Name: determining the toxicity of uv radiation and chemicals on primary and immortalized human corneal epithelial cells
Uploaded: 2021-07-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells at JoVE.com

Forfatterne fikk ingen støtte til dette arbeidet.

1. Kultur av pHCEC og iHCEC
<ol><li>Dyrk pHCECene og iHCECene i humant okulært epitelmedium (HOEM) med følgende kosttilskudd: 6 mM L-glutamin, 0,002% cellemedietilskudd O (materialfortegnelse), 1,0 μM adrenalin, 0,4% cellemedietilskudd P (materialfortegnelse), 5 μg / ml rh insulin, 5 μg / ml apo-transferrin og 100 ng / ml hydrokortisonhemisuccinat i kollagen-1-belagte kulturflasker (18 ml i en 75 cm2 kulturkolbe).</li>
	<li>Bytt medium i kolbene hver 2-3 dag ved å fjer...

<ol>
	<li>McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+human+corneal+epithelial+cell+line+for+screening+the+safety+of+contact+lens+care+solutions+in+vitro.">Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro.</a> Eye &amp; Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).</li><li>Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+effects+of+ophthalmic+solutions+on+human+corneal+epithelial+cells+using+fluorescent+dyes.">Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).</li><li>Youn, H. Y., McCanna, D. J., Sivak, J. G., Jones, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+ultraviolet-induced+damage+in+human+corneal,+lens,+and+retinal+pigment+epithelial+cells.">In vitro ultraviolet-induced damage in human corneal, lens, and retinal pigment epithelial cells.</a> Molecular Vision. 17, 237-246 (2011).</li><li>Hakkarainen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+cytotoxic+effects+of+marketed+ophthalmic+formulations+on+human+corneal+epithelial+cells.">Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells.</a> International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).</li><li>Spurr, S. J., Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+corneal+epithelium+with+Dispase+II+or+EDTA.+Effects+on+the+basement+membrane+zone.">Isolation of corneal epithelium with Dispase II or EDTA. Effects on the basement membrane zone.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 26 (6), 818-827 (1985).</li><li>Kahn, C. R., Young, E., Lee, I. H., Rhim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+corneal+epithelial+primary+cultures+and+cell+lines+with+extended+life+span:+in+vitro+model+for+ocular+studies.">Human corneal epithelial primary cultures and cell lines with extended life span: in vitro model for ocular studies.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 34 (12), 3429-3441 (1993).</li><li>Araki-Sasaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+SV40-immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+its+characterization.">An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).</li><li>Griffith, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+human+corneal+equivalents+constructed+from+cell+lines.">Functional human corneal equivalents constructed from cell lines.</a> Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).</li><li>Toouli, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+mammary+epithelial+cells+immortalized+by+simian+virus+40+T-Antigen+or+by+the+telomerase+catalytic+subunit.">Comparison of human mammary epithelial cells immortalized by simian virus 40 T-Antigen or by the telomerase catalytic subunit.</a> Oncogene. 21 (1), 128-139 (2002).</li><li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines:+Valuable+tools+or+useless+artifacts.">Cell lines: Valuable tools or useless artifacts.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li><li>Zorn-Kruppa, M., Tykhonova, S., Belge, G., Diehl, H. A., Engelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+corneal+cell+cultures+in+cytotoxicity+testing.">Comparison of human corneal cell cultures in cytotoxicity testing.</a> Altex. 21 (3), 129-134 (2004).</li><li>Huhtala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+an+immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+rabbit+corneal+epithelial+cell+culture+in+cytotoxicity+testing.">Comparison of an immortalized human corneal epithelial cell line and rabbit corneal epithelial cell culture in cytotoxicity testing.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 18 (2), 163-175 (2002).</li><li>Pisella, P. J., Fillacier, K., Elena, P. P., Debbasch, C., Baudouin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+effects+of+preserved+and+unpreserved+formulations+of+timolol+on+the+ocular+surface+of+albino+rabbits.">Comparison of the effects of preserved and unpreserved formulations of timolol on the ocular surface of albino rabbits.</a> Ophthalmic Research. 32 (1), 3-8 (2000).</li><li>Youn, H. Y., Moran, K. L., Oriowo, O. M., Bols, N. C., Sivak, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactant+and+UV-B-induced+damage+of+the+cultured+bovine+lens.">Surfactant and UV-B-induced damage of the cultured bovine lens.</a> Toxicology in vitro. 18 (6), 841-852 (2004).