Name: determining the toxicity of uv radiation and chemicals on primary and immortalized human corneal epithelial cells
Uploaded: 2021-07-22T13:00:00
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Os autores não receberam financiamento para este trabalho.

1. Cultura de pHCECs e iHCECs
<ol><li>Cultivar os pHCECs e iHCECs em meio epitelial ocular humano (HOEM) com os seguintes suplementos: 6 mM L-glutamina, 0,002% suplemento de meio celular O (Tabela de Materiais), 1,0 μM de epinefrina, 0,4% de suplemento de mídia celular P (Tabela de Materiais), 5 μg/mL de insulina rh, 5 μg/mL de apo-transferrina e 100 ng/mL de hidrocortisona hemisuccinato em frascos de cultura revestidos com colágeno-1 (18 mL em um frasco de cultura de 75 cm2<...

<ol>
	<li>McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+human+corneal+epithelial+cell+line+for+screening+the+safety+of+contact+lens+care+solutions+in+vitro.">Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro.</a> Eye &amp; Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).</li><li>Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+effects+of+ophthalmic+solutions+on+human+corneal+epithelial+cells+using+fluorescent+dyes.">Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).</li><li>Youn, H. Y., McCanna, D. J., Sivak, J. G., Jones, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+ultraviolet-induced+damage+in+human+corneal,+lens,+and+retinal+pigment+epithelial+cells.">In vitro ultraviolet-induced damage in human corneal, lens, and retinal pigment epithelial cells.</a> Molecular Vision. 17, 237-246 (2011).</li><li>Hakkarainen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+cytotoxic+effects+of+marketed+ophthalmic+formulations+on+human+corneal+epithelial+cells.">Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells.</a> International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).</li><li>Spurr, S. J., Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+corneal+epithelium+with+Dispase+II+or+EDTA.+Effects+on+the+basement+membrane+zone.">Isolation of corneal epithelium with Dispase II or EDTA. Effects on the basement membrane zone.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 26 (6), 818-827 (1985).</li><li>Kahn, C. R., Young, E., Lee, I. H., Rhim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+corneal+epithelial+primary+cultures+and+cell+lines+with+extended+life+span:+in+vitro+model+for+ocular+studies.">Human corneal epithelial primary cultures and cell lines with extended life span: in vitro model for ocular studies.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 34 (12), 3429-3441 (1993).</li><li>Araki-Sasaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+SV40-immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+its+characterization.">An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).</li><li>Griffith, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+human+corneal+equivalents+constructed+from+cell+lines.">Functional human corneal equivalents constructed from cell lines.</a> Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).</li><li>Toouli, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+mammary+epithelial+cells+immortalized+by+simian+virus+40+T-Antigen+or+by+the+telomerase+catalytic+subunit.">Comparison of human mammary epithelial cells immortalized by simian virus 40 T-Antigen or by the telomerase catalytic subunit.</a> Oncogene. 21 (1), 128-139 (2002).</li><li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines:+Valuable+tools+or+useless+artifacts.">Cell lines: Valuable tools or useless artifacts.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li><li>Zorn-Kruppa, M., Tykhonova, S., Belge, G., Diehl, H. A., Engelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+corneal+cell+cultures+in+cytotoxicity+testing.">Comparison of human corneal cell cultures in cytotoxicity testing.</a> Altex. 21 (3), 129-134 (2004).</li><li>Huhtala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+an+immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+rabbit+corneal+epithelial+cell+culture+in+cytotoxicity+testing.">Comparison of an immortalized human corneal epithelial cell line and rabbit corneal epithelial cell culture in cytotoxicity testing.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 18 (2), 163-175 (2002).</li><li>Pisella, P. J., Fillacier, K., Elena, P. P., Debbasch, C., Baudouin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+effects+of+preserved+and+unpreserved+formulations+of+timolol+on+the+ocular+surface+of+albino+rabbits.">Comparison of the effects of preserved and unpreserved formulations of timolol on the ocular surface of albino rabbits.</a> Ophthalmic Research. 32 (1), 3-8 (2000).</li><li>Youn, H. Y., Moran, K. L., Oriowo, O. M., Bols, N. C., Sivak, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactant+and+UV-B-induced+damage+of+the+cultured+bovine+lens.">Surfactant and UV-B-induced damage of the cultured bovine lens.</a> Toxicology in vitro. 18 (6), 841-852 (2004).