Name: determining the toxicity of uv radiation and chemicals on primary and immortalized human corneal epithelial cells
Uploaded: 2021-07-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells at JoVE.com

Yazarlar bu çalışma için herhangi bir fon almadılar.

1. pHCEC'lerin ve iHCEC'lerin kültürü
<ol><li>İnsan oküler epitel besiyerinde (HOEM) pHCEC'leri ve iHCEC'leri aşağıdaki takviyelerle büyütün: 6 mM L-glutamin,% 0.002 hücre ortamı takviyesi O (Malzeme Tablosu), 1.0 μM epinefrin,% 0.4 hücre ortamı takviyesi P (Malzeme Tablosu), 5 μg / mL rh insülin, 5 μg / mL apo-transferrin ve kollajen-1 kaplı kültür şişelerinde 100 ng / mL hidrokortizon hemisuksinat (75cm2 kültür şişesinde 18 mL).</li>
	<li>Şişe...

<ol>
	<li>McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+human+corneal+epithelial+cell+line+for+screening+the+safety+of+contact+lens+care+solutions+in+vitro.">Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro.</a> Eye &amp; Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).</li><li>Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+effects+of+ophthalmic+solutions+on+human+corneal+epithelial+cells+using+fluorescent+dyes.">Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).</li><li>Youn, H. Y., McCanna, D. J., Sivak, J. G., Jones, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+ultraviolet-induced+damage+in+human+corneal,+lens,+and+retinal+pigment+epithelial+cells.">In vitro ultraviolet-induced damage in human corneal, lens, and retinal pigment epithelial cells.</a> Molecular Vision. 17, 237-246 (2011).</li><li>Hakkarainen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+cytotoxic+effects+of+marketed+ophthalmic+formulations+on+human+corneal+epithelial+cells.">Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells.</a> International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).</li><li>Spurr, S. J., Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+corneal+epithelium+with+Dispase+II+or+EDTA.+Effects+on+the+basement+membrane+zone.">Isolation of corneal epithelium with Dispase II or EDTA. Effects on the basement membrane zone.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 26 (6), 818-827 (1985).</li><li>Kahn, C. R., Young, E., Lee, I. H., Rhim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+corneal+epithelial+primary+cultures+and+cell+lines+with+extended+life+span:+in+vitro+model+for+ocular+studies.">Human corneal epithelial primary cultures and cell lines with extended life span: in vitro model for ocular studies.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 34 (12), 3429-3441 (1993).</li><li>Araki-Sasaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+SV40-immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+its+characterization.">An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).</li><li>Griffith, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+human+corneal+equivalents+constructed+from+cell+lines.">Functional human corneal equivalents constructed from cell lines.</a> Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).</li><li>Toouli, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+mammary+epithelial+cells+immortalized+by+simian+virus+40+T-Antigen+or+by+the+telomerase+catalytic+subunit.">Comparison of human mammary epithelial cells immortalized by simian virus 40 T-Antigen or by the telomerase catalytic subunit.</a> Oncogene. 21 (1), 128-139 (2002).</li><li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines:+Valuable+tools+or+useless+artifacts.">Cell lines: Valuable tools or useless artifacts.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li><li>Zorn-Kruppa, M., Tykhonova, S., Belge, G., Diehl, H. A., Engelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+corneal+cell+cultures+in+cytotoxicity+testing.">Comparison of human corneal cell cultures in cytotoxicity testing.</a> Altex. 21 (3), 129-134 (2004).</li><li>Huhtala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+an+immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+rabbit+corneal+epithelial+cell+culture+in+cytotoxicity+testing.">Comparison of an immortalized human corneal epithelial cell line and rabbit corneal epithelial cell culture in cytotoxicity testing.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 18 (2), 163-175 (2002).</li><li>Pisella, P. J., Fillacier, K., Elena, P. P., Debbasch, C., Baudouin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+effects+of+preserved+and+unpreserved+formulations+of+timolol+on+the+ocular+surface+of+albino+rabbits.">Comparison of the effects of preserved and unpreserved formulations of timolol on the ocular surface of albino rabbits.</a> Ophthalmic Research. 32 (1), 3-8 (2000).</li><li>Youn, H. Y., Moran, K. L., Oriowo, O. M., Bols, N. C., Sivak, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactant+and+UV-B-induced+damage+of+the+cultured+bovine+lens.">Surfactant and UV-B-induced damage of the cultured bovine lens.</a> Toxicology in vitro. 18 (6), 841-852 (2004).