Name: determining the toxicity of uv radiation and chemicals on primary and immortalized human corneal epithelial cells
Uploaded: 2021-07-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells at JoVE.com

Авторы не получили финансирования для этой работы.

1. Культура pHCEC и iHCEC
<ol><li>Выращивайте pHCEC и iHCEC в эпителиальной среде глаза человека (HOEM) со следующими добавками: 6 мМ L-глютамина, 0,002% добавка клеточной среды O (таблица материалов), 1,0 мкМ адреналина, 0,4% добавка клеточной среды P (таблица материалов), 5 мкг/мл резус-инсулина, 5 мкг/мл ?...

<ol>
	<li>McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+human+corneal+epithelial+cell+line+for+screening+the+safety+of+contact+lens+care+solutions+in+vitro.">Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro.</a> Eye &amp; Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).</li><li>Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+effects+of+ophthalmic+solutions+on+human+corneal+epithelial+cells+using+fluorescent+dyes.">Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).</li><li>Youn, H. Y., McCanna, D. J., Sivak, J. G., Jones, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+ultraviolet-induced+damage+in+human+corneal,+lens,+and+retinal+pigment+epithelial+cells.">In vitro ultraviolet-induced damage in human corneal, lens, and retinal pigment epithelial cells.</a> Molecular Vision. 17, 237-246 (2011).</li><li>Hakkarainen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+cytotoxic+effects+of+marketed+ophthalmic+formulations+on+human+corneal+epithelial+cells.">Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells.</a> International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).</li><li>Spurr, S. J., Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+corneal+epithelium+with+Dispase+II+or+EDTA.+Effects+on+the+basement+membrane+zone.">Isolation of corneal epithelium with Dispase II or EDTA. Effects on the basement membrane zone.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 26 (6), 818-827 (1985).</li><li>Kahn, C. R., Young, E., Lee, I. H., Rhim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+corneal+epithelial+primary+cultures+and+cell+lines+with+extended+life+span:+in+vitro+model+for+ocular+studies.">Human corneal epithelial primary cultures and cell lines with extended life span: in vitro model for ocular studies.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 34 (12), 3429-3441 (1993).</li><li>Araki-Sasaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+SV40-immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+its+characterization.">An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).</li><li>Griffith, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+human+corneal+equivalents+constructed+from+cell+lines.">Functional human corneal equivalents constructed from cell lines.</a> Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).</li><li>Toouli, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+mammary+epithelial+cells+immortalized+by+simian+virus+40+T-Antigen+or+by+the+telomerase+catalytic+subunit.">Comparison of human mammary epithelial cells immortalized by simian virus 40 T-Antigen or by the telomerase catalytic subunit.</a> Oncogene. 21 (1), 128-139 (2002).</li><li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines:+Valuable+tools+or+useless+artifacts.">Cell lines: Valuable tools or useless artifacts.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li><li>Zorn-Kruppa, M., Tykhonova, S., Belge, G., Diehl, H. A., Engelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+corneal+cell+cultures+in+cytotoxicity+testing.">Comparison of human corneal cell cultures in cytotoxicity testing.</a> Altex. 21 (3), 129-134 (2004).</li><li>Huhtala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+an+immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+rabbit+corneal+epithelial+cell+culture+in+cytotoxicity+testing.">Comparison of an immortalized human corneal epithelial cell line and rabbit corneal epithelial cell culture in cytotoxicity testing.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 18 (2), 163-175 (2002).</li><li>Pisella, P. J., Fillacier, K., Elena, P. P., Debbasch, C., Baudouin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+effects+of+preserved+and+unpreserved+formulations+of+timolol+on+the+ocular+surface+of+albino+rabbits.">Comparison of the effects of preserved and unpreserved formulations of timolol on the ocular surface of albino rabbits.</a> Ophthalmic Research. 32 (1), 3-8 (2000).</li><li>Youn, H. Y., Moran, K. L., Oriowo, O. M., Bols, N. C., Sivak, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactant+and+UV-B-induced+damage+of+the+cultured+bovine+lens.">Surfactant and UV-B-induced damage of the cultured bovine lens.</a> Toxicology in vitro. 18 (6), 841-852 (2004).