</li><li>Hughes, R., Kilvington, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+hydrogen+peroxide+contact+lens+disinfection+systems+and+solutions+against+Acanthamoeba+polyphaga.">Comparison of hydrogen peroxide contact lens disinfection systems and solutions against Acanthamoeba polyphaga.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (7), 2038-2043 (2001).</li><li>Delic, N. C., Lyons, J. G., Di Girolamo, N., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damaging+effects+of+ultraviolet+radiation+on+the+cornea.">Damaging effects of ultraviolet radiation on the cornea.</a> Photochemistry and Photobiology. 93 (4), 920-929 (2017).</li><li>Ahuja, D., Saenz-Robles, M. T., Pipas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SV40+large+T+antigen+targets+multiple+cellular+pathways+to+elicit+cellular+transformation.">SV40 large T antigen targets multiple cellular pathways to elicit cellular transformation.</a> Oncogene. 24 (52), 7729-7745 (2005).</li><li>Tong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pin1+inhibits+PP2A-mediated+Rb+dephosphorylation+in+regulation+of+cell+cycle+and+S-phase+DNA+damage.">Pin1 inhibits PP2A-mediated Rb dephosphorylation in regulation of cell cycle and S-phase DNA damage.</a> Cell Death &amp; Disease. 6, 1640 (2015).</li><li>Muller, P. A., Vousden, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+mutations+in+cancer.">p53 mutations in cancer.</a> Nature Cell Biology. 15 (1), 2-8 (2013).</li><li>Seshacharyulu, P., Pandey, P., Datta, K., Batra, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatase:+PP2A+structural+importance,+regulation+and+its+aberrant+expression+in+cancer.">Phosphatase: PP2A structural importance, regulation and its aberrant expression in cancer.</a> Cancer Letters. 335 (1), 9-18 (2013).</li><li>Yang, D., Okamura, H., Morimoto, H., Teramachi, J., Haneji, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+2A+Calpha+regulates+proliferation,+migration,+and+metastasis+of+osteosarcoma+cells.">Protein phosphatase 2A Calpha regulates proliferation, migration, and metastasis of osteosarcoma cells.</a> Laboratory nvestigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1050-1062 (2016).</li><li>Xie, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+and+inactivation+of+the+PP2A+complex+promotes+the+proliferation+and+angiogenesis+of+hemangioma+endothelial+cells+through+activating+AKT+and+ERK.">Disruption and inactivation of the PP2A complex promotes the proliferation and angiogenesis of hemangioma endothelial cells through activating AKT and ERK.</a> Oncotarget. 6 (28), 25660-25676 (2015).</li><li>Mallet, J. D., Rochette, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wavelength-dependent+ultraviolet+induction+of+cyclobutane+pyrimidine+dimers+in+the+human+cornea.">Wavelength-dependent ultraviolet induction of cyclobutane pyrimidine dimers in the human cornea.</a> Photochemical &amp; Photobiological Sciences. 12 (8), 1310-1318 (2013).</li><li>Cejkova, J., Cejka, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+oxidative+stress+in+corneal+diseases+and+injuries.">The role of oxidative stress in corneal diseases and injuries.</a> Histology and Histopathology. 30 (8), 893-900 (2015).</li><li>Wang, S. Q., Balagula, Y., Osterwalder, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoprotection:+a+review+of+the+current+and+future+technologies.">Photoprotection: a review of the current and future technologies.</a> Dermatologic Therapy. 23 (1), 31-47 (2010).</li><li>Svobodova, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+after+acute+exposure+of+mice+skin+to+physiological+doses+of+UVB+and+UVA+light.">DNA damage after acute exposure of mice skin to physiological doses of UVB and UVA light.</a> Archives of Dermatological Research. 304 (5), 407-412 (2012).</li><li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+irradiation+induces+the+production+of+multiple+cytokines+by+human+corneal+cells.">Ultraviolet irradiation induces the production of multiple cytokines by human corneal cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 38 (12), 2483-2491 (1997).</li><li>Kode, A., Yang, S. R., Rahman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+cigarette+smoke+on+oxidative+stress+and+proinflammatory+cytokine+release+in+primary+human+airway+epithelial+cells+and+in+a+variety+of+transformed+alveolar+epithelial+cells.">Differential effects of cigarette smoke on oxidative stress and proinflammatory cytokine release in primary human airway epithelial cells and in a variety of transformed alveolar epithelial cells.</a> Respiratory Research. 7, 132 (2006).</li><li>Epstein, S. P., Chen, D., Asbell, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+biomarkers+of+inflammation+in+response+to+benzalkonium+chloride+on+corneal+and+conjunctival+epithelial+cells.">Evaluation of biomarkers of inflammation in response to benzalkonium chloride on corneal and conjunctival epithelial cells.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 25 (5), 415-424 (2009).</li></ol>

