Name: determining the toxicity of uv radiation and chemicals on primary and immortalized human corneal epithelial cells
Uploaded: 2021-07-22T13:00:00
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1. Cultivo de pHCECs e iHCECs
<ol><li>Cultivar los pHCEC e iHCEC en medio epitelial ocular humano (HOEM) con los siguientes suplementos: 6 mM L-glutamina, 0,002% suplemento de medios celulares O (tabla de materiales), 1,0 μM de epinefrina, 0,4% suplemento de medios celulares P (tabla de materiales), 5 μg/ml de insulina rh, 5 μg/ml de apotransferrina y 100 ng/ml de hemisuccinato de hidrocortisona en matraces de cultivo recubiertos de colágeno-1 (18 ml en un matraz de cultivo de 75 c...

<ol>
	<li>McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+human+corneal+epithelial+cell+line+for+screening+the+safety+of+contact+lens+care+solutions+in+vitro.">Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro.</a> Eye &amp; Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).</li><li>Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+effects+of+ophthalmic+solutions+on+human+corneal+epithelial+cells+using+fluorescent+dyes.">Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).</li><li>Youn, H. Y., McCanna, D. J., Sivak, J. G., Jones, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+ultraviolet-induced+damage+in+human+corneal,+lens,+and+retinal+pigment+epithelial+cells.">In vitro ultraviolet-induced damage in human corneal, lens, and retinal pigment epithelial cells.</a> Molecular Vision. 17, 237-246 (2011).</li><li>Hakkarainen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+cytotoxic+effects+of+marketed+ophthalmic+formulations+on+human+corneal+epithelial+cells.">Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells.</a> International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).</li><li>Spurr, S. J., Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+corneal+epithelium+with+Dispase+II+or+EDTA.+Effects+on+the+basement+membrane+zone.">Isolation of corneal epithelium with Dispase II or EDTA. Effects on the basement membrane zone.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 26 (6), 818-827 (1985).</li><li>Kahn, C. R., Young, E., Lee, I. H., Rhim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+corneal+epithelial+primary+cultures+and+cell+lines+with+extended+life+span:+in+vitro+model+for+ocular+studies.">Human corneal epithelial primary cultures and cell lines with extended life span: in vitro model for ocular studies.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 34 (12), 3429-3441 (1993).</li><li>Araki-Sasaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+SV40-immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+its+characterization.">An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).</li><li>Griffith, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+human+corneal+equivalents+constructed+from+cell+lines.">Functional human corneal equivalents constructed from cell lines.</a> Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).</li><li>Toouli, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+mammary+epithelial+cells+immortalized+by+simian+virus+40+T-Antigen+or+by+the+telomerase+catalytic+subunit.">Comparison of human mammary epithelial cells immortalized by simian virus 40 T-Antigen or by the telomerase catalytic subunit.</a> Oncogene. 21 (1), 128-139 (2002).</li><li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines:+Valuable+tools+or+useless+artifacts.">Cell lines: Valuable tools or useless artifacts.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li><li>Zorn-Kruppa, M., Tykhonova, S., Belge, G., Diehl, H. A., Engelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+corneal+cell+cultures+in+cytotoxicity+testing.">Comparison of human corneal cell cultures in cytotoxicity testing.</a> Altex. 21 (3), 129-134 (2004).</li><li>Huhtala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+an+immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+rabbit+corneal+epithelial+cell+culture+in+cytotoxicity+testing.">Comparison of an immortalized human corneal epithelial cell line and rabbit corneal epithelial cell culture in cytotoxicity testing.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 18 (2), 163-175 (2002).</li><li>Pisella, P. J., Fillacier, K., Elena, P. P., Debbasch, C., Baudouin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+effects+of+preserved+and+unpreserved+formulations+of+timolol+on+the+ocular+surface+of+albino+rabbits.">Comparison of the effects of preserved and unpreserved formulations of timolol on the ocular surface of albino rabbits.</a> Ophthalmic Research. 32 (1), 3-8 (2000).</li><li>Youn, H. Y., Moran, K. L., Oriowo, O. M., Bols, N. C., Sivak, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactant+and+UV-B-induced+damage+of+the+cultured+bovine+lens.">Surfactant and UV-B-induced damage of the cultured bovine lens.</a> Toxicology in vitro. 18 (6), 841-852 (2004).