Name: determining the toxicity of uv radiation and chemicals on primary and immortalized human corneal epithelial cells
Uploaded: 2021-07-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells at JoVE.com

Författarna fick ingen finansiering för detta arbete.

1. Odling av pHCEC och iHCEC
<ol><li>Odla pHCECs och iHCECs i humant okulärt epitelmedium (HOEM) med följande tillskott: 6 mM L-glutamin, 0,002% cellmediatillskott O (Materialförteckning), 1,0 μM epinefrin, 0,4% cellmediatillskott P (Materialförteckning), 5 μg / ml rh insulin, 5 μg / ml apo-transferrin och 100 ng / ml hydrokortisonhemisuccinat i kollagen-1-belagda odlingskolvar (18 ml i en 75 cm2 kulturkolv).</li>
	<li>Byt medium i kolvarna var 2-3: e dag genom att ta...

<ol>
	<li>McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+human+corneal+epithelial+cell+line+for+screening+the+safety+of+contact+lens+care+solutions+in+vitro.">Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro.</a> Eye &amp; Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).</li><li>Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+effects+of+ophthalmic+solutions+on+human+corneal+epithelial+cells+using+fluorescent+dyes.">Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).</li><li>Youn, H. Y., McCanna, D. J., Sivak, J. G., Jones, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+ultraviolet-induced+damage+in+human+corneal,+lens,+and+retinal+pigment+epithelial+cells.">In vitro ultraviolet-induced damage in human corneal, lens, and retinal pigment epithelial cells.</a> Molecular Vision. 17, 237-246 (2011).</li><li>Hakkarainen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+cytotoxic+effects+of+marketed+ophthalmic+formulations+on+human+corneal+epithelial+cells.">Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells.</a> International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).</li><li>Spurr, S. J., Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+corneal+epithelium+with+Dispase+II+or+EDTA.+Effects+on+the+basement+membrane+zone.">Isolation of corneal epithelium with Dispase II or EDTA. Effects on the basement membrane zone.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 26 (6), 818-827 (1985).</li><li>Kahn, C. R., Young, E., Lee, I. H., Rhim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+corneal+epithelial+primary+cultures+and+cell+lines+with+extended+life+span:+in+vitro+model+for+ocular+studies.">Human corneal epithelial primary cultures and cell lines with extended life span: in vitro model for ocular studies.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 34 (12), 3429-3441 (1993).</li><li>Araki-Sasaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+SV40-immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+its+characterization.">An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).</li><li>Griffith, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+human+corneal+equivalents+constructed+from+cell+lines.">Functional human corneal equivalents constructed from cell lines.</a> Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).</li><li>Toouli, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+mammary+epithelial+cells+immortalized+by+simian+virus+40+T-Antigen+or+by+the+telomerase+catalytic+subunit.">Comparison of human mammary epithelial cells immortalized by simian virus 40 T-Antigen or by the telomerase catalytic subunit.</a> Oncogene. 21 (1), 128-139 (2002).</li><li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines:+Valuable+tools+or+useless+artifacts.">Cell lines: Valuable tools or useless artifacts.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li><li>Zorn-Kruppa, M., Tykhonova, S., Belge, G., Diehl, H. A., Engelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+corneal+cell+cultures+in+cytotoxicity+testing.">Comparison of human corneal cell cultures in cytotoxicity testing.</a> Altex. 21 (3), 129-134 (2004).</li><li>Huhtala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+an+immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+rabbit+corneal+epithelial+cell+culture+in+cytotoxicity+testing.">Comparison of an immortalized human corneal epithelial cell line and rabbit corneal epithelial cell culture in cytotoxicity testing.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 18 (2), 163-175 (2002).</li><li>Pisella, P. J., Fillacier, K., Elena, P. P., Debbasch, C., Baudouin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+effects+of+preserved+and+unpreserved+formulations+of+timolol+on+the+ocular+surface+of+albino+rabbits.">Comparison of the effects of preserved and unpreserved formulations of timolol on the ocular surface of albino rabbits.</a> Ophthalmic Research. 32 (1), 3-8 (2000).</li><li>Youn, H. Y., Moran, K. L., Oriowo, O. M., Bols, N. C., Sivak, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactant+and+UV-B-induced+damage+of+the+cultured+bovine+lens.">Surfactant and UV-B-induced damage of the cultured bovine lens.</a> Toxicology in vitro. 18 (6), 841-852 (2004).