के संपर्क में आने के बाद, कुओं से विषाक्त पदार्थों को हटा दें, 1 मिलीलीटर पीबीएस के साथ कुल्ला करें, और प्रत्येक कुएं में 1 मिलीलीटर एचओईएम जोड़ें। 20 घंटे के इनक्यूबेशन के बाद, माध्यम को 10% चयापचय परख समाधान के 1 मिलीलीटर के साथ बदलकर और 4 घंटे के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इंजेक्ट करके एक चयापचय परख करें। 530 नैनोमीटर उत्तेजना और 590 नैनोमीटर उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य पर फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर का उपयोग करके प्रत्येक समाधान की प्रतिदीप्ति को मापें।20 घंटे की इनक्यूबेशन के बाद कुओं से सेल सुपरनैटेंट को अलग-अलग बाँझ 2-मिलीलीटर पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूबों में स्थानांतरित करें और उन्हें माइनस 80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें। इंटरल्यूकिन 6, इंटरल्यूकिन 8, इंटरल्यूकिन -1 बीटा और टीएनएफ-अल्फा को मापने के लिए किट के निर्देशों के बाद यूवी-उपचारित कोशिकाओं से साइटोकिन्स का आकलन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले उसी मल्टीप्लेक्स प्लेटफॉर्म का उपयोग करें। 24-वेल कोलेजन 1 लेपित कल्चर प्लेट के प्रत्येक कुएं में एचओईएम के 1 x 10 से 5 वें प्रति मिलीलीटर पर बीज कोशिकाएं और 24 घंटे के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।इनक्यूबेशन के बाद, माध्यम को हटा दें और कोशिकाओं को 1 मिलीलीटर रासायनिक विषाक्त पदार्थों के संपर्क में लाएं, जिसमें 5 मिनट के लिए पीबीएस में 0.001% बीएके, 0.005% बीएके और 0.01% बीएके शामिल हैं। एक्सपोजर के बाद, रासायनिक विषाक्त पदार्थों को हटा दें, कुओं को 1 मिलीलीटर पीबीएस के साथ कुल्ला करें और प्रत्येक कुएं में 1 मिलीलीटर एचओईएम जोड़ें। 20 घंटे की इनक्यूबेशन के बाद, कोशिकाओं को 500 माइक्रोलीटर एनेक्सीन स्टेनिंग बफर घोल के साथ दाग दें जिसमें कैल्सीन, एथिडियम होमोडिमर और एनेक्सिन 5 शामिल हैं।एनेक्सीन 5 के लिए 630 और 675 नैनोमीटर, कैल्सीन एएम के लिए 495 और 515 नैनोमीटर और एथिडियम 1 धुंधला के लिए 528 और 617 नैनोमीटर की उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य पर तीव्रता को मापने के लिए माइक्रोस्कोप को समायोजित करें। फिर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कोशिकाओं की छवियां प्राप्त करें। आईएचसीईसी छोटी कोशिकाएं पाई गईं जो 10 से 20 माइक्रोमीटर तक होती हैं और पीएचसीईसी 24 घंटे के विकास के बाद 20 से 50 माइक्रोमीटर की सीमा में होती हैं।वृद्धि के 48 घंटों के बाद आईएचसीईसी और पीएचईसी के लिए आकार सीमा में समान अंतर देखा गया। गैर-यूवी उजागर कोशिकाओं की तुलना में, विकिरणित पीएचसीईसी की चयापचय गतिविधि 20 मिनट के जोखिम में काफी कम हो गई थी। आईएचसीईसी के लिए, 5 और 20 मिनट दोनों में विकिरणित कोशिकाओं के लिए चयापचय गतिविधि कम हो गई।इसलिए, आईएचसीईसी की तुलना में पीएचईसी की चयापचय गतिविधि को कम करने में अधिक समय लगा। आईएचसीईसी द्वारा अधिकतम साइटोकिन रिलीज यूवी एक्सपोजर के 5 मिनट पर था। पीएचईसी के लिए अधिकतम साइटोकिन रिलीज यूवी एक्सपोजर के 20 मिनट में हुआ।जारी भड़काऊ साइटोकिन्स की कुल मात्रा के संदर्भ में पीएचईसी ने आईएचसीईसी की तुलना में काफी अधिक इंटरल्यूकिन -1 बीटा, इंटरल्यूकिन 8 और टीएनएफ-अल्फा जारी किया, जबकि आईएचसीईसी ने अधिक इंटरल्यूकिन 6 जारी किया। पीएचईसी और आईएचसीईसी दोनों ने सभी तीन रसायनों के संपर्क में आने के बाद इंटरल्यूकिन 6 की रिहाई में बदलाव दिखाया। बीएके ने प्राथमिक और अमर एचसीईसी दोनों के लिए नियंत्रण की तुलना में इंटरल्यूकिन 6 की रिहाई में कमी का कारण बना।हाइड्रोजन पेरोक्साइड ने आईएचसीईसी से इंटरल्यूकिन 6 की रिहाई में वृद्धि और पीएचईसी से रिलीज में कमी का कारण बना। पीएचसीईसी और आईएचसीईसी दोनों को बीएके के 0.005% और 0.1% पर काफी नुकसान पहुंचा था। ओकुलर सेल विषाक्तता के इन विट्रो आकलन करने के बाद, कॉर्नियल नसों या ओकुलर प्रतिरक्षा प्रणाली पर ओकुलर उत्पाद के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए ओकुलर विषाक्तता के आगे पशु मॉडल किए जा सकते हैं।ये तकनीक ें आंखों पर रासायनिक और उत्पाद निर्माण विषाक्तता के तंत्र को निर्धारित करने के लिए आवश्यक हैं और उत्पाद विकास परीक्षण के लिए पशु उपयोग को कम करने में मदद करेंगी।

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

प्राथमिक मानव ब्रोन्कियल उपकला Explants से विकसित कोशिकाओं

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

ΓH2AX foci के Ionising विकिरण करने के लिए प्रत्युत्तर में मात्रा का ठहराव

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX following Ionizing Radiation

विकिरण के बाद γH2AX के स्थानिक वितरण का मूल्यांकन

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

प्लास्मिड के Microinjection द्वारा Polarized उपकला कोशिकाओं में छोटे GTPases के फंक्शन का विश्लेषण

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

पूर्व प्राथमिक मानव फैलोपियन ट्यूब उपकला कोशिकाओं के Vivo संस्कृति

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Mesenchymal संक्रमण के लिए प्रेरण और उपकला का विश्लेषण

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

एयर तरल इंटरफेस पर मानव नाक उपकला कोशिकाओं के संवर्धन

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Endothelial सेल चिपचिपाहट के quantitation<em&gt; इन विट्रो</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

SCAP का विश्लेषण<em&gt; एन</em&gt; -glycosylation और मानव कोशिकाओं में तस्करी

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of ...

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

मल्टीसेलुलर ह्यूमन अल्वेलर मॉडल एपिथेलियल कोशिकाओं और प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं से बना है जो हैज़र्ड असेसमेंट के लिए है

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...