</li><li>Hughes, R., Kilvington, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+hydrogen+peroxide+contact+lens+disinfection+systems+and+solutions+against+Acanthamoeba+polyphaga.">Comparison of hydrogen peroxide contact lens disinfection systems and solutions against Acanthamoeba polyphaga.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (7), 2038-2043 (2001).</li><li>Delic, N. C., Lyons, J. G., Di Girolamo, N., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damaging+effects+of+ultraviolet+radiation+on+the+cornea.">Damaging effects of ultraviolet radiation on the cornea.</a> Photochemistry and Photobiology. 93 (4), 920-929 (2017).</li><li>Ahuja, D., Saenz-Robles, M. T., Pipas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SV40+large+T+antigen+targets+multiple+cellular+pathways+to+elicit+cellular+transformation.">SV40 large T antigen targets multiple cellular pathways to elicit cellular transformation.</a> Oncogene. 24 (52), 7729-7745 (2005).</li><li>Tong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pin1+inhibits+PP2A-mediated+Rb+dephosphorylation+in+regulation+of+cell+cycle+and+S-phase+DNA+damage.">Pin1 inhibits PP2A-mediated Rb dephosphorylation in regulation of cell cycle and S-phase DNA damage.</a> Cell Death &amp; Disease. 6, 1640 (2015).</li><li>Muller, P. A., Vousden, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+mutations+in+cancer.">p53 mutations in cancer.</a> Nature Cell Biology. 15 (1), 2-8 (2013).</li><li>Seshacharyulu, P., Pandey, P., Datta, K., Batra, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatase:+PP2A+structural+importance,+regulation+and+its+aberrant+expression+in+cancer.">Phosphatase: PP2A structural importance, regulation and its aberrant expression in cancer.</a> Cancer Letters. 335 (1), 9-18 (2013).</li><li>Yang, D., Okamura, H., Morimoto, H., Teramachi, J., Haneji, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+phosphatase+2A+Calpha+regulates+proliferation,+migration,+and+metastasis+of+osteosarcoma+cells.">Protein phosphatase 2A Calpha regulates proliferation, migration, and metastasis of osteosarcoma cells.</a> Laboratory nvestigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1050-1062 (2016).</li><li>Xie, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+and+inactivation+of+the+PP2A+complex+promotes+the+proliferation+and+angiogenesis+of+hemangioma+endothelial+cells+through+activating+AKT+and+ERK.">Disruption and inactivation of the PP2A complex promotes the proliferation and angiogenesis of hemangioma endothelial cells through activating AKT and ERK.</a> Oncotarget. 6 (28), 25660-25676 (2015).</li><li>Mallet, J. D., Rochette, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wavelength-dependent+ultraviolet+induction+of+cyclobutane+pyrimidine+dimers+in+the+human+cornea.">Wavelength-dependent ultraviolet induction of cyclobutane pyrimidine dimers in the human cornea.</a> Photochemical &amp; Photobiological Sciences. 12 (8), 1310-1318 (2013).</li><li>Cejkova, J., Cejka, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+oxidative+stress+in+corneal+diseases+and+injuries.">The role of oxidative stress in corneal diseases and injuries.</a> Histology and Histopathology. 30 (8), 893-900 (2015).</li><li>Wang, S. Q., Balagula, Y., Osterwalder, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoprotection:+a+review+of+the+current+and+future+technologies.">Photoprotection: a review of the current and future technologies.</a> Dermatologic Therapy. 23 (1), 31-47 (2010).</li><li>Svobodova, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+after+acute+exposure+of+mice+skin+to+physiological+doses+of+UVB+and+UVA+light.">DNA damage after acute exposure of mice skin to physiological doses of UVB and UVA light.</a> Archives of Dermatological Research. 304 (5), 407-412 (2012).</li><li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+irradiation+induces+the+production+of+multiple+cytokines+by+human+corneal+cells.">Ultraviolet irradiation induces the production of multiple cytokines by human corneal cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 38 (12), 2483-2491 (1997).</li><li>Kode, A., Yang, S. R., Rahman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+cigarette+smoke+on+oxidative+stress+and+proinflammatory+cytokine+release+in+primary+human+airway+epithelial+cells+and+in+a+variety+of+transformed+alveolar+epithelial+cells.">Differential effects of cigarette smoke on oxidative stress and proinflammatory cytokine release in primary human airway epithelial cells and in a variety of transformed alveolar epithelial cells.</a> Respiratory Research. 7, 132 (2006).</li><li>Epstein, S. P., Chen, D., Asbell, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+biomarkers+of+inflammation+in+response+to+benzalkonium+chloride+on+corneal+and+conjunctival+epithelial+cells.">Evaluation of biomarkers of inflammation in response to benzalkonium chloride on corneal and conjunctival epithelial cells.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 25 (5), 415-424 (2009).</li></ol>