</li><li>Hughes, R., Kilvington, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+hydrogen+peroxide+contact+lens+disinfection+systems+and+solutions+against+Acanthamoeba+polyphaga.">Comparison of hydrogen peroxide contact lens disinfection systems and solutions against Acanthamoeba polyphaga.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (7), 2038-2043 (2001).</li><li>Delic, N. C., Lyons, J. G., Di Girolamo, N., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damaging+effects+of+ultraviolet+radiation+on+the+cornea.">Damaging effects of ultraviolet radiation on the cornea.</a> Photochemistry and Photobiology. 93 (4), 920-929 (2017).</li><li>Ahuja, D., Saenz-Robles, M. T., Pipas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SV40+large+T+antigen+targets+multiple+cellular+pathways+to+elicit+cellular+transformation.">SV40 large T antigen targets multiple cellular pathways to elicit cellular transformation.</a> Oncogene. 24 (52), 7729-7745 (2005).</li><li>Tong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pin1+inhibits+PP2A-mediated+Rb+dephosphorylation+in+regulation+of+cell+cycle+and+S-phase+DNA+damage.">Pin1 inhibits PP2A-mediated Rb dephosphorylation in regulation of cell cycle and S-phase DNA damage.</a> Cell Death &amp; Disease. 6, 1640 (2015).</li><li>Muller, P. A., Vousden, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+mutations+in+cancer.">p53 mutations in cancer.</a> Nature Cell Biology. 15 (1), 2-8 (2013).</li><li>Seshacharyulu, P., Pandey, P., Datta, K., Batra, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatase:+PP2A+structural+importance,+regulation+and+its+aberrant+expression+in+cancer.">Phosphatase: PP2A structural importance, regulation and its aberrant expression in cancer.</a> Cancer Letters. 335 (1), 9-18 (2013).</li><li>Yang, D., Okamura, H., Morimoto, H., Teramachi, J., Haneji, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+2A+Calpha+regulates+proliferation,+migration,+and+metastasis+of+osteosarcoma+cells.">Protein phosphatase 2A Calpha regulates proliferation, migration, and metastasis of osteosarcoma cells.</a> Laboratory nvestigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1050-1062 (2016).</li><li>Xie, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+and+inactivation+of+the+PP2A+complex+promotes+the+proliferation+and+angiogenesis+of+hemangioma+endothelial+cells+through+activating+AKT+and+ERK.">Disruption and inactivation of the PP2A complex promotes the proliferation and angiogenesis of hemangioma endothelial cells through activating AKT and ERK.</a> Oncotarget. 6 (28), 25660-25676 (2015).</li><li>Mallet, J. D., Rochette, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wavelength-dependent+ultraviolet+induction+of+cyclobutane+pyrimidine+dimers+in+the+human+cornea.">Wavelength-dependent ultraviolet induction of cyclobutane pyrimidine dimers in the human cornea.</a> Photochemical &amp; Photobiological Sciences. 12 (8), 1310-1318 (2013).</li><li>Cejkova, J., Cejka, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+oxidative+stress+in+corneal+diseases+and+injuries.">The role of oxidative stress in corneal diseases and injuries.</a> Histology and Histopathology. 30 (8), 893-900 (2015).</li><li>Wang, S. Q., Balagula, Y., Osterwalder, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoprotection:+a+review+of+the+current+and+future+technologies.">Photoprotection: a review of the current and future technologies.</a> Dermatologic Therapy. 23 (1), 31-47 (2010).</li><li>Svobodova, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+after+acute+exposure+of+mice+skin+to+physiological+doses+of+UVB+and+UVA+light.">DNA damage after acute exposure of mice skin to physiological doses of UVB and UVA light.</a> Archives of Dermatological Research. 304 (5), 407-412 (2012).</li><li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+irradiation+induces+the+production+of+multiple+cytokines+by+human+corneal+cells.">Ultraviolet irradiation induces the production of multiple cytokines by human corneal cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 38 (12), 2483-2491 (1997).</li><li>Kode, A., Yang, S. R., Rahman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+cigarette+smoke+on+oxidative+stress+and+proinflammatory+cytokine+release+in+primary+human+airway+epithelial+cells+and+in+a+variety+of+transformed+alveolar+epithelial+cells.">Differential effects of cigarette smoke on oxidative stress and proinflammatory cytokine release in primary human airway epithelial cells and in a variety of transformed alveolar epithelial cells.</a> Respiratory Research. 7, 132 (2006).</li><li>Epstein, S. P., Chen, D., Asbell, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+biomarkers+of+inflammation+in+response+to+benzalkonium+chloride+on+corneal+and+conjunctival+epithelial+cells.">Evaluation of biomarkers of inflammation in response to benzalkonium chloride on corneal and conjunctival epithelial cells.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 25 (5), 415-424 (2009).</li></ol>