</li><li>Hughes, R., Kilvington, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+hydrogen+peroxide+contact+lens+disinfection+systems+and+solutions+against+Acanthamoeba+polyphaga.">Comparison of hydrogen peroxide contact lens disinfection systems and solutions against Acanthamoeba polyphaga.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (7), 2038-2043 (2001).</li><li>Delic, N. C., Lyons, J. G., Di Girolamo, N., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damaging+effects+of+ultraviolet+radiation+on+the+cornea.">Damaging effects of ultraviolet radiation on the cornea.</a> Photochemistry and Photobiology. 93 (4), 920-929 (2017).</li><li>Ahuja, D., Saenz-Robles, M. T., Pipas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SV40+large+T+antigen+targets+multiple+cellular+pathways+to+elicit+cellular+transformation.">SV40 large T antigen targets multiple cellular pathways to elicit cellular transformation.</a> Oncogene. 24 (52), 7729-7745 (2005).</li><li>Tong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pin1+inhibits+PP2A-mediated+Rb+dephosphorylation+in+regulation+of+cell+cycle+and+S-phase+DNA+damage.">Pin1 inhibits PP2A-mediated Rb dephosphorylation in regulation of cell cycle and S-phase DNA damage.</a> Cell Death &amp; Disease. 6, 1640 (2015).</li><li>Muller, P. A., Vousden, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+mutations+in+cancer.">p53 mutations in cancer.</a> Nature Cell Biology. 15 (1), 2-8 (2013).</li><li>Seshacharyulu, P., Pandey, P., Datta, K., Batra, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatase:+PP2A+structural+importance,+regulation+and+its+aberrant+expression+in+cancer.">Phosphatase: PP2A structural importance, regulation and its aberrant expression in cancer.</a> Cancer Letters. 335 (1), 9-18 (2013).</li><li>Yang, D., Okamura, H., Morimoto, H., Teramachi, J., Haneji, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+2A+Calpha+regulates+proliferation,+migration,+and+metastasis+of+osteosarcoma+cells.">Protein phosphatase 2A Calpha regulates proliferation, migration, and metastasis of osteosarcoma cells.</a> Laboratory nvestigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1050-1062 (2016).</li><li>Xie, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+and+inactivation+of+the+PP2A+complex+promotes+the+proliferation+and+angiogenesis+of+hemangioma+endothelial+cells+through+activating+AKT+and+ERK.">Disruption and inactivation of the PP2A complex promotes the proliferation and angiogenesis of hemangioma endothelial cells through activating AKT and ERK.</a> Oncotarget. 6 (28), 25660-25676 (2015).</li><li>Mallet, J. D., Rochette, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wavelength-dependent+ultraviolet+induction+of+cyclobutane+pyrimidine+dimers+in+the+human+cornea.">Wavelength-dependent ultraviolet induction of cyclobutane pyrimidine dimers in the human cornea.</a> Photochemical &amp; Photobiological Sciences. 12 (8), 1310-1318 (2013).</li><li>Cejkova, J., Cejka, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+oxidative+stress+in+corneal+diseases+and+injuries.">The role of oxidative stress in corneal diseases and injuries.</a> Histology and Histopathology. 30 (8), 893-900 (2015).</li><li>Wang, S. Q., Balagula, Y., Osterwalder, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoprotection:+a+review+of+the+current+and+future+technologies.">Photoprotection: a review of the current and future technologies.</a> Dermatologic Therapy. 23 (1), 31-47 (2010).</li><li>Svobodova, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+after+acute+exposure+of+mice+skin+to+physiological+doses+of+UVB+and+UVA+light.">DNA damage after acute exposure of mice skin to physiological doses of UVB and UVA light.</a> Archives of Dermatological Research. 304 (5), 407-412 (2012).</li><li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+irradiation+induces+the+production+of+multiple+cytokines+by+human+corneal+cells.">Ultraviolet irradiation induces the production of multiple cytokines by human corneal cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 38 (12), 2483-2491 (1997).</li><li>Kode, A., Yang, S. R., Rahman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+cigarette+smoke+on+oxidative+stress+and+proinflammatory+cytokine+release+in+primary+human+airway+epithelial+cells+and+in+a+variety+of+transformed+alveolar+epithelial+cells.">Differential effects of cigarette smoke on oxidative stress and proinflammatory cytokine release in primary human airway epithelial cells and in a variety of transformed alveolar epithelial cells.</a> Respiratory Research. 7, 132 (2006).</li><li>Epstein, S. P., Chen, D., Asbell, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+biomarkers+of+inflammation+in+response+to+benzalkonium+chloride+on+corneal+and+conjunctival+epithelial+cells.">Evaluation of biomarkers of inflammation in response to benzalkonium chloride on corneal and conjunctival epithelial cells.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 25 (5), 415-424 (2009).</li></ol>