İki tip HCEC'in kullanımındaki potansiyel farklılıklar değerlendirildi. Hücreler aynı ortama (HOEM) aynı hücre konsantrasyonlarında yerleştirildi ve daha sonra kısa ve uzun süreli UV radyasyonuna ve üç oküler toksine maruz bırakıldı. UV radyasyonu ve kimyasalların dozları, karşılaştırılabilecek ara tepkiler üretmek için hücrelere yeterince zarar veren fizyolojik etkilerine dayanarak seçildi. UV radyasyonu için 5 ve 20 dakika ve seçilen BAK (% 0.001), SDS (% 0.0025) ve H2O2(% 0....

Hücrelere zarar verebilecek kimyasalların ve diğer ajanların toksik etkilerini tahmin etmek için in vitro toksikoloji çalışmaları yapılmaktadır. Korneaya toksisitenin değerlendirilmesinde, insan kornea epitel hücreleri (HCEC'ler) bu etkilerin değerlendirilmesi için modellerde kullanılmıştır 1,2,3,4. Bu modeller tipik olarak hücrenin metabolik aktivitesindeki değişiklikler, hücre proliferasyonu ve enflamatuar sitokinlerin üretimi ve salınımı gibi diğer hücre fonksiyonları gibi fizyolojik etkileri değerlendirir. Bu toksikoloji çalışmaları için, kimyasalların ve UV radyasyonunun HCEC'ler üzerindeki zararlı etkilerini değerlendirmek için çeşitli kaynaklardan hücreler seçilmiştir 2,3. pHCEC hatları, bu hücreleri yetişkinlerin donör dokularından sağlayan şirketlerden temin edilebilir. Birincil hücreler dispaz ile tedavi edilebilir ve kültür5 için korneadan nazikçe kazınabilir. Hücreler daha sonra virüsler ve kontaminasyon açısından test edilir ve daha sonra% 10 dimetil sülfoksit içinde kriyokorunmuş olarak gönderilir.
Birincil hücre hatlarının avantajı, hücrelerin genetik olarak donörün hücreleriyle aynı olmasıdır. Bu idealdir, çünkü in vitro bir model in vivo dokuyu mümkün olduğunca taklit etmelidir. Birincil hücre hatlarının dezavantajı, sınırlı sayıda hücre bölünmesine veya pasajına sahip olmalarıdır6. Mevcut sınırlı sayıda hücre, tek bir birincil kültürle yapılabilecek deney sayısını kısıtlar ve deneylerin maliyetini artırır.
Ölümsüzleştirilmiş hücre hatları, hücre kültürü toksisite modellerinde de kullanılmıştır. Bununla birlikte, in vivo dokudan elde edilen birincil hücre hattının aksine, ölümsüzleştirilmiş hücre hattı genetik olarak değiştirilmiştir. Ölümsüzleştirilmiş hücreler, bir virüsün genlerinin birincil hücrelerin DNA'sına dahil edilmesiyle oluşturulur 6,7,8. Başarılı viral gen katılımına sahip hücreler, ölümsüzleştirilmiş hücre hattı için seçilir. Ölümsüzleştirmenin avantajı, sınırsız sayıda hücrenin aynı hücre hattını kullanarak birden fazla deney yapmasını sağlayarak sınırsız hızlı çoğalmaya izin vermesidir. Bu, deneyler arasında tutarlılık sağlar ve maliyeti azaltır.
Hücre proliferasyonunu sınırlayan genlerdeki değişikliklere ek olarak, kritik işlevselliğe sahip genlerin ekspresyonunda da değişiklikler meydana gelebilir9. Bu nedenle, ölümsüzleştirilmiş hücrelerin kullanılmasının dezavantajı, çeşitli dış uyaranlara tepkileri açısından orijinal in vivo hücreleri artık temsil edememeleridir10. Karşılaştırmalar, kimyasalların primer ve ölümsüzleştirilmiş insan kornea keratositleri11, ayrıca ölümsüzleştirilmiş HCEC'ler ve tavşan kornea epitelyal primer hücreleri12 üzerindeki toksik etkilerini gözlemlemeyi içermektedir. Toksinlerin primer insan keratositleri ile ölümsüzleştirilmiş keratositler üzerindeki etkileri arasındaki karşılaştırmada anlamlı bir fark görülmemiştir11. Bu makalede detaylandırılan yöntemler kullanılarak, UV radyasyonunun ve oküler toksinlerin pHCEC'ler ve iHCEC'ler üzerindeki toksisitesini değerlendirmek için bu testlerin etkinliği belirlenecektir.