</li><li>Hughes, R., Kilvington, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+hydrogen+peroxide+contact+lens+disinfection+systems+and+solutions+against+Acanthamoeba+polyphaga.">Comparison of hydrogen peroxide contact lens disinfection systems and solutions against Acanthamoeba polyphaga.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (7), 2038-2043 (2001).</li><li>Delic, N. C., Lyons, J. G., Di Girolamo, N., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damaging+effects+of+ultraviolet+radiation+on+the+cornea.">Damaging effects of ultraviolet radiation on the cornea.</a> Photochemistry and Photobiology. 93 (4), 920-929 (2017).</li><li>Ahuja, D., Saenz-Robles, M. T., Pipas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SV40+large+T+antigen+targets+multiple+cellular+pathways+to+elicit+cellular+transformation.">SV40 large T antigen targets multiple cellular pathways to elicit cellular transformation.</a> Oncogene. 24 (52), 7729-7745 (2005).</li><li>Tong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pin1+inhibits+PP2A-mediated+Rb+dephosphorylation+in+regulation+of+cell+cycle+and+S-phase+DNA+damage.">Pin1 inhibits PP2A-mediated Rb dephosphorylation in regulation of cell cycle and S-phase DNA damage.</a> Cell Death &amp; Disease. 6, 1640 (2015).</li><li>Muller, P. A., Vousden, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+mutations+in+cancer.">p53 mutations in cancer.</a> Nature Cell Biology. 15 (1), 2-8 (2013).</li><li>Seshacharyulu, P., Pandey, P., Datta, K., Batra, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatase:+PP2A+structural+importance,+regulation+and+its+aberrant+expression+in+cancer.">Phosphatase: PP2A structural importance, regulation and its aberrant expression in cancer.</a> Cancer Letters. 335 (1), 9-18 (2013).</li><li>Yang, D., Okamura, H., Morimoto, H., Teramachi, J., Haneji, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+2A+Calpha+regulates+proliferation,+migration,+and+metastasis+of+osteosarcoma+cells.">Protein phosphatase 2A Calpha regulates proliferation, migration, and metastasis of osteosarcoma cells.</a> Laboratory nvestigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1050-1062 (2016).</li><li>Xie, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+and+inactivation+of+the+PP2A+complex+promotes+the+proliferation+and+angiogenesis+of+hemangioma+endothelial+cells+through+activating+AKT+and+ERK.">Disruption and inactivation of the PP2A complex promotes the proliferation and angiogenesis of hemangioma endothelial cells through activating AKT and ERK.</a> Oncotarget. 6 (28), 25660-25676 (2015).</li><li>Mallet, J. D., Rochette, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wavelength-dependent+ultraviolet+induction+of+cyclobutane+pyrimidine+dimers+in+the+human+cornea.">Wavelength-dependent ultraviolet induction of cyclobutane pyrimidine dimers in the human cornea.</a> Photochemical &amp; Photobiological Sciences. 12 (8), 1310-1318 (2013).</li><li>Cejkova, J., Cejka, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+oxidative+stress+in+corneal+diseases+and+injuries.">The role of oxidative stress in corneal diseases and injuries.</a> Histology and Histopathology. 30 (8), 893-900 (2015).</li><li>Wang, S. Q., Balagula, Y., Osterwalder, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoprotection:+a+review+of+the+current+and+future+technologies.">Photoprotection: a review of the current and future technologies.</a> Dermatologic Therapy. 23 (1), 31-47 (2010).</li><li>Svobodova, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+after+acute+exposure+of+mice+skin+to+physiological+doses+of+UVB+and+UVA+light.">DNA damage after acute exposure of mice skin to physiological doses of UVB and UVA light.</a> Archives of Dermatological Research. 304 (5), 407-412 (2012).</li><li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+irradiation+induces+the+production+of+multiple+cytokines+by+human+corneal+cells.">Ultraviolet irradiation induces the production of multiple cytokines by human corneal cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 38 (12), 2483-2491 (1997).</li><li>Kode, A., Yang, S. R., Rahman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+cigarette+smoke+on+oxidative+stress+and+proinflammatory+cytokine+release+in+primary+human+airway+epithelial+cells+and+in+a+variety+of+transformed+alveolar+epithelial+cells.">Differential effects of cigarette smoke on oxidative stress and proinflammatory cytokine release in primary human airway epithelial cells and in a variety of transformed alveolar epithelial cells.</a> Respiratory Research. 7, 132 (2006).</li><li>Epstein, S. P., Chen, D., Asbell, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+biomarkers+of+inflammation+in+response+to+benzalkonium+chloride+on+corneal+and+conjunctival+epithelial+cells.">Evaluation of biomarkers of inflammation in response to benzalkonium chloride on corneal and conjunctival epithelial cells.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 25 (5), 415-424 (2009).</li></ol>