Были оценены потенциальные различия в использовании двух типов HCEC. Клетки помещали в одну и ту же среду (HOEM) при одинаковых концентрациях клеток, а затем подвергали краткосрочному и длительному воздействию ультрафиолетового излучения и трех глазных токсинов. Дозы ультрафиолетового из...

Токсикологические исследования in vitro проводятся для прогнозирования токсического воздействия химических веществ и других агентов, которые могут вызвать повреждение клеток. При оценке токсичности для роговицы эпителиальные клетки роговицы человека (ГЦС) использовались в моделях для оценки этих эффектов 1,2,3,4. Эти модели обычно оценивают физиологические эффекты, такие как изменения метаболической активности клетки, пролиферация клеток и другие функции клеток, такие как производство и высвобождение воспалительных цитокинов. Для этих токсикологических исследований были отобраны клетки из различных источников для оценки повреждающего воздействия химических веществ и ультрафиолетового излучения на HCECs 2,3. Линии pHCEC доступны у компаний, которые предоставляют эти клетки из донорских тканей взрослых. Первичные клетки можно обработать диспазой и аккуратно соскоблить роговицу для посева5. Затем клетки проверяют на наличие вирусов и загрязнения, а затем отправляют криоконсервированными в 10% диметилсульфоксид.
Преимущество первичных клеточных линий заключается в том, что клетки генетически идентичны клеткам донора. Это идеально, так как модель in vitro должна максимально имитировать ткань in vivo . Недостатком первичных клеточных линий является то, что они имеют ограниченное количество клеточных делений или пассажей6. Ограниченное количество доступных клеток ограничивает количество экспериментов, которые могут быть проведены с одной первичной культурой, увеличивая стоимость экспериментов.
Иммортализированные клеточные линии также использовались в моделях токсичности клеточных культур. Однако, в отличие от первичной клеточной линии, полученной из ткани in vivo, иммортализированная клеточная линия была генетически изменена. Иммортализированные клетки создаются путем включения генов вируса в ДНК первичных клеток 6,7,8. Клетки с успешным включением вирусных генов отбираются для иммортализированной клеточной линии. Преимущество иммортализации заключается в том, что она допускает неограниченную быструю пролиферацию, предоставляя неограниченное количество клеток для проведения нескольких экспериментов с использованием одной и той же клеточной линии. Это обеспечивает согласованность между экспериментами и снижает стоимость.
В дополнение к изменениям в генах, которые ограничивали пролиферацию клеток, также могут происходить изменения в экспрессии генов критической функциональности9. Таким образом, недостатком использования иммортализированных клеток является то, что они могут больше не представлять исходные клетки in vivo с точки зрения их реакции на различные внешние раздражители10. Сравнения включали наблюдение токсического воздействия химических веществ на первичные и иммортализированные кератоциты роговицычеловека 11, а также на иммортализированные ГХЕК и первичные эпителиальные клеткироговицы кроликов 12. Сравнение воздействия токсинов на первичные кератоциты человека и иммортализированные кератоциты не показало существенных различий11. Используя методы, подробно описанные в этой статье, будет определена эффективность этих анализов для оценки токсичности УФ-излучения и глазных токсинов на pHCEC и iHCEC.
Были выбраны три глазных токсина, обычно используемых в анализах in vitro: BAK, H2 O2 и SDS. BAK представляет собой катионный консервант, обычно используемый в офтальмологических растворах 13,14,H 2 O2 обычно используется для дезинфекции контактных линз 15, а SDS представляет собой анионное поверхностно-активное вещество, содержащееся в моющих средствах и шампунях 14. Подобно глазным токсинам, УФ-излучение также может нанести значительный ущерб HCEC3. Кроме того, чрезмерное воздействие ультрафиолета может вызвать глазное заболевание, известное как фотокератит, характеризующееся симптомами слезотечения, светочувствительности и ощущения зернистости16.
Существует неограниченное количество первичных клеточных культур, которые могут быть использованы, и различные иммортализированные клеточные линии, которые были разработаны. Поэтому было проведено исследование для сравнения первичных HCEC с иммортализированной линией HCEC, чтобы определить сходства и различия между моделями, которые включают эти типы клеток.
В этом исследовании использовалась микроскопия для оценки возможных различий между pHCEC и iHCEC в физиологическом ответе клеток на ультрафиолетовое излучение и токсины. Также оценивалось влияние ультрафиолетового излучения и химических веществ на метаболическую активность клеток и высвобождение воспалительных цитокинов для двух клеточных линий. Важность определения различий между двумя клеточными линиями заключается в понимании оптимального использования этих клеточных линий для оценки: 1) влияния ультрафиолетового излучения на клетки, 2) воздействия токсинов на клетки и 3) результирующих изменений в метаболизме, жизнеспособности клеток и высвобождении клеточных цитокинов для будущих исследований.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>75 cm2 Vented Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354485</td>
			<td>This is the BioCoat brand, collagen-coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>costar</td>
			<td>3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alamarBlue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>dal 1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin Staining buffer solution</td>
			<td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V</td>
			<td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system</td>
			<td>Carl Zeiss Inc., Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 48 Well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354505</td>
			<td>This is the BioCoat brand, collagen-coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>CYT5MPV</td>
			<td>Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hycone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass bottom coverslips</td>
			<td>MatTek Corporation, Ashland, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Corneal Epithelial Cells</td>
			<td>University of Ottawa</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements:</td>
			<td>Millipore, Billerica, MA, USA</td>
			<td>SCMC001</td>
			<td>Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 &#956;M Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 &#956;g/mL rh Insulin, 5 &#956;g/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Dead calcien and ethidium homodimer</td>
			<td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument</td>
			<td>Rockville, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay</td>
			<td>Rockville, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Corneal Epithelial Cells</td>
			<td>Millipore, Billerica, MA, USA</td>
			<td>SCCE016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax fluorescence multi-well plate reader</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell disassociation solution)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12605036</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining the toxicity of uv radiation and chemicals on primary and immortalized human corneal epithelial cells