Potentiella skillnader i användningen av två typer av HCECs bedömdes. Cellerna placerades i samma medium (HOEM) vid identiska koncentrationer av celler och utsattes sedan för korta och långa perioder av UV-strålning och tre okulära toxiner. Doser av UV-strålning och kemikalier valdes utifrån deras fysiologiska effekter, som var tillräckligt skadliga för cellerna för att producera mellanliggande svar som kunde jämföras. Exponeringstider på 5 och 20 min för UV-strålning och 5 och 15 minuter för de valda d...

In vitro toxikologiska studier utförs för att förutsäga de toxiska effekterna av kemikalier och andra medel som kan orsaka skador på celler. Vid bedömning av toxicitet för hornhinnan har humana hornhinneepitelceller (HCEC) använts i modeller för utvärdering av dessa effekter 1,2,3,4. Dessa modeller utvärderar typiskt fysiologiska effekter såsom förändringar i cellens metaboliska aktivitet, cellproliferation och andra cellfunktioner såsom produktion och frisättning av inflammatoriska cytokiner. För dessa toxikologiska studier har celler från olika källor valts ut för att bedöma de skadliga effekterna av kemikalier och UV-strålning på HCECs 2,3. pHCEC-linjer är tillgängliga från företag som tillhandahåller dessa celler från donatorvävnader hos vuxna. Primära celler kan behandlas med dispase och försiktigt skrapas av hornhinnan för odling5. Cellerna testas sedan för virus och kontaminering och skickas sedan kryokonserverade i 10% dimetylsulfoxid.
Fördelen med primära cellinjer är att cellerna är genetiskt identiska med donatorns celler. Detta är idealiskt, eftersom en in vitro-modell bör efterlikna in vivo-vävnaden så mycket som möjligt. Nackdelen med primära cellinjer är att de har ett begränsat antal celldelningar eller passager6. Det begränsade antalet tillgängliga celler begränsar antalet experiment som kan utföras med en enda primärkultur, vilket ökar kostnaden för experimenten.
Odödliga cellinjer har också använts i cellodlingstoxicitetsmodeller. Men till skillnad från den primära cellinjen erhållen från in vivo-vävnad har den odödliga cellinjen förändrats genetiskt. Odödliga celler skapas genom att införliva generna av ett virus i DNA av primära celler 6,7,8. Celler med framgångsrik viral geninkorporering väljs ut för den odödliga cellinjen. Fördelen med odödliggörande är att det möjliggör obestämd snabb spridning, vilket ger ett obegränsat antal celler att utföra flera experiment med samma cellinje. Detta möjliggör konsekvens mellan experiment och minskar kostnaden.
Förutom förändringar i generna som begränsade cellproliferation kan förändringar i uttrycket av gener med kritisk funktionalitet också inträffa9. Därför är nackdelen med att använda odödliga celler att de kanske inte längre representerar de ursprungliga in vivo-cellerna när det gäller deras svar på olika yttre stimuli10. Jämförelser har involverat observation av de toxiska effekterna av kemikalier på primära och odödliga humana hornhinnekeratocyter11, liksom odödliga HCECs och kaninhornhinnans epiteliala primära celler12. Jämförelsen mellan effekterna av toxiner på primära humana keratocyter och odödliga keratocyter visade inga signifikanta skillnader11. Med hjälp av de metoder som beskrivs i denna artikel kommer effektiviteten av dessa analyser för att bedöma toxiciteten hos UV-strålning och okulära toxiner på pHCECs och iHCECs att bestämmas.
Tre okulära toxiner som vanligen används i in vitro-analyser valdes: BAK,H2O2och SDS. BAK är ett katjoniskt konserveringsmedel som vanligtvis används i oftalmiska lösningar 13,14, H2O2används vanligtvis för att desinficera kontaktlinser 15 och SDS är ett anjoniskt ytaktivt medel som finns i tvättmedel och schampon 14. I likhet med ögontoxiner kan UV-strålning också orsaka betydande skador på HCECs3. Dessutom kan överexponering för UV orsaka ett okulärt tillstånd som kallas fotokeratit som kännetecknas av symtom på rivning, ljuskänslighet och en känsla av grusighet16.
Det finns ett obegränsat antal primära cellkulturer som kan användas och olika odödliga cellinjer som har utvecklats. Därför genomfördes en undersökning för att jämföra primära HCECs med en odödlig HCEC-linje för att bestämma likheter och skillnader mellan modeller som innehåller dessa typer av celler.
Denna undersökning använde mikroskopi för att bedöma möjliga skillnader mellan pHCECs och iHCECs på cellfysiologiskt svar på UV och toxiner. Effekterna av UV-strålning och kemikalier på cellmetabolisk aktivitet och inflammatorisk cytokinfrisättning för de två cellinjerna utvärderades också. Vikten av att bestämma skillnaderna mellan de två cellinjerna är att förstå den optimala användningen av dessa cellinjer för att utvärdera: 1) effekten av UV-strålning på celler, 2) effekterna av toxiner på celler och 3) de resulterande förändringarna i metabolism, cellviabilitet och cellcytokinfrisättning för framtida studier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>75 cm2 Vented Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354485</td>
			<td>This is the BioCoat brand, collagen-coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>costar</td>
			<td>3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alamarBlue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>dal 1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin Staining buffer solution</td>
			<td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V</td>
			<td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system</td>
			<td>Carl Zeiss Inc., Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 48 Well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354505</td>
			<td>This is the BioCoat brand, collagen-coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>CYT5MPV</td>
			<td>Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hycone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass bottom coverslips</td>
			<td>MatTek Corporation, Ashland, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Corneal Epithelial Cells</td>
			<td>University of Ottawa</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements:</td>
			<td>Millipore, Billerica, MA, USA</td>
			<td>SCMC001</td>
			<td>Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 &#956;M Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 &#956;g/mL rh Insulin, 5 &#956;g/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Dead calcien and ethidium homodimer</td>
			<td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument</td>
			<td>Rockville, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay</td>
			<td>Rockville, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Corneal Epithelial Cells</td>
			<td>Millipore, Billerica, MA, USA</td>
			<td>SCCE016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax fluorescence multi-well plate reader</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell disassociation solution)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12605036</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining the toxicity of uv radiation and chemicals on primary and immortalized human corneal epithelial cells