Se evaluaron las diferencias potenciales en el uso de dos tipos de HCEC. Las células se colocaron en el mismo medio (HOEM) en concentraciones idénticas de células y luego se expusieron a períodos cortos y largos de radiación UV y tres toxinas oculares. Las dosis de radiación UV y productos químicos se seleccionaron en función de sus efectos fisiológicos, que eran lo suficientemente dañinos para las células como para producir respuestas intermedias que pudieran compararse. Los tiempos de exposición de 5 y 20 m...

Los estudios de toxicología in vitro se realizan para predecir los efectos tóxicos de los productos químicos y otros agentes que pueden causar daño a las células. En la evaluación de la toxicidad para la córnea, se han utilizado células epiteliales corneales humanas (HCEC) en modelos para evaluar estos efectos 1,2,3,4. Estos modelos generalmente evalúan los efectos fisiológicos, como los cambios en la actividad metabólica de la célula, la proliferación celular y otras funciones celulares, como la producción y liberación de citoquinas inflamatorias. Para estos estudios toxicológicos, se han seleccionado células de diversas fuentes para evaluar los efectos nocivos de los productos químicos y la radiación UV sobre los HCEC 2,3. Las líneas pHCEC están disponibles en compañías que proporcionan estas células a partir de tejidos de donantes de adultos. Las células primarias pueden tratarse con dispasa y raspar suavemente la córnea para el cultivo5. Luego, las células se analizan para detectar virus y contaminación y luego se envían criopreservadas en dimetilsulfóxido al 10%.
La ventaja de las líneas celulares primarias es que las células son genéticamente idénticas a las células del donante. Esto es ideal, ya que un modelo in vitro debe imitar el tejido in vivo tanto como sea posible. La desventaja de las líneas celulares primarias es que tienen un número limitado de divisiones celulares o pasajes6. El número limitado de células disponibles restringe el número de experimentos que se pueden realizar con un solo cultivo primario, lo que aumenta el costo de los experimentos.
Las líneas celulares inmortalizadas también se han utilizado en modelos de toxicidad por cultivo celular. Sin embargo, a diferencia de la línea celular primaria obtenida del tejido in vivo, la línea celular inmortalizada ha sido alterada genéticamente. Las células inmortalizadas se crean incorporando los genes de un virus en el ADN de las células primarias 6,7,8. Las células con incorporación exitosa de genes virales se seleccionan para la línea celular inmortalizada. La ventaja de la inmortalización es que permite una proliferación rápida indefinida, proporcionando un número ilimitado de células para realizar múltiples experimentos utilizando la misma línea celular. Esto permite la consistencia entre los experimentos y reduce el costo.
Además de los cambios en los genes que limitaron la proliferación celular, también podrían ocurrir cambios en la expresión de genes de funcionalidad crítica9. Por lo tanto, la desventaja de utilizar células inmortalizadas es que ya no pueden representar las células originales in vivo en términos de su respuesta a diversos estímulos externos10. Las comparaciones han implicado observar los efectos tóxicos de los productos químicos sobre los queratocitos corneales humanos primarios e inmortalizados11, así como sobre los HCEC inmortalizados y las células primarias epiteliales corneales del conejo12. La comparación entre los efectos de las toxinas sobre los queratocitos humanos primarios y los queratocitos inmortalizados no mostró diferencias significativas11. Utilizando los métodos detallados en este artículo, se determinará la efectividad de estos ensayos para evaluar la toxicidad de la radiación UV y las toxinas oculares en pHCEC e iHCEC.
Se seleccionaron tres toxinas oculares comúnmente utilizadas en ensayos in vitro: BAK,H2O2y SDS. BAK es un conservante catiónico comúnmente utilizado en soluciones oftálmicas 13,14,H2O2se usa comúnmente para desinfectar lentes de contacto 15, y SDS es un tensioactivo aniónico que se encuentra en detergentes y champús 14. Al igual que las toxinas oculares, la radiación UV también puede causar daños significativos a los HCEC3. Además, la sobreexposición a los rayos UV puede causar una condición ocular conocida como fotoqueratitis caracterizada por síntomas de lagrimeo, sensibilidad a la luz y una sensación de arenilla16.
Hay un número ilimitado de cultivos celulares primarios que se pueden utilizar y varias líneas celulares inmortalizadas que se han desarrollado. Por lo tanto, se realizó una investigación para comparar los HCEC primarios con una línea de HCEC inmortalizada para determinar similitudes y diferencias entre los modelos que incorporan este tipo de células.
Esta investigación utilizó microscopía para evaluar las posibles diferencias entre pHCEC e iHCEC en la respuesta fisiológica celular a los rayos UV y las toxinas. También se evaluaron los efectos de la radiación UV y los productos químicos sobre la actividad metabólica celular y la liberación de citoquinas inflamatorias para las dos líneas celulares. La importancia de determinar las diferencias entre las dos líneas celulares es comprender el uso óptimo de estas líneas celulares para evaluar: 1) el efecto de la radiación UV en las células, 2) los efectos de las toxinas en las células y 3) los cambios resultantes en el metabolismo, la viabilidad celular y la liberación de citoquinas celulares para estudios futuros.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>75 cm2 Vented Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354485</td>
			<td>This is the BioCoat brand, collagen-coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>costar</td>
			<td>3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alamarBlue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>dal 1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin Staining buffer solution</td>
			<td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V</td>
			<td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system</td>
			<td>Carl Zeiss Inc., Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 48 Well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354505</td>
			<td>This is the BioCoat brand, collagen-coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>CYT5MPV</td>
			<td>Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hycone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass bottom coverslips</td>
			<td>MatTek Corporation, Ashland, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Corneal Epithelial Cells</td>
			<td>University of Ottawa</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements:</td>
			<td>Millipore, Billerica, MA, USA</td>
			<td>SCMC001</td>
			<td>Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 &#956;M Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 &#956;g/mL rh Insulin, 5 &#956;g/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Dead calcien and ethidium homodimer</td>
			<td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument</td>
			<td>Rockville, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay</td>
			<td>Rockville, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Corneal Epithelial Cells</td>
			<td>Millipore, Billerica, MA, USA</td>
			<td>SCCE016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax fluorescence multi-well plate reader</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell disassociation solution)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12605036</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining the toxicity of uv radiation and chemicals on primary and immortalized human corneal epithelial cells