Potensielle forskjeller i bruk av to typer HCEC ble vurdert. Celler ble plassert i samme medium (HOEM) ved identiske konsentrasjoner av celler og deretter utsatt for korte og lange perioder med UV-stråling og tre okulære toksiner. Doser av UV-stråling og kjemikalier ble valgt basert på deres fysiologiske effekter, som var skadelige nok for cellene til å produsere mellomliggende responser som kunne sammenlignes. Eksponeringstider på 5 og 20 minutter for UV-stråling og 5 og 15 minutter for de valgte dosene av BAK (0...

In vitro toksikologiske studier utføres for å forutsi toksiske effekter av kjemikalier og andre midler som kan forårsake skade på celler. I vurderingen av toksisitet for hornhinnen har humane hornhinneepitelceller (HCEC) blitt brukt i modeller for å evaluere disse effektene 1,2,3,4. Disse modellene evaluerer vanligvis fysiologiske effekter som endringer i cellens metabolske aktivitet, celleproliferasjon og andre cellefunksjoner som produksjon og frigjøring av inflammatoriske cytokiner. For disse toksikologiske studiene har celler fra forskjellige kilder blitt valgt for å vurdere de skadelige effektene av kjemikalier og UV-stråling på HCECs 2,3. pHCEC-linjer er tilgjengelige fra selskaper som gir disse cellene fra donorvev hos voksne. Primærceller kan behandles med dispase og skrapes forsiktig av hornhinnen for kultur5. Cellene blir deretter testet for virus og forurensning og deretter sendt kryopreservert i 10% dimetylsulfoksid.
Fordelen med primære cellelinjer er at cellene er genetisk identiske med cellene til donoren. Dette er ideelt, da en in vitro-modell skal etterligne in vivo-vevet så mye som mulig. Ulempen med primære cellelinjer er at de har et begrenset antall celledelinger eller passasjer6. Det begrensede antallet tilgjengelige celler begrenser antall eksperimenter som kan utføres med en enkelt primærkultur, noe som øker kostnadene ved forsøkene.
Immortaliserte cellelinjer har også blitt brukt i toksisitetsmodeller for cellekulturer. Imidlertid, i motsetning til den primære cellelinjen oppnådd fra in vivo-vev, har den immortaliserte cellelinjen blitt genetisk endret. Immortaliserte celler opprettes ved å inkorporere genene til et virus i DNA fra primære celler 6,7,8. Celler med vellykket viral geninkorporering er valgt for den immortaliserte cellelinjen. Fordelen med immortalisering er at den tillater ubestemt rask spredning, og gir et ubegrenset antall celler til å utføre flere eksperimenter ved hjelp av samme cellelinje. Dette muliggjør konsistens mellom eksperimenter og reduserer kostnadene.
I tillegg til endringer i genene som begrenset celleproliferasjonen, kunne detogså forekomme endringer i uttrykket av gener med kritisk funksjonalitet. Derfor er ulempen ved å bruke immortaliserte celler at de kanskje ikke lenger representerer originalen in vivo-celler når det gjelder deres respons på forskjellige eksterne stimuli10. Sammenligninger har involvert å observere toksiske effekter av kjemikalier på primære og udødeliggjorte humane hornhinnekeratocytter11, samt udødeliggjorte HCECer og kaninhornhinneepiteliale primærceller12. Sammenligningen mellom effekten av toksiner på primære humane keratocytter og immortaliserte keratocytter viste ingen signifikante forskjeller11. Ved hjelp av metodene som er beskrevet i denne artikkelen, vil effektiviteten av disse analysene for å vurdere toksisiteten av UV-stråling og okulære toksiner på pHCEC og iHCEC bli bestemt.
Tre okulære toksiner som vanligvis brukes i in vitro-analyser ble valgt: BAK,H2O2og SDS. BAK er et kationisk konserveringsmiddel som vanligvis brukes i oftalmiske løsninger 13,14, H 2 O2brukes ofte til å desinfisere kontaktlinser 15, og SDS er et anionisk overflateaktivt middel som finnes i vaskemidler og sjampo 14. I likhet med okulære toksiner kan UV-stråling også forårsake betydelig skade på HCECs3. I tillegg kan overeksponering for UV forårsake en okulær tilstand kjent som fotokeratitt preget av symptomer på tåre, lysfølsomhet og en følelse av grittiness16.
Det er et ubegrenset antall primære cellekulturer som kan brukes og forskjellige immortaliserte cellelinjer som er utviklet. Derfor ble det gjennomført en undersøkelse for å sammenligne primære HCECer med en udødeliggjort HCEC-linje for å bestemme likheter og forskjeller mellom modeller som inneholder disse typer celler.
Denne undersøkelsen brukte mikroskopi for å vurdere mulige forskjeller mellom pHCEC og iHCEC på cellefysiologisk respons på UV og toksiner. Effektene av UV-stråling og kjemikalier på cellemetabolsk aktivitet og inflammatorisk cytokinfrigjøring for de to cellelinjene ble også evaluert. Betydningen av å bestemme forskjellene mellom de to cellelinjene er å forstå optimal bruk av disse cellelinjene for å evaluere: 1) effekten av UV-stråling på celler, 2) effekten av toksiner på celler, og 3) de resulterende endringene i metabolisme, celle levedyktighet og cellecytokinfrigivelse for fremtidige studier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>75 cm2 Vented Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354485</td>
			<td>This is the BioCoat brand, collagen-coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>costar</td>
			<td>3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alamarBlue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>dal 1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin Staining buffer solution</td>
			<td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V</td>
			<td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system</td>
			<td>Carl Zeiss Inc., Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 48 Well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354505</td>
			<td>This is the BioCoat brand, collagen-coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>CYT5MPV</td>
			<td>Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hycone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass bottom coverslips</td>
			<td>MatTek Corporation, Ashland, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Corneal Epithelial Cells</td>
			<td>University of Ottawa</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements:</td>
			<td>Millipore, Billerica, MA, USA</td>
			<td>SCMC001</td>
			<td>Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 &#956;M Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 &#956;g/mL rh Insulin, 5 &#956;g/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Dead calcien and ethidium homodimer</td>
			<td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument</td>
			<td>Rockville, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay</td>
			<td>Rockville, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Corneal Epithelial Cells</td>
			<td>Millipore, Billerica, MA, USA</td>
			<td>SCCE016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax fluorescence multi-well plate reader</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell disassociation solution)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12605036</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining the toxicity of uv radiation and chemicals on primary and immortalized human corneal epithelial cells