В данной статье описаны методы измерения токсичности ультрафиолетового (УФ) излучения и глазных токсинов на первичных (pHCEC) и иммортализированных (iHCEC) культурах эпителиальных клеток роговицы человека. Клетки подвергались воздействию ультрафиолетового излучения и токсических доз хлорида бензалкония (BAK), перекиси водорода (H2O2) и додецилсульфата натрия (SDS). Метаболическую активность измеряли с помощью метаболического анализа. Высвобождение воспалительных цитокинов измеряли с помощью мультиплексного интерлейкина (IL)-1β, IL-6, IL-8 и анализа фактора некроза опухоли-альфа (TNF-α), а жизнеспособность клеток оценивали с использованием флуоресцентных красителей.
Повреждающее действие ультрафиолета на метаболическую активность клеток и высвобождение цитокинов происходило через 5 минут воздействия ультрафиолета для iHCEC и 20 минут для pHCEC. Аналогичное процентное снижение метаболической активности iHCEC и pHCEC произошло после воздействия BAK, H2O2или SDS, и наиболее значительные изменения в высвобождении цитокинов произошли для IL-6 и IL-8. Микроскопия флуоресцентно окрашенных клеток, подвергшихся воздействию iHCEC и pHCEC BAK, показала гибель клеток при воздействии BAK 0,005%, хотя степень окрашивания этидия была выше в iHCEC, чем pHCEC. Используя несколько методов оценки токсических эффектов с помощью микроскопии, оценки метаболической активности и продукции цитокинов, токсичность ультрафиолетового излучения и химических токсинов может быть определена как для первичных, так и для иммортализированных клеточных линий.

Размер ячейки Первичные и иммортализированные HCEC визуализировали с помощью трех флуоресцентных красителей, которые отражают три различные стадии жизнеспособности клеток. Живые клетки зеленые (кальцеин-AM), мертвые клетки красные (гомодимер этидия-1), а апоптотические клетки ...

Watch this Scientific Journal Video about Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells at JoVE.com

Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells

В этой статье описываются процедуры, используемые для оценки токсичности УФ-излучения и химических токсинов на первичной и иммортализированной клеточной линии.

Определение токсичности УФ-излучения и химических веществ на первичных и иммортализированных эпителиальных клетках роговицы человека

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) ...