Denna artikel beskriver metoderna för att mäta toxiciteten hos ultraviolett (UV) strålning och okulära toxiner på primära (pHCEC) och odödliggjorda (iHCEC) humana hornhinneepitelcellkulturer. Cellerna utsattes för UV-strålning och toxiska doser av bensalkoniumklorid (BAK), väteperoxid (H2O2) och natriumdodecylsulfat (SDS). Metabolisk aktivitet mättes med hjälp av en metabolisk analys. Frisättningen av inflammatoriska cytokiner mättes med användning av en multiplex interleukin (IL) -1β, IL-6, IL-8 och tumörnekrosfaktor-alfa (TNF-α) analys, och celler utvärderades för livskraft med användning av fluorescerande färgämnen.
De skadliga effekterna av UV på cellmetabolisk aktivitet och cytokinfrisättning inträffade vid 5 minuters UV-exponering för iHCEC och 20 min för pHCEC. Liknande procentuella minskningar av metabolisk aktivitet hos iHCEC och pHCEC inträffade efter exponering för BAK,H2O2eller SDS, och de mest signifikanta förändringarna i cytokinfrisättning inträffade för IL-6 och IL-8. Mikroskopi av fluorescerande färgade iHCEC- och pHCEC BAK-exponerade celler visade celldöd vid 0,005% BAK-exponering, även om graden av etidiumfärgning var större i iHCECs än pHCEC. Genom att använda flera metoder för att bedöma toxiska effekter med hjälp av mikroskopi, bedömningar av metabolisk aktivitet och cytokinproduktion kunde toxiciteten hos UV-strålning och kemiska toxiner bestämmas för både primära och odödliga cellinjer.

Cellstorlek De primära och odödliga HCECs visualiserades med tre fluorescerande färgämnen, som återspeglar tre olika stadier av cellviabilitet. Levande celler är gröna (calcein-AM), döda celler är röda (etidium homodimer-1) och apoptotiska celler är gula (annexin V-datorjusterad färg för bättre visualisering av fluorescenssignalen). Levande celler innehåller esteraser i cellcytoplasman och omvandlar kalcein-AM till kalcein. Döda celler har cellmembran som är permeabla för etidiumhomo...

Watch this Scientific Journal Video about Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells at JoVE.com

Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells

Denna artikel beskriver de förfaranden som används för att utvärdera toxiciteten hos UV-strålning och kemiska toxiner på en primär och odödliggjord cellinje.