Este artículo describe los métodos para medir la toxicidad de la radiación ultravioleta (UV) y las toxinas oculares en cultivos primarios (pHCEC) e inmortalizados (iHCEC) de células epiteliales corneales humanas. Las células fueron expuestas a radiación UV y dosis tóxicas de cloruro de benzalconio (BAK), peróxido de hidrógeno (H2O2) y dodecil sulfato de sodio (SDS). La actividad metabólica se midió mediante un ensayo metabólico. La liberación de citoquinas inflamatorias se midió mediante un ensayo de interleucina múltiple (IL)-1β, IL-6, IL-8 y factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), y se evaluó la viabilidad de las células utilizando tintes fluorescentes.
Los efectos dañinos de los rayos UV sobre la actividad metabólica celular y la liberación de citoquinas ocurrieron a los 5 min de exposición UV para iHCEC y 20 min para pHCEC. Caídas porcentuales similares en la actividad metabólica de iHCEC y pHCEC ocurrieron después de la exposición a BAK,H2O2 o SDS, y los cambios más significativos en la liberación de citoquinas ocurrieron para IL-6 e IL-8. La microscopía de células expuestas a iHCEC y pHCEC BIC teñidas con fluorescencia mostró muerte celular al 0,005% de exposición a BAK, aunque el grado de tinción de etidio fue mayor en los iHCEC que en los pHCEC. Utilizando múltiples métodos para evaluar los efectos tóxicos utilizando microscopía, evaluaciones de la actividad metabólica y producción de citoquinas, se pudo determinar la toxicidad de la radiación UV y las toxinas químicas tanto para las líneas celulares primarias como para las inmortalizadas.

Tamaño de la celda Los HCEC primarios e inmortalizados se visualizaron con tres colorantes fluorescentes, que reflejan tres etapas diferentes de viabilidad celular. Las células vivas son verdes (calceína-AM), las células muertas son rojas (ethidium homodimer-1) y las células apoptóticas son amarillas (anexina V-color ajustado por computadora para una mejor visualización de la señal de fluorescencia). Las células vivas contienen esterasas en el citoplasma celular y convierten la calceína-AM e...