</li><li>Hughes, R., Kilvington, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+hydrogen+peroxide+contact+lens+disinfection+systems+and+solutions+against+Acanthamoeba+polyphaga.">Comparison of hydrogen peroxide contact lens disinfection systems and solutions against Acanthamoeba polyphaga.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (7), 2038-2043 (2001).</li><li>Delic, N. C., Lyons, J. G., Di Girolamo, N., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damaging+effects+of+ultraviolet+radiation+on+the+cornea.">Damaging effects of ultraviolet radiation on the cornea.</a> Photochemistry and Photobiology. 93 (4), 920-929 (2017).</li><li>Ahuja, D., Saenz-Robles, M. T., Pipas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SV40+large+T+antigen+targets+multiple+cellular+pathways+to+elicit+cellular+transformation.">SV40 large T antigen targets multiple cellular pathways to elicit cellular transformation.</a> Oncogene. 24 (52), 7729-7745 (2005).</li><li>Tong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pin1+inhibits+PP2A-mediated+Rb+dephosphorylation+in+regulation+of+cell+cycle+and+S-phase+DNA+damage.">Pin1 inhibits PP2A-mediated Rb dephosphorylation in regulation of cell cycle and S-phase DNA damage.</a> Cell Death &amp; Disease. 6, 1640 (2015).</li><li>Muller, P. A., Vousden, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+mutations+in+cancer.">p53 mutations in cancer.</a> Nature Cell Biology. 15 (1), 2-8 (2013).</li><li>Seshacharyulu, P., Pandey, P., Datta, K., Batra, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatase:+PP2A+structural+importance,+regulation+and+its+aberrant+expression+in+cancer.">Phosphatase: PP2A structural importance, regulation and its aberrant expression in cancer.</a> Cancer Letters. 335 (1), 9-18 (2013).</li><li>Yang, D., Okamura, H., Morimoto, H., Teramachi, J., Haneji, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+2A+Calpha+regulates+proliferation,+migration,+and+metastasis+of+osteosarcoma+cells.">Protein phosphatase 2A Calpha regulates proliferation, migration, and metastasis of osteosarcoma cells.</a> Laboratory nvestigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1050-1062 (2016).</li><li>Xie, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+and+inactivation+of+the+PP2A+complex+promotes+the+proliferation+and+angiogenesis+of+hemangioma+endothelial+cells+through+activating+AKT+and+ERK.">Disruption and inactivation of the PP2A complex promotes the proliferation and angiogenesis of hemangioma endothelial cells through activating AKT and ERK.</a> Oncotarget. 6 (28), 25660-25676 (2015).</li><li>Mallet, J. D., Rochette, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wavelength-dependent+ultraviolet+induction+of+cyclobutane+pyrimidine+dimers+in+the+human+cornea.">Wavelength-dependent ultraviolet induction of cyclobutane pyrimidine dimers in the human cornea.</a> Photochemical &amp; Photobiological Sciences. 12 (8), 1310-1318 (2013).</li><li>Cejkova, J., Cejka, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+oxidative+stress+in+corneal+diseases+and+injuries.">The role of oxidative stress in corneal diseases and injuries.</a> Histology and Histopathology. 30 (8), 893-900 (2015).</li><li>Wang, S. Q., Balagula, Y., Osterwalder, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoprotection:+a+review+of+the+current+and+future+technologies.">Photoprotection: a review of the current and future technologies.</a> Dermatologic Therapy. 23 (1), 31-47 (2010).</li><li>Svobodova, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+after+acute+exposure+of+mice+skin+to+physiological+doses+of+UVB+and+UVA+light.">DNA damage after acute exposure of mice skin to physiological doses of UVB and UVA light.</a> Archives of Dermatological Research. 304 (5), 407-412 (2012).</li><li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+irradiation+induces+the+production+of+multiple+cytokines+by+human+corneal+cells.">Ultraviolet irradiation induces the production of multiple cytokines by human corneal cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 38 (12), 2483-2491 (1997).</li><li>Kode, A., Yang, S. R., Rahman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+cigarette+smoke+on+oxidative+stress+and+proinflammatory+cytokine+release+in+primary+human+airway+epithelial+cells+and+in+a+variety+of+transformed+alveolar+epithelial+cells.">Differential effects of cigarette smoke on oxidative stress and proinflammatory cytokine release in primary human airway epithelial cells and in a variety of transformed alveolar epithelial cells.</a> Respiratory Research. 7, 132 (2006).</li><li>Epstein, S. P., Chen, D., Asbell, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+biomarkers+of+inflammation+in+response+to+benzalkonium+chloride+on+corneal+and+conjunctival+epithelial+cells.">Evaluation of biomarkers of inflammation in response to benzalkonium chloride on corneal and conjunctival epithelial cells.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 25 (5), 415-424 (2009).</li></ol>