Bestämning av toxiciteten hos UV-strålning och kemikalier på primära och odödliggjorda humana hornhinneepitelceller

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) ...

Denna metod kan användas för att in vitro utvärdera toxiciteten hos nya oftalmiska produktformuleringar. Genom att förfina koncentrationerna av kemikalier och produktformuleringar med hjälp av okulära celler in vitro kan användningen av djur för att bedöma ny produktsäkerhet minimeras. In vitro-analyser utvärderar endpoints av toxicitet som inte kan bedömas in vivo, såsom bestämning av effekten av en kemikalie på mitokondriell funktion, cellmembranintegritet och enzymaktivitet.Utvärdera celltoxicitet in vitro är nyckeln till att förstå potentiella mekanismer för toxicitet. Detta är viktigt för att fastställa en maximal tolerabel dos av terapeutiska kemikalier i ögat. Nijani Nagaarudkumaran, forskare från Jones Laboratory, demonstrerar proceduren.Börja med att placera både pHCEC och iHCECs på kollagenbelagda petriskålar med glasbottenlock i en koncentration av 1 x 10 till 5: e med 1 ml humant okulärt epitelmedium eller HOEM. Odla pHCECs och iHCECs 1 uppsättning kulturer i 24 timmar och en annan uppsättning i 48 timmar i en 37-graders Celsius-inkubator med 5% koldioxid. Efter inkubation färgas cellerna med 500 mikroliter annexinfärgningsbuffertlösning innehållande 4 mikromolar kalcein, 8 mikromolär etidiumhomodimer 1 och bilaga 5 i 20 minuter vid 37 grader Celsius.Efter färgning av cellerna, justera det konfokala laserskanningsmikroskopet för att fånga excitations- och emissionsvåglängderna, som beskrivs i textmanuskriptet. Hämta de tvådimensionella och tredimensionella bilderna enligt instruktionerna i manuskriptet. Frö cellerna vid 5 x 10 till 4: e per milliliter HOEM i varje brunn av en 24-brunns kollagen 1 belagd odlingsplatta och inkubera vid 37 grader Celsius med 5% koldioxid i 3 timmar.Efter inkubation, minska volymen av mediet i brunnarna till 300 mikroliter. Därefter utsätter cellerna för UVA-strålning vid 6,48 watt per kvadratmeter och UVB-strålning vid 1,82 watt per kvadratmeter vid 37 grader Celsius i 5 och 20 minuter i separata experiment. Efter UV-strålning, tillsätt 200 mikroliter färsk HOEM till varje brunn och inkubera i 20 timmar vid 37 grader Celsius med 5% koldioxid.Nästa dag, samla cellsupernatanten i varje brunn och överför den till sterila 2-milliliter polypropenrör. Frys supernatanten vid minus 80 grader Celsius. För att bestämma cytokinnivåerna som frigörs av pHCECs och iHCECs efter UV-exponering, använd en multiplex cytokinanalys och följ satsens instruktioner för att kvantifiera interleukin 6, interleukin 8, interleukin-1 beta och TNF-alfa.Bered 10% metaboliskt analysreagens i DMEM och F12. Byt ut odlingsmediet i varje brunn med 1 ml av den 10% metaboliska analyslösningen och inkubera vid 37 grader Celsius med 5% koldioxid i 4 timmar. Mät fluorescensen för varje lösning med hjälp av en fluorescerande plattläsare vid 530 nanometer excitation och 590 nanometer emissionsvåglängder.Fröceller vid 5 x 10 till fjärde per milliliter HOEM i varje brunn av en 24-brunns kollagen 1-belagd odlingsplatta. Inkubera vid 37 grader Celsius med 5% koldioxid i 3 timmar. Efter inkubation, avlägsna mediet och exponera cellerna för 1 ml kemiska toxiner, som inkluderar 0,001% bensalkoniumklorid eller BAK, 0,01% väteperoxid och 0,0025% natriumdodecylsulfat i PBS i 5 och 15 minuter.Efter exponering för kemiska toxiner, ta bort gifterna från brunnarna, skölj med 1 ml PBS och tillsätt 1 ml HOEM till varje brunn. Efter 20 timmars inkubation, utför en metabolisk analys genom att ersätta mediet med 1 ml av en 10% metabolisk analyslösning och inkubera vid 37 grader Celsius med 5% koldioxid i 4 timmar. Mät fluorescensen för varje lösning med hjälp av en fluorescerande plattläsare vid 530 nanometer excitation och 590 nanometer emissionsvåglängder.