İn vitro testlerde yaygın olarak kullanılan üç oküler toksin seçildi: BAK, H2,O2ve SDS. BAK, oftalmik çözeltilerde yaygın olarak kullanılan katyonik bir koruyucudur13,14, H2O2, kontakt lensleri dezenfekte etmek için yaygın olarak kullanılır15 ve SDS, deterjanlarda ve şampuanlarda bulunan anyonik bir yüzey aktif maddedir 14. Oküler toksinlere benzer şekilde, UV radyasyonu da HCEC'lerde önemli hasara neden olabilir3. Ek olarak, UV'ye aşırı maruz kalmak, yırtılma, ışık hassasiyeti ve kumluluk hissi belirtileri ile karakterize fotokeratit olarak bilinen bir oküler duruma neden olabilir16.
Kullanılabilecek sınırsız sayıda birincil hücre kültürü ve geliştirilmiş çeşitli ölümsüzleştirilmiş hücre hatları vardır. Bu nedenle, bu tip hücreleri içeren modeller arasındaki benzerlikleri ve farklılıkları belirlemek için birincil HCEC'leri ölümsüzleştirilmiş bir HCEC çizgisiyle karşılaştırmak için bir araştırma yapılmıştır.
Bu çalışmada, pHCEC'ler ve iHCEC'ler arasındaki UV ve toksinlere hücre fizyolojik yanıtı üzerindeki olası farklılıkları değerlendirmek için mikroskopi kullanılmıştır. UV radyasyonu ve kimyasallarının hücre metabolik aktivitesi ve iki hücre hattı için inflamatuar sitokin salınımı üzerindeki etkileri de değerlendirildi. İki hücre hattı arasındaki farklılıkları belirlemenin önemi, bu hücre hatlarının değerlendirmek için en uygun kullanımını anlamaktır: 1) UV radyasyonunun hücreler üzerindeki etkisi, 2) toksinlerin hücreler üzerindeki etkileri ve 3) gelecekteki çalışmalar için metabolizma, hücre canlılığı ve hücre sitokin salınımında ortaya çıkan değişiklikler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>75 cm2 Vented Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354485</td>
			<td>This is the BioCoat brand, collagen-coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>costar</td>
			<td>3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alamarBlue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>dal 1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin Staining buffer solution</td>
			<td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V</td>
			<td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system</td>
			<td>Carl Zeiss Inc., Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 48 Well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354505</td>
			<td>This is the BioCoat brand, collagen-coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>CYT5MPV</td>
			<td>Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hycone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass bottom coverslips</td>
			<td>MatTek Corporation, Ashland, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Corneal Epithelial Cells</td>
			<td>University of Ottawa</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements:</td>
			<td>Millipore, Billerica, MA, USA</td>
			<td>SCMC001</td>
			<td>Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 &#956;M Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 &#956;g/mL rh Insulin, 5 &#956;g/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Dead calcien and ethidium homodimer</td>
			<td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument</td>
			<td>Rockville, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay</td>
			<td>Rockville, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Corneal Epithelial Cells</td>
			<td>Millipore, Billerica, MA, USA</td>
			<td>SCCE016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax fluorescence multi-well plate reader</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell disassociation solution)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12605036</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining the toxicity of uv radiation and chemicals on primary and immortalized human corneal epithelial cells