Diferenças potenciais no uso de dois tipos de HCECs foram avaliadas. As células foram colocadas no mesmo meio (HOEM) em concentrações idênticas de células e, em seguida, expostas a curtos e longos períodos de radiação UV e três toxinas oculares. As doses de radiação UV e produtos químicos foram selecionadas com base em seus efeitos fisiológicos, que foram prejudiciais o suficiente para as células produzirem respostas intermediárias que pudessem ser comparadas. Os tempos de exposição de 5 e 20 min para a...

Estudos toxicológicos in vitro são realizados para prever os efeitos tóxicos de produtos químicos e outros agentes que podem causar danos às células. Na avaliação da toxicidade para a córnea, células epiteliais corneanas humanas (HCECs) têm sido utilizadas em modelos para avaliação desses efeitos 1,2,3,4. Esses modelos tipicamente avaliam efeitos fisiológicos, como alterações na atividade metabólica da célula, proliferação celular e outras funções celulares, como a produção e liberação de citocinas inflamatórias. Para esses estudos toxicológicos, células de várias fontes foram selecionadas para avaliar os efeitos nocivos de produtos químicos e radiação UV sobre HCECs 2,3. As linhas pHCEC estão disponíveis em empresas que fornecem essas células a partir de tecidos de doadores de adultos. As células primárias podem ser tratadas com dispase e raspadas suavemente da córnea para cultura5. As células são então testadas para vírus e contaminação e, em seguida, enviadas criopreservadas em 10% de dimetil sulfóxido.
A vantagem das linhagens celulares primárias é que as células são geneticamente idênticas às células do doador. Isso é ideal, pois um modelo in vitro deve mimetizar o tecido in vivo tanto quanto possível. A desvantagem das linhagens celulares primárias é que elas têm um número limitado de divisões ou passagens celulares6. O número limitado de células disponíveis restringe o número de experimentos que podem ser conduzidos com uma única cultura primária, aumentando o custo dos experimentos.
Linhagens celulares imortalizadas também têm sido utilizadas em modelos de toxicidade em cultura celular. No entanto, ao contrário da linhagem celular primária obtida do tecido in vivo, a linhagem celular imortalizada foi geneticamente alterada. As células imortalizadas são criadas pela incorporação dos genes de um vírus ao DNA das células primárias6,7,8. Células com incorporação gênica viral bem-sucedida são selecionadas para a linhagem celular imortalizada. A vantagem da imortalização é que ela permite uma proliferação rápida indefinida, fornecendo um número ilimitado de células para realizar vários experimentos usando a mesma linhagem celular. Isso permite a consistência entre os experimentos e reduz o custo.
Além de alterações nos genes que limitavam a proliferação celular, alterações na expressão de genes de funcionalidade crítica também poderiamocorrer9. Portanto, a desvantagem do uso de células imortalizadas é que elas podem não mais representar as células originais in vivo em termos de resposta a vários estímulos externos10. Comparações envolveram a observação dos efeitos tóxicos de substâncias químicas sobre queratócitos corneanos humanos primários e imortalizados11, bem como HCECs imortalizados e células primárias epiteliais da córnea de coelhos12. A comparação entre os efeitos das toxinas sobre queratócitos humanos primários e queratócitos imortalizados não mostrou diferençassignificativas11. Usando os métodos detalhados neste artigo, a eficácia destes ensaios para avaliar a toxicidade da radiação UV e toxinas oculares sobre pHCECs e iHCECs será determinada.
Três toxinas oculares comumente utilizadas em ensaios in vitro foram selecionadas: BAK, H 2 O2e SDS. O BAK é um conservante catiônico comumente usado em soluções oftálmicas13,14, o H 2 O2 é comumente usado para desinfetar lentes de contato 15 e o SDS é um surfactante aniônico encontrado em detergentes e xampus 14. Assim como as toxinas oculares, a radiação UV também pode causar danos significativos aos HCECs3. Além disso, a superexposição aos raios UV pode causar uma condição ocular conhecida como fotoceratite, caracterizada por sintomas de lacrimejamento, sensibilidade à luz e sensação de arenosidade16.
Há um número ilimitado de culturas de células primárias que podem ser usadas e várias linhagens celulares imortalizadas que foram desenvolvidas. Portanto, uma investigação foi realizada para comparar HCECs primários com uma linhagem imortalizada de HCEC para determinar semelhanças e diferenças entre modelos que incorporam esses tipos de células.
Esta investigação utilizou microscopia para avaliar possíveis diferenças entre pHCECs e iHCECs na resposta fisiológica celular a UV e toxinas. Os efeitos da radiação UV e de produtos químicos sobre a atividade metabólica celular e liberação de citocinas inflamatórias para as duas linhagens celulares também foram avaliados. A importância de determinar as diferenças entre as duas linhagens celulares é entender o uso ideal dessas linhagens celulares para avaliar: 1) o efeito da radiação UV nas células, 2) os efeitos das toxinas nas células e 3) as alterações resultantes no metabolismo, viabilidade celular e liberação de citocinas celulares para estudos futuros.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>75 cm2 Vented Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354485</td>
			<td>This is the BioCoat brand, collagen-coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>costar</td>
			<td>3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alamarBlue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>dal 1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin Staining buffer solution</td>
			<td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V</td>
			<td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system</td>
			<td>Carl Zeiss Inc., Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 48 Well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354505</td>
			<td>This is the BioCoat brand, collagen-coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>CYT5MPV</td>
			<td>Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hycone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass bottom coverslips</td>
			<td>MatTek Corporation, Ashland, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Corneal Epithelial Cells</td>
			<td>University of Ottawa</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements:</td>
			<td>Millipore, Billerica, MA, USA</td>
			<td>SCMC001</td>
			<td>Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 &#956;M Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 &#956;g/mL rh Insulin, 5 &#956;g/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Dead calcien and ethidium homodimer</td>
			<td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument</td>
			<td>Rockville, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay</td>
			<td>Rockville, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Corneal Epithelial Cells</td>
			<td>Millipore, Billerica, MA, USA</td>
			<td>SCCE016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax fluorescence multi-well plate reader</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell disassociation solution)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12605036</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining the toxicity of uv radiation and chemicals on primary and immortalized human corneal epithelial cells