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Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells

Este artículo describe los procedimientos utilizados para evaluar la toxicidad de la radiación UV y las toxinas químicas en una línea celular primaria e inmortalizada.

Determinación de la toxicidad de la radiación UV y los productos químicos en las células epiteliales corneales humanas primarias e inmortalizadas

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) ...

Este método se puede utilizar para evaluar in vitro la toxicidad de nuevas formulaciones de productos oftálmicos. Al refinar las concentraciones de productos químicos y formulaciones de productos utilizando células oculares in vitro, se puede minimizar el uso de animales para evaluar la seguridad de nuevos productos. Los ensayos in vitro evalúan los criterios de valoración de toxicidad que no se pueden evaluar in vivo, como determinar el efecto de una sustancia química sobre la función mitocondrial, la integridad de la membrana celular y la actividad enzimática.Evaluar la toxicidad celular in vitro es clave para comprender los posibles mecanismos de toxicidad. Esto es esencial para establecer una dosis máxima tolerable de productos químicos terapéuticos en el ojo. Demostrando el procedimiento estará Nijani Nagaarudkumaran, un investigador del Laboratorio Jones.Comience colocando tanto pHCEC como iHCEC en placas de Petri recubiertas de colágeno con hojas de cubierta inferior de vidrio a una concentración de 1 x 10 a la 5ª con 1 mililitro de medio de epitelio ocular humano, o HOEM. Cultivar pHCECs e iHCECs 1 conjunto de cultivos durante 24 horas y otro conjunto durante 48 horas en una incubadora de 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. Después de la incubación, tiñe las células con 500 microlitros de solución tampón de tinción de anexina que contiene 4 calceína micromolar, 8 homodímeros de etidio micromolar 1 y anexina 5 durante 20 minutos a 37 grados centígrados.Después de teñir las células, ajuste el microscopio de escaneo láser confocal para capturar las longitudes de onda de excitación y emisión, como se describe en el texto manuscrito. Obtenga las imágenes bidimensionales y tridimensionales siguiendo las instrucciones del manuscrito. Sembrar las células a 5 x 10 a 4 por mililitro de HOEM en cada pocillo de una placa de cultivo recubierta de colágeno 1 de 24 pocillos e incubar a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 3 horas.Después de la incubación, reduzca el volumen del medio en los pozos a 300 microlitros. A continuación, exponga las células a la radiación UVA a 6,48 vatios por metro cuadrado, y la radiación UVB a 1,82 vatios por metro cuadrado a 37 grados centígrados durante 5 y 20 minutos en experimentos separados. Después de la radiación UV, agregue 200 microlitros de HOEM fresco a cada pozo e incube durante 20 horas a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono.Al día siguiente, recoja el sobrenadante celular en cada pocillo y transfiéralo a tubos estériles de polipropileno de 2 mililitros. Congele el sobrenadante a menos 80 grados centígrados. Para determinar los niveles de citoquinas liberados por los pHCEC e iHCEC después de la exposición a los rayos UV, use un ensayo de citoquinas multiplex y siga las instrucciones del kit para cuantificar la interleucina 6, la interleucina 8, la interleucina-1 beta y el TNF-alfa.Preparar un reactivo de ensayo metabólico al 10% en DMEM y F12. Reemplace el medio de cultivo en cada pocillo con 1 mililitro de la solución de ensayo metabólico al 10% e incubar a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 4 horas. Mida la fluorescencia de cada solución utilizando un lector de placas fluorescentes a 530 nanómetros de excitación y 590 nanómetros de longitud de onda de emisión.Células de semilla de 5 x 10 a cuarto por mililitro de HOEM en cada pocillo de una placa de cultivo recubierta de colágeno 1 de 24 pocillos. Incubar a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 3 horas. Después de la incubación, retire el medio y exponga las células a 1 mililitro de toxinas químicas, que incluyen cloruro de benzalconio al 0,001%, o BAK, peróxido de hidrógeno al 0,01% y dodecil sulfato de sodio al 0,0025% en PBS durante 5 y 15 minutos.Después de la exposición a las toxinas químicas, retire las toxinas de los pozos, enjuague con 1 mililitro de PBS y agregue 1 mililitro de HOEM a cada pozo. Después de 20 horas de incubación, realice un ensayo metabólico reemplazando el medio con 1 mililitro de una solución de ensayo metabólico al 10% e incubando a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 4 horas. Mida la fluorescencia de cada solución utilizando un lector de placas fluorescentes