Överför cellsupernatanterna från brunnarna efter 20-timmars inkubation till separata sterila 2-milliliter polypropenrör och frys dem vid minus 80 grader Celsius. Använd samma multiplexplattform som används för att bedöma cytokinerna från de UV-behandlade cellerna enligt satsens instruktioner för att kvantifiera interleukin 6, interleukin 8, interleukin-1 beta och TNF-alfa. Fröceller vid 1 x 10 till 5: e per milliliter HOEM i varje brunn i en 24-brunns kollagen 1 belagd odlingsplatta och inkubera vid 37 grader Celsius med 5% koldioxid i 24 timmar.Efter inkubation, avlägsna mediet och exponera cellerna för 1 ml kemiska toxiner, inklusive 0,001% BAK, 0,005% BAK och 0,01% BAK i PBS i 5 minuter. Efter exponering, ta bort de kemiska toxinerna, skölj brunnarna med 1 ml PBS och tillsätt 1 ml HOEM till varje brunn. Efter 20 timmars inkubation, färga cellerna med 500 mikroliter annexinfärgningsbuffertlösning innehållande kalcein, etidiumhomodimer och annexin 5 i 20 minuter vid 37 grader Celsius.Justera mikroskopet för att mäta intensiteter vid excitations- och emissionsvåglängder på 630 och 675 nanometer för annexin 5, 495 och 515 nanometer för calcein AM och 528 och 617 nanometer för etidium 1-färgning. Skaffa sedan bilder av cellerna med hjälp av fluorescensmikroskopet. iHCECs visade sig vara små celler som sträcker sig från 10 till 20 mikrometer och pHCECs var i intervallet 20 till 50 mikrometer efter 24 timmars tillväxt.Liknande skillnader i storleksintervall observerades för iHCECs och pHCECs efter 48 timmars tillväxt. Jämfört med de icke-UV-exponerade cellerna minskade den metaboliska aktiviteten hos bestrålade pHCECs signifikant vid 20 minuters exponering. För iHECs minskade den metaboliska aktiviteten för celler som bestrålades vid både 5 och 20 minuter.Därför tog det längre exponeringstid att minska den metaboliska aktiviteten hos pHCECs än iHCEC. Den maximala cytokinfrisättningen av iHCECs var vid 5 minuters UV-exponering. Den maximala cytokinfrisättningen för pHCECs inträffade vid 20 minuters UV-exponering.När det gäller totala mängder inflammatoriska cytokiner frigörs pHCECs betydligt mer interleukin-1 beta, interleukin 8 och TNF-alfa än iHCEC, medan iHCECs släppte mer interleukin 6. Både pHCEC och iHCECs visade en förändring i frisättningen av interleukin 6 efter exponering för alla tre kemikalierna. BAK orsakade en minskning av frisättningen av interleukin 6 jämfört med kontrollen för både primära och odödliga HCEC.Väteperoxid orsakade en ökning av frisättningen av interleukin 6 från iHCEC, och en minskning av frisättningen från pHCEC. Både pHCEC och iHCEC skadades avsevärt vid 0,005 % och 0,1 % av BAK. Efter in vitro-bedömningar av ögoncellstoxicitet kan ytterligare djurmodeller av okulär toxicitet göras för att bestämma effekten av en okulär produkt på hornhinnans nerver eller ögonimmunsystemet.Dessa tekniker är viktiga för att bestämma mekanismerna för kemisk och produktformuleringstoxicitet på ögat och kommer att bidra till att minimera djuranvändning för produktutvecklingstestning.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Primär mänskliga Bronkial epitelceller vuxit från explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Kvantifiering av γH2AX Foci som svar på joniserande strålning

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX following Ionizing Radiation

Utvärdering av den geografiska fördelningen av γH2AX efter joniserande strålning

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Analysera funktion Små GTPases genom mikroinjektion av plasmider till Polarized epitelceller

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex vivo Kultur av primära humana äggledaren epitelceller

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induktion och Analys av Epithelial till mesenkymala övergång

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Odling av Human Nasal epitelceller på Air Liquid Interface

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Kvantifiering av endotelceller Vidhäftnings<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Analys av SCAP<em&gt; N</em&gt; -glycosylation Och handel med mänskliga celler

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of ...

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

Flercelliga Human Alveolar modell sammansatt av epitelceller och primära immunceller för hazard Assessment

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...