Этот метод может быть использован для оценки in vitro токсичности новых офтальмологических препаратов. Уточняя концентрации химических веществ и составов продуктов с использованием глазных клеток in vitro, можно свести к минимуму использование животных для оценки безопасности новых продуктов. Анализы in vitro оценивают конечные точки токсичности, которые не могут быть оценены in vivo, такие как определение влияния химического вещества на функцию митохондрий, целостность клеточной мембраны и активность ферментов.Оценка клеточной токсичности in vitro является ключом к пониманию потенциальных механизмов токсичности. Это необходимо для установления максимально допустимой дозы терапевтических химических веществ в глазу. Продемонстрирует процедуру Ниджани Нагаарудкумаран, исследователь из лаборатории Джонса.Начните с размещения как pHCEC, так и iHCEC на чашки Петри, покрытые коллагеновым покрытием, со стеклянной нижней крышкой в концентрации от 1 x 10 до 5-го с 1 миллилитром среды глазного эпителия человека или HOEM. Выращивайте pHCEC и iHCECs 1 набор культур в течение 24 часов и еще один набор в течение 48 часов в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа. После инкубации окрашивают клетки 500 микролитрами буферного раствора для окрашивания аннексина, содержащего 4 микромолярного кальцеина, 8 микромолярных гомодимеров этидия 1 и аннексин 5, в течение 20 минут при 37 градусах Цельсия.После окрашивания клеток отрегулируйте конфокальный лазерный сканирующий микроскоп для захвата длин волн возбуждения и излучения, как описано в текстовой рукописи. Получите двухмерные и трехмерные изображения, следуя инструкциям в рукописи. Засейте клетки в соотношении от 5 x 10 до 4-го на миллилитр HOEM в каждую лунку 24-луночной культуральной пластины, покрытой коллагеном 1, и инкубируйте при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа в течение 3 часов.После инкубации уменьшите объем среды в лунках до 300 микролитров. Затем подвергните клетки воздействию UVA-излучения при 6,48 Вт на квадратный метр и UVB-излучения при 1,82 Вт на квадратный метр при 37 градусах Цельсия в течение 5 и 20 минут в отдельных экспериментах. После УФ-излучения добавьте 200 микролитров свежего HOEM в каждую лунку и инкубируйте в течение 20 часов при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа.На следующий день соберите надосадочную жидкость клетки в каждую лунку и переложите ее в стерильные полипропиленовые пробирки объемом 2 миллилитра. Заморозьте надосадочную жидкость при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Чтобы определить уровни цитокинов, высвобождаемых pHCEC и iHCEC после воздействия ультрафиолета, используйте мультиплексный анализ цитокинов и следуйте инструкциям набора для количественного определения интерлейкина 6, интерлейкина 8, интерлейкина-1 бета и TNF-альфа.Приготовьте 10%-ный реагент метаболического анализа в DMEM и F12. Замените питательную среду в каждой лунке 1 миллилитром 10%-ного раствора для метаболического анализа и инкубируйте при 37 градусах Цельсия с 5%-ным углекислым газом в течение 4 часов. Измерьте флуоресценцию каждого раствора с помощью считывателя флуоресцентных пластин при возбуждении 530 нанометров и длине волны излучения 590 нанометров.Семенные клетки в соотношении 5 x 10 до четверти на миллилитр HOEM в каждой лунке 24-луночной культуральной пластины, покрытой коллагеном 1. Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа в течение 3 часов. После инкубации удалите среду и подвергните клетки воздействию 1 миллилитра химических токсинов, которые включают 0,001% хлорида бензалкония или BAK, 0,01% перекиси водорода и 0,0025% додецилсульфата натрия в PBS в течение 5 и 15 минут.После воздействия химических токсинов удалите токсины из лунок, промойте 1 миллилитром PBS и добавьте 1 миллилитр HOEM в каждую лунку. После 20 часов инкубации проведите метаболический анализ, заменив среду 1 миллилитром 10%-ного раствора для метаболического анализа и инкубируя при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа в течение 4 часов. Измерьте флуоресценцию каждого раствора с помощью считывателя флуоресцентных пластин при возбуждении 530 нм и длине волны излучения 590 нм.Переложите надосадочные жидкости клеток из лунок после 20-часовой инкубации в отдельные стерильные полипропиленовые пробирки объемом 2 миллилитра и заморозьте их при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Используйте ту же мультиплексную платформу, которая используется для оценки цитокинов из клеток, обработанных УФ-излучением, в соответствии с инструкциями набора для количественного определения интерлейкина 6, интерлейкина 8, интерлейкина-1 бета и ФНО-альфа. Затравочные клетки в концентрации от 1 x 10 до 5-го на миллилитр HOEM в каждой лунке 24-луночной культуральной пластины, покрытой коллагеном 1, и инкубируют при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа в течение 24 часов.