a 530 nanómetros de excitación y longitudes de onda de emisión de 590 nanómetros.Transfiera los sobrenadantes celulares de los pozos después de la incubación de 20 horas en tubos de polipropileno estériles de 2 mililitros separados y congélelos a menos 80 grados centígrados. Utilice la misma plataforma multiplex utilizada para evaluar las citoquinas de las células tratadas con UV siguiendo las instrucciones del kit para cuantificar la interleucina 6, la interleucina 8, la interleucina-1 beta y el TNF-alfa. Semillas de células de 1 x 10 a 5 por mililitro de HOEM en cada pocillo de una placa de cultivo recubierta de colágeno de 24 pocillos 1 e incubar a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 24 horas.Después de la incubación, retire el medio y exponga las células a 1 mililitro de toxinas químicas, incluyendo 0.001% BAK, 0.005% BAK y 0.01% BAK en PBS durante 5 minutos. Después de la exposición, elimine las toxinas químicas, enjuague los pocillos con 1 mililitro de PBS y agregue 1 mililitro de HOEM a cada pocillo. Después de 20 horas de incubación, tiñe las células con 500 microlitros de solución tampón de tinción de anexina que contiene calceína, homodímero de etidio y anexina 5 durante 20 minutos a 37 grados centígrados.Ajuste el microscopio para medir intensidades en longitudes de onda de excitación y emisión de 630 y 675 nanómetros para la anexina 5, 495 y 515 nanómetros para la calceína AM, y 528 y 617 nanómetros para la tinción de etidio 1. Luego adquiera imágenes de las células usando el microscopio de fluorescencia. Se encontró que los iHCEC eran células pequeñas que varían de 10 a 20 micrómetros y los pHCEC estaban en el rango de 20 a 50 micrómetros después de 24 horas de crecimiento.Se observaron diferencias similares en el rango de tamaño para iHCEC y pHCEC después de 48 horas de crecimiento. En comparación con las células no expuestas a los rayos UV, la actividad metabólica de los pHCEC irradiados se redujo significativamente a los 20 minutos de exposición. Para los iHCEC, la actividad metabólica disminuyó para las células irradiadas a los 5 y 20 minutos.Por lo tanto, se necesitó un tiempo de exposición más largo para reducir la actividad metabólica de los pHCEC que de los iHCEC. La liberación máxima de citoquinas por los iHCEC fue a los 5 minutos de exposición a los rayos UV. La liberación máxima de citoquinas para los pHCEC ocurrió a los 20 minutos de exposición a los rayos UV.En términos de cantidades totales de citoquinas inflamatorias liberadas, las pHCEC liberaron sustancialmente más interleucina-1 beta, interleucina 8 y TNF-alfa que las iHCEC, mientras que las iHCEC liberaron más interleucina 6. Tanto los pHCEC como los iHCEC mostraron un cambio en la liberación de interleucina 6 después de la exposición a los tres productos químicos. BAK causó una disminución en la liberación de interleucina 6 en comparación con el control para HCEC primarios e inmortalizados.El peróxido de hidrógeno causó un aumento en la liberación de interleucina 6 de iHCECs y una disminución en la liberación de pHCECs. Tanto los pHCEC como los iHCEC se dañaron significativamente al 0,005% y al 0,1% del BAK. Después de realizar evaluaciones in vitro de la toxicidad de las células oculares, se podrían realizar otros modelos animales de toxicidad ocular para determinar el efecto de un producto ocular sobre los nervios corneales o el sistema inmunitario ocular.Estas técnicas son esenciales para determinar los mecanismos de toxicidad química y de formulación de productos en el ojo y ayudarán a minimizar el uso de animales para las pruebas de desarrollo de productos.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Primaria células epiteliales bronquiales Cultivada a partir de explantes

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Investigación

Biología

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

La cuantificación de γH2AX focos en respuesta a la radiación ionizante

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX following Ionizing Radiation

Evaluación de la distribución espacial de la radiación ionizante γH2AX siguientes

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

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El análisis de la función de las pequeñas GTPasas de la microinyección de plásmidos en células epiteliales polarizadas

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

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One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

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Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of ...

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

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