Este artigo descreve os métodos de medição da toxicidade da radiação ultravioleta (UV) e toxinas oculares em culturas de células epiteliais primárias (pHCEC) e imortalizadas (iHCEC). As células foram expostas à radiação UV e a doses tóxicas de cloreto de benzalcônio (BAK), peróxido de hidrogênio (H 2O2) e dodecil sulfato de sódio (SDS). A atividade metabólica foi medida por meio de um ensaio metabólico. A liberação de citocinas inflamatórias foi medida usando um ensaio multiplex de interleucina (IL)-1β, IL-6, IL-8 e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), e as células foram avaliadas quanto à viabilidade usando corantes fluorescentes.
Os efeitos prejudiciais dos UV sobre a atividade metabólica celular e liberação de citocinas ocorreram em 5 min de exposição UV para iHCEC e 20 min para pHCEC. Quedas percentuais semelhantes na atividade metabólica do iHCEC e pHCEC ocorreram após a exposição a BAK, H 2 O2ou SDS, e as mudanças mais significativas na liberação de citocinas ocorreram para IL-6 e IL-8. A microscopia das células iHCEC e pHCEC expostas a BAK, coradas fluorescentemente, mostrou morte celular com 0,005% de exposição a BAK, embora o grau de coloração de etídio tenha sido maior nos iHCECs do que nos pHCECs. Utilizando múltiplos métodos de avaliação de efeitos tóxicos usando microscopia, avaliações da atividade metabólica e produção de citocinas, a toxicidade da radiação UV e toxinas químicas pôde ser determinada tanto para linhagens celulares primárias quanto imortalizadas.

Tamanho da célula Os HCECs primários e imortalizados foram visualizados com três corantes fluorescentes, que refletem três diferentes estágios de viabilidade celular. As células vivas são verdes (calceína-AM), as células mortas são vermelhas (homodímero etídio-1) e as células apoptóticas são amarelas (anexina V - cor ajustada por computador para melhor visualização do sinal de fluorescência). As células vivas contêm esterases no citoplasma celular e convertem calceína-AM em calce?...