После инкубации удалите среду и подвергните клетки воздействию 1 миллилитра химических токсинов, в том числе 0,001% BAK, 0,005% BAK и 0,01% BAK в PBS в течение 5 минут. После воздействия удалите химические токсины, промойте лунки 1 миллилитром PBS и добавьте по 1 миллилитру HOEM в каждую лунку. После 20 часов инкубации окрашивают клетки 500 микролитрами буферного раствора для окрашивания аннексина, содержащего кальцеин, гомодимер этидия и аннексин 5, в течение 20 минут при 37 градусах Цельсия.Настройте микроскоп для измерения интенсивности при длинах волн возбуждения и излучения 630 и 675 нанометров для аннексина 5, 495 и 515 нанометров для кальцеина AM и 528 и 617 нанометров для окрашивания этидием 1. Затем получают изображения клеток с помощью флуоресцентного микроскопа. Было обнаружено, что iHCEC представляют собой небольшие клетки размером от 10 до 20 микрометров, а pHCEC находятся в диапазоне от 20 до 50 микрометров после 24 часов роста.Аналогичные различия в диапазоне размеров наблюдались для iHCEC и pHCEC после 48 часов роста. По сравнению с клетками, не подвергшимися воздействию ультрафиолета, метаболическая активность облученных pHCEC была значительно снижена через 20 минут воздействия. Для iHCEC метаболическая активность снижалась для клеток, облученных как через 5, так и через 20 минут.Следовательно, для снижения метаболической активности pHCEC требовалось больше времени воздействия, чем iHCEC. Максимальное высвобождение цитокинов iHCEC было через 5 минут воздействия ультрафиолета. Максимальное высвобождение цитокинов для pHCEC происходило через 20 минут воздействия ультрафиолета.С точки зрения общего количества высвобождаемых воспалительных цитокинов pHCEC высвобождают значительно больше интерлейкина-1 бета, интерлейкина 8 и TNF-альфа, чем iHCEC, тогда как iHCEC высвобождают больше интерлейкина 6. Как pHCEC, так и iHCEC показали изменение высвобождения интерлейкина 6 после воздействия всех трех химических веществ. БАК вызывал снижение высвобождения интерлейкина 6 по сравнению с контролем как для первичных, так и для иммортализированных ГХЕК.Перекись водорода вызывала увеличение высвобождения интерлейкина 6 из iHCEC и снижение высвобождения из pHCEC. Как pHCEC, так и iHCEC были значительно повреждены при 0,005% и 0,1% BAK. После проведения in vitro оценки токсичности глазных клеток могут быть предприняты дальнейшие модели глазной токсичности на животных для определения влияния глазного продукта на нервы роговицы или иммунную систему глаза.Эти методы необходимы для определения механизмов токсичности химических веществ и рецептур продуктов для глаз и помогут свести к минимуму использование животных для тестирования разработки продукта.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Первичные человеческие бронхиальные эпителиальные клетки, выращенных из эксплантов

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Количественная оценка γH2AX Очаги в ответ на ионизирующего излучения

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX following Ionizing Radiation

Оценка пространственного распределения γH2AX следующие ионизирующих излучений

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Анализ функций малого ГТФаз по микроинъекции Плазмиды в поляризованных эпителиальных клеток

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Экс Vivo культуры первичных человеческих маточных труб эпителиальных клеток

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Индукционные и анализ эпителиальных к мезенхимальных перехода

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Культивирование носа человека эпителиальных клеток в Военно-воздушной жидкость

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Количественное эндотелиальных клеток адгезивностью<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Анализ СПДК<em&gt; N</em&gt; -glycosylation И торговле человеческими клетками

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of ...

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

Многоклеточная альвеолярная модель человека, состоящая из эпителиальных клеток и первичных иммунных клеток для оценки опасности

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...