Bu makalede, primer (pHCEC) ve ölümsüzleştirilmiş (iHCEC) insan kornea epitel hücre kültürleri üzerinde ultraviyole (UV) radyasyon ve oküler toksinlerin toksisitesini ölçme yöntemleri açıklanmaktadır. Hücreler UV radyasyonuna ve toksik dozlarda benzalkonyum klorür (BAK), hidrojen peroksit (H2O2) ve sodyum dodesil sülfat (SDS) dozlarına maruz bırakıldı. Metabolik aktivite metabolik bir tahlil kullanılarak ölçüldü. İnflamatuar sitokinlerin salınımı multipleks interlökin (IL)-1β, IL-6, IL-8 ve tümör nekroz faktörü-alfa (TNF-α) testi kullanılarak ölçüldü ve hücreler floresan boyalar kullanılarak canlılık açısından değerlendirildi.
UV'nin hücre metabolik aktivitesi ve sitokin salınımı üzerindeki zararlı etkileri, iHCEC için 5 dakika UV maruziyetinde ve pHCEC için 20 dakika UV maruziyetinde meydana gelmiştir. İHCEC ve pHCEC'in metabolik aktivitesindeki benzer yüzde düşüşleri, BAK, H2O2veya SDS'ye maruz kaldıktan sonra meydana geldi ve sitokin salınımındaki en önemli değişiklikler IL-6 ve IL-8 için meydana geldi. Floresan olarak boyanmış iHCEC ve pHCEC BAK'a maruz kalan hücrelerin mikroskopisi,% 0.005 BAK maruziyetinde hücre ölümü gösterdi, ancak iHCEC'lerde etidyum boyama derecesi pHCEC'lerden daha büyüktü. Mikroskopi kullanarak toksik etkileri değerlendirmek, metabolik aktivitenin değerlendirilmesi ve sitokin üretimi için birçok yöntem kullanılarak, UV radyasyonunun ve kimyasal toksinlerin toksisitesi hem birincil hem de ölümsüzleştirilmiş hücre hatları için belirlenebilir.

Hücre boyutu Birincil ve ölümsüzleştirilmiş HCEC'ler, hücre canlılığının üç farklı aşamasını yansıtan üç floresan boya ile görselleştirildi. Canlı hücreler yeşildir (kalsein-), ölü hücreler kırmızıdır (ethidium homodimer-1) ve apoptotik hücreler sarıdır (floresan sinyalinin daha iyi görselleştirilmesi için ek V-bilgisayar ayarlı renk). Canlı hücreler, hücre sitoplazmasında esterazlar içerir ve kalsein-'yi kalseine dönüştürür. Ölü hücreler, ethidium ...

Watch this Scientific Journal Video about Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells at JoVE.com

Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells

Bu makalede, birincil ve ölümsüzleştirilmiş bir hücre hattında UV radyasyonunun ve kimyasal toksinlerin toksisitesini değerlendirmek için kullanılan prosedürler açıklanmaktadır.

UV Radyasyonu ve Kimyasallarının Primer ve Ölümsüzleştirilmiş İnsan Kornea Epitel Hücreleri Üzerindeki Toksisitesinin Belirlenmesi

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) ...