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Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells

Este artigo descreve os procedimentos utilizados para avaliar a toxicidade da radiação UV e toxinas químicas em uma linhagem celular primária e imortalizada.

Determinação da Toxicidade da Radiação UV e Produtos Químicos em Células Epiteliais Primárias e Imortalizadas da Córnea Humana

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) ...

Este método pode ser utilizado para avaliar in vitro a toxicidade de novas formulações de produtos oftálmicos. Ao refinar as concentrações de produtos químicos e formulações de produtos usando células oculares in vitro, o uso de animais para avaliar a segurança de novos produtos pode ser minimizado. Os ensaios in vitro avaliam desfechos de toxicidade que não podem ser avaliados in vivo, como determinar o efeito de uma substância química na função mitocondrial, integridade da membrana celular e atividade enzimática.Avaliar a toxicidade celular in vitro é fundamental para a compreensão dos potenciais mecanismos de toxicidade. Isto é essencial para estabelecer uma dose máxima tolerável de produtos químicos terapêuticos no olho. Quem demonstrará o procedimento será Nijani Nagaarudkumaran, pesquisadora do Laboratório Jones.Comece assentando ambos os pHCECs e iHCECs em placas de Petri revestidas de colágeno com tampa inferior de vidro deslizando em uma concentração de 1 x 10 até o 5º com 1 mililitro de meio de epitélio ocular humano, ou HOEM. Cultivar pHCECs e iHCECs 1 conjunto de culturas por 24 horas e outro conjunto por 48 horas em uma incubadora de 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Após a incubação, corar as células com 500 microlitros de solução tampão de coloração de anexina contendo 4 calceína micromolar, 8 homodímero de etídio micromolar 1 e anexina 5 por 20 minutos a 37 graus Celsius.Após a coloração das células, ajustar o microscópio confocal de varredura a laser para capturar os comprimentos de onda de excitação e emissão, conforme descrito no manuscrito do texto. Obter as imagens bidimensionais e tridimensionais seguindo as instruções do manuscrito. Semeando as células a 5 x 10 a 4 por mililitro de HOEM em cada poço de uma placa de cultura revestida com colágeno 1 de 24 poços e incubar a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 3 horas.Após a incubação, reduza o volume do meio nos poços para 300 microlitros. Em seguida, exponha as células à radiação UVA a 6,48 watts por metro quadrado e à radiação UVB a 1,82 watts por metro quadrado a 37 graus Celsius por 5 e 20 minutos em experimentos separados. Após a radiação UV, adicione 200 microlitros de HOEM fresco a cada poço e incube por 20 horas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.No dia seguinte, colete o sobrenadante celular em cada poço e transfira-o para tubos estéreis de polipropileno de 2 mililitros. Congele o sobrenadante a menos 80 graus Celsius. Para determinar os níveis de citocinas liberados pelos pHCECs e iHCECs após exposição aos raios UV, use um ensaio de citocinas multiplex e siga as instruções do kit para quantificar interleucina 6, interleucina 8, interleucina-1 beta e TNF-alfa.Preparar reagente de ensaio metabólico a 10% em DMEM e F12. Substitua o meio de cultura em cada poço por 1 mililitro da solução de ensaio metabólico a 10% e incube a 37 graus Celsius com dióxido de carbono a 5% por 4 horas. Meça a fluorescência de cada solução usando um leitor de placas fluorescentes a 530 nanômetros de excitação e 590 nanômetros de comprimento de onda de emissão.Células de sementes a 5 x 10 ao quarto por mililitro de HOEM em cada poço de uma placa de cultura revestida com colágeno 1 de 24 poços. Incubar a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono durante 3 horas. Após a incubação, remova o meio e exponha as células a 1 mililitro de toxinas químicas, que incluem cloreto de benzalcônio a 0,001%, ou BAK, peróxido de hidrogênio a 0,01% e dodecil sulfato de sódio a 0,0025% em PBS por 5 e 15 minutos.Após a exposição às toxinas químicas, remova as toxinas dos poços, enxágue com 1 mililitro de PBS e adicione 1 mililitro de HOEM a cada poço. Após 20 horas de incubação, realizar um ensaio metabólico substituindo o meio por 1 mililitro de uma solução de ensaio metabólico a 10% e incubando a 37 graus Celsius com dióxido de carbono a 5% por 4 horas. Meça a fluorescência de cada solução usando um leitor de placas fluorescentes a 530 nanômetros de excitação e 590 nanômetros de comprimento de onda de emissão.Transfira os sobrenadantes celulares dos poços após a incubação de 20 horas em tubos de polipropileno estéreis