Denne artikkelen beskriver metodene for å måle toksisiteten av ultrafiolett (UV) stråling og okulære toksiner på primære (pHCEC) og immortaliserte (iHCEC) humane hornhinneepitelcellekulturer. Cellene ble utsatt for UV-stråling og toksiske doser benzalkoniumklorid (BAK), hydrogenperoksid (H2O2) og natriumdodecylsulfat (SDS). Metabolsk aktivitet ble målt ved hjelp av en metabolsk analyse. Frigivelsen av inflammatoriske cytokiner ble målt ved hjelp av en multi-plex interleukin (IL) -1β, IL-6, IL-8 og tumor nekrose faktor-alfa (TNF-α) analyse, og celler ble evaluert for levedyktighet ved bruk av fluorescerende fargestoffer.
De skadelige effektene av UV på cellemetabolsk aktivitet og cytokinfrigjøring oppstod ved 5 minutters UV-eksponering for iHCEC og 20 minutter for pHCEC. Tilsvarende prosentvise fall i metabolsk aktivitet av iHCEC og pHCEC oppstod etter eksponering for BAK,H2O2eller SDS, og de mest signifikante endringene i cytokinfrigjøring skjedde for IL-6 og IL-8. Mikroskopi av fluorescerende fargede iHCEC- og pHCEC BAK-eksponerte celler viste celledød ved 0,005 % BAK-eksponering, selv om graden av ethidiumfarging var større i iHCEC enn pHCEC. Ved å bruke flere metoder for å vurdere toksiske effekter ved hjelp av mikroskopi, vurderinger av metabolsk aktivitet og cytokinproduksjon, kan toksisiteten av UV-stråling og kjemiske toksiner bestemmes for både primære og immortaliserte cellelinjer.

Celle størrelse De primære og immortaliserte HCECene ble visualisert med tre fluorescerende fargestoffer, som gjenspeiler tre forskjellige stadier av celle levedyktighet. Levende celler er grønne (calcein-AM), døde celler er røde (ethidium homodimer-1), og apoptotiske celler er gule (vedlegg V-datamaskinjustert farge for bedre visualisering av fluorescenssignalet). Levende celler inneholder esteraser i cellecytoplasma og konverterer calcein-AM til kalcein. Døde celler har cellemembraner som er g...

Watch this Scientific Journal Video about Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells at JoVE.com

Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells

Denne artikkelen beskriver prosedyrene som brukes til å evaluere toksisiteten av UV-stråling og kjemiske toksiner på en primær og udødeliggjort cellelinje.

Bestemme toksisiteten av UV-stråling og kjemikalier på primære og udødeliggjorte humane hornhinneepitelceller

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) ...

Denne metoden kan brukes til å evaluere in vitro toksisiteten til nye oftalmiske produktformuleringer. Ved å raffinere konsentrasjonene av kjemikalier og produktformuleringer ved hjelp av okulære celler in vitro, kan bruken av dyr for å vurdere ny produktsikkerhet minimeres. In vitro-analyser evaluerer toksisitetsendepunkter som ikke kan vurderes in vivo, for eksempel bestemmelse av effekten av et kjemikalie på mitokondriell funksjon, cellemembranintegritet og enzymaktivitet.Evaluere celletoksisitet in vitro er nøkkelen til å forstå potensielle mekanismer for toksisitet. Dette er viktig for å etablere en maksimal tolerabel dose terapeutiske kjemikalier i øyet. Demonstrere prosedyren vil være Nijani Nagaarudkumaran, en forsker fra Jones Laboratory.Begynn med å sette både pHCECs og iHCECs på kollagenbelagte petriskåler med glassbunndeksel i en konsentrasjon på 1 x 10 til 5th med 1 milliliter humant okulært epitelmedium, eller HOEM. Dyrk pHCECs og iHCECs 1 sett med kulturer i 24 timer og et annet sett i 48 timer i en 37-graders Celsius-inkubator med 5% karbondioksid. Etter inkubering, farg cellene med 500 mikroliter annexinfargebufferløsning inneholdende 4 mikromolar kalcein, 8 mikromolar ethidiumhomodimer 1 og vedlegg 5 i 20 minutter ved 37 grader Celsius.Etter farging av cellene, juster det konfokale laserskanningsmikroskopet for å fange eksitasjons- og utslippsbølgelengder, som beskrevet i tekstmanuskriptet. Hent de todimensjonale og tredimensjonale bildene ved å følge instruksjonene i manuskriptet. Seed cellene ved 5 x 10 til 4th per milliliter HOEM i hver brønn av en 24-brønns kollagen 1 belagt kulturplate og inkubere ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid i 3 timer.Etter inkubering, reduser volumet av mediet i brønnene til 300 mikroliter. Deretter utsettes cellene for UVA-stråling ved 6,48 watt per kvadratmeter, og UVB-stråling ved 1,82 watt per kvadratmeter ved 37 grader Celsius i 5 og 20 minutter i separate eksperimenter. Etter UV-stråling, tilsett 200 mikroliter fersk HOEM til hver brønn og inkuber i 20 timer ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid.Neste dag samler du cellesupernatanten i hver brønn og overfører den til sterile 2 milliliter polypropylenrør. Frys supernatanten ved minus 80 grader Celsius. For å bestemme cytokinnivåene som frigjøres av pHCECs og iHCECs etter UV-eksponering, bruk en multiplex cytokinanalyse og følg settets instruksjoner for å kvantifisere interleukin 6, interleukin 8, interleukin-1 beta og TNF-alfa.Forbered 10% metabolsk analysereagens i DMEM og F12. Bytt ut kulturmediet i hver brønn med 1 milliliter av 10% metabolsk analyseløsning og inkuber ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid i 4 timer. Mål fluorescensen til hver løsning ved hjelp av en fluorescerende plateleser ved 530 nanometer eksitasjon og 590 nanometer utslippsbølgelengder.Frøceller ved 5 x 10 til fjerde per milliliter HOEM i hver brønn av en 24-brønns kollagen 1-belagt kulturplate. Inkuber ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid i 3 timer. Etter inkubering, fjern mediet og utsett cellene for 1 milliliter kjemiske toksiner, som inkluderer 0,001% benzalkoniumklorid eller BAK, 0,01% hydrogenperoksid og 0,0025% natriumdodecylsulfat i PBS i 5 og 15 minutter.Etter eksponering for kjemiske giftstoffer, fjern giftstoffer fra brønnene, skyll med 1 milliliter PBS og tilsett 1 milliliter HOEM til hver brønn. Etter 20 timers inkubasjon, utfør en metabolsk analyse ved å erstatte mediet med 1 milliliter av en 10% metabolsk analyseløsning og inkubere ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid i 4 timer. Mål fluorescensen til hver løsning ved hjelp av en fluorescerende plateleser ved 530 nanometer eksitasjon og 590 nanometer utslippsbølgelengder.Overfør cellesupernatantene fra brønnene etter 20-timers inkubasjon til separate sterile 2 milliliter polypropylenrør og frys dem ved minus 80 grader Celsius. Bruk den samme multiplexplattformen som brukes til å vurdere cytokinene fra UV-behandlede celler etter settets instruksjoner for å kvantifisere interleukin 6, interleukin 8, interleukin-1 beta og TNF-alfa. Frøceller ved 1 x 10 til 5th per milliliter HOEM i hver brønn av en 24-brønns kollagen 1-belagt kulturplate og inkuberer ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid i 24 timer.Etter inkubering, fjern mediet og utsett cellene for 1 milliliter kjemiske toksiner, inkludert 0,001% BAK, 0,005% BAK og 0,01% BAK i PBS i 5 minutter. Etter eksponering, fjern kjemiske giftstoffer, skyll brønnene med 1 milliliter PBS og tilsett 1 milliliter HOEM til hver brønn. Etter 20 timers inkubasjon, farg cellene med 500 mikroliter anneksinfargebufferløsning inneholdende kalcein, ethidiumhomodimer og anneksin 5 i 20 minutter ved 37 grader Celsius.Juster mikroskopet for å måle intensiteter ved eksitasjon og utslippsbølgelengder på 630 og 675 nanometer for vedlegg 5, 495 og 515 nanometer for kalcein AM, og 528 og 617 nanometer for ethidium 1-farging. Deretter får du bilder av cellene ved hjelp av fluorescensmikroskopet. iHCECene ble funnet å være små celler som varierer fra 10 til 20 mikrometer, og pHCECene var i området 20 til 50 mikrometer etter 24 timers vekst.Lignende forskjeller i størrelsesområde ble observert for iHCEC og pHCEC etter 48 timers vekst. Sammenlignet med de ikke-UV-eksponerte cellene, ble den metabolske aktiviteten til bestrålte pHCEC signifikant redusert ved 20 minutters eksponering. For iHCEC ble den metabolske aktiviteten redusert for celler bestrålt etter både 5 og 20 minutter.Derfor tok det lengre eksponeringstid å redusere den metabolske aktiviteten til pHCECene enn iHCEC-ene. Maksimal cytokinfrigjøring fra iHCEC var ved 5 minutters UV-eksponering. Maksimal cytokinfrigjøring for pHCEC oppstod ved 20 minutters UV-eksponering.Når det gjelder totale mengder inflammatoriske cytokiner som ble frigjort, frigjorde pHCECene vesentlig mer interleukin-1 beta, interleukin 8 og TNF-alfa enn iHCECs, mens iHCECene frigjorde mer interleukin 6. Både pHCEC og iHCEC viste endring i frigjøring av interleukin 6 etter eksponering for alle tre kjemikaliene. BAK forårsaket en reduksjon i frigjøringen av interleukin 6 sammenlignet med kontrollen for både primære og immortaliserte HCECs.Hydrogenperoksid forårsaket en økning i frigjøringen av interleukin 6 fra iHCECs, og en reduksjon i frigjøringen fra pHCECs. Både pHCEC og iHCEC ble betydelig skadet ved 0,005% og 0,1% av BAK. Etter å ha utført in vitro-vurderinger av okulær celletoksisitet, kan ytterligere dyremodeller av okulær toksisitet utføres for å bestemme effekten av et okulært produkt på hornhinnens nerver eller det okulære immunsystemet.Disse teknikkene er avgjørende for å bestemme mekanismene for kjemisk og produktformuleringstoksisitet på øyet og vil bidra til å minimere dyrebruk for produktutviklingstesting.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX following Ionizing Radiation

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induksjon og analyse av Epiteliale til Mesenchymale Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Dyrking av menneskelig Nasal Epitelceller på Air Flytende Interface

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Kvantifisering av endotelcelle klebrighet<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Analyse av SCAP<em&gt; N</em&gt; -glycosylation Og handel med humane celler

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of ...

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

Flercellet human alveolærmodell bestående av epitelceller og primære immunceller for farevurdering

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...