separados de 2 mililitros e congele-os a 80 graus Celsius negativos. Use a mesma plataforma multiplex usada para avaliar as citocinas das células tratadas com UV seguindo as instruções do kit para quantificar interleucina 6, interleucina 8, interleucina-1 beta e TNF-alfa. Células de sementes a 1 x 10 a 5ª por mililitro de HOEM em cada poço de uma placa de cultura revestida com colágeno 1 de 24 poços e incubam a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 24 horas.Após a incubação, remova o meio e exponha as células a 1 mililitro de toxinas químicas, incluindo 0,001%BAK, 0,005%BAK e 0,01%BAK em PBS por 5 minutos. Após a exposição, remova as toxinas químicas, lave os poços com 1 mililitro de PBS e adicione 1 mililitro de HOEM a cada poço. Após 20 horas de incubação, corar as células com 500 microlitros de solução tampão de coloração de anexina contendo calceína, homodímero de etídio e anexina 5 por 20 minutos a 37 graus Celsius.Ajustar o microscópio para medir intensidades nos comprimentos de onda de excitação e emissão de 630 e 675 nanômetros para anexina 5, 495 e 515 nanômetros para calceína AM e 528 e 617 nanômetros para coloração de etídio 1. Em seguida, adquirir imagens das células usando o microscópio de fluorescência. Os iHCECs foram encontrados para ser pequenas células que variam de 10 a 20 micrômetros e os pHCECs estavam na faixa de 20 a 50 micrômetros após 24 horas de crescimento.Diferenças semelhantes na faixa de tamanho foram observadas para iHCECs e pHCECs após 48 horas de crescimento. Em comparação com as células não expostas aos raios UV, a atividade metabólica dos pHCECs irradiados foi significativamente reduzida aos 20 minutos de exposição. Para iHCECs, a atividade metabólica diminuiu para as células irradiadas em 5 e 20 minutos.Portanto, levou um tempo de exposição maior para reduzir a atividade metabólica dos pHCECs do que os iHCECs. A liberação máxima de citocinas pelos iHCECs foi aos 5 minutos de exposição aos raios UV. A liberação máxima de citocinas para pHCECs ocorreu aos 20 minutos de exposição aos raios UV.Em termos de quantidades totais de citocinas inflamatórias liberadas, os pHCECs liberaram substancialmente mais interleucina-1 beta, interleucina 8 e TNF-alfa do que os iHCECs, enquanto os iHCECs liberaram mais interleucina 6. Tanto os pHCECs quanto os iHCECs mostraram uma mudança na liberação de interleucina 6 após a exposição aos três produtos químicos. A BAK causou uma diminuição na liberação de interleucina 6 em comparação com o controle para HCECs primários e imortalizados.O peróxido de hidrogênio causou um aumento na liberação de interleucina 6 de iHCECs, e uma diminuição na liberação de pHCECs. Tanto os pHCECs quanto os iHCECs foram significativamente danificados em 0,005% e 0,1% de BAK. Após a realização de avaliações in vitro da toxicidade das células oculares, outros modelos animais de toxicidade ocular poderiam ser realizados para determinar o efeito de um produto ocular nos nervos da córnea ou no sistema imunológico ocular.Essas técnicas são essenciais para determinar os mecanismos de toxicidade da formulação de produtos químicos e de produtos no olho e ajudarão a minimizar o uso de animais para testes de desenvolvimento de produtos.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Primárias células epiteliais brônquicas humanas Grown a partir de explantes

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Biologia

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantificação de γH2AX Focos em resposta à radiação ionizante

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX following Ionizing Radiation

Avaliação da Distribuição Espacial da γH2AX seguintes Radiação Ionizante

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Analisando a função de GTPases Pequenas pela microinjeção de Plasmids em Polarized Células Epiteliais

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo de Cultura Primária células epiteliais trompa de Falópio

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Indução e Análise de epitelial para mesenquimal Transição

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Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

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Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

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Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of ...

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

Modelo Alveolar Humano Multicelular Composto por Células Epiteliais e Células Imunes Primárias para Avaliação de Riscos

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...