Bu yöntem, yeni oftalmik ürün formülasyonlarının in vitro toksisitesini değerlendirmek için kullanılabilir. Oküler hücreler in vitro kullanılarak kimyasalların ve ürün formülasyonlarının konsantrasyonlarının rafine edilmesiyle, yeni ürün güvenliğini değerlendirmek için hayvanların kullanımı en aza indirilebilir. İn vitro testler, bir kimyasalın mitokondriyal fonksiyon, hücre zarı bütünlüğü ve enzim aktivitesi üzerindeki etkisini belirlemek gibi in vivo olarak değerlendirilemeyen toksisite son noktalarını değerlendirir.Hücre toksisitesini in vitro olarak değerlendirmek, potansiyel toksisite mekanizmalarını anlamanın anahtarıdır. Bu, gözde tolere edilebilir maksimum dozda terapötik kimyasalların oluşturulması için gereklidir. Prosedürü gösteren, Jones Laboratuvarı'ndan bir araştırmacı olan Nijani Nagaarudkumaran olacak.Hem pHCEC'leri hem de iHCEC'leri, 1 mililitre insan oküler epitel ortamı veya HOEM ile 1 x 10 ila 5. konsantrasyonda cam alt kapak kaymaları olan kollajen kaplı Petri kaplarına yerleştirerek başlayın. pHCEC'leri ve iHCEC'leri 24 saat boyunca 1 kültür seti ve 48 saat boyunca başka bir seti% 5 karbondioksit içeren 37 santigrat derecelik bir inkübatörde büyütün. İnkübasyondan sonra, hücreleri 4 mikromolar kalsein, 8 mikromolar ethidyum homodimer 1 ve anneksin 5 içeren 500 mikrolitre annexin boyama tampon çözeltisi ile 37 santigrat derecede 20 dakika boyunca boyayın.Hücreleri boyadıktan sonra, metin el yazmasında açıklandığı gibi uyarma ve emisyon dalga boylarını yakalamak için konfokal lazer tarama mikroskobunu ayarlayın. Makaledeki talimatları izleyerek iki boyutlu ve üç boyutlu görüntüleri elde edin. Hücreleri, 24 kuyucuklu kollajen 1 kaplı bir kültür plakasının her bir kuyucuğunda mililitre HOEM başına 5 x 10 ila 4. sırada tohumlayın ve 3 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin.İnkübasyondan sonra, kuyucuklardaki ortamın hacmini 300 mikrolitreye düşürün. Daha sonra, hücreleri ayrı deneylerde 5 ve 20 dakika boyunca metrekare başına 6.48 watt'ta UVA radyasyonuna ve 37 santigrat derecede metrekare başına 1.82 watt'ta UVB radyasyonuna maruz bırakın. UV radyasyonundan sonra, her bir kuyucuğa 200 mikrolitre taze HOEM ekleyin ve% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede 20 saat boyunca inkübe edin.Ertesi gün, hücre süpernatantını her bir kuyucukta toplayın ve steril 2 mililitrelik polipropilen tüplere aktarın. Süpernatantı eksi 80 santigrat derecede dondurun. UV maruziyetinden sonra pHCEC'ler ve iHCEC'ler tarafından salınan sitokin seviyelerini belirlemek için, bir multipleks sitokin testi kullanın ve interlökin 6, interlökin 8, interlökin-1 beta ve TNF-alfa'yı ölçmek için kitin talimatlarını izleyin.DMEM ve F12'de% 10 metabolik tahlil reaktifi hazırlayın. Her bir kuyucuktaki kültür ortamını% 10'luk metabolik tahlil çözeltisinin 1 mililitresi ile değiştirin ve 4 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Her çözeltinin floresansını 530 nanometre uyarma ve 590 nanometre emisyon dalga boylarında bir floresan plaka okuyucu kullanarak ölçün.24 kuyucuklu kollajen 1 kaplı kültür plakasının her bir kuyucuğunda mililitre HOEM başına 5 x 10 ila dördüncü tohum hücreleri. 3 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, ortamı çıkarın ve hücreleri% 0.001 benzalkonyum klorür veya BAK,% 0.01 hidrojen peroksit ve% 0.0025 sodyum dodesil sülfat içeren 1 mililitre kimyasal toksine maruz bırakın.Kimyasal toksinlere maruz kaldıktan sonra, toksinleri kuyucuklardan çıkarın, 1 mililitre PBS ile durulayın ve her bir oyuğa 1 mililitre HOEM ekleyin. 20 saatlik inkübasyondan sonra, ortamı% 10'luk bir metabolik tahlil çözeltisinin 1 mililitresi ile değiştirerek ve 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile 4 saat boyunca inkübe ederek metabolik bir tahlil gerçekleştirin. Her çözeltinin floresansını 530 nanometre uyarma ve 590 nanometre emisyon dalga boylarında bir floresan plaka okuyucu kullanarak ölçün.20 saatlik inkübasyonu takiben hücre süpernatantlarını kuyucuklardan ayrı steril 2 mililitrelik polipropilen tüplere aktarın ve eksi 80 santigrat derecede dondurun. İnterlökin 6, interlökin 8, interlökin-1 beta ve TNF-alfa'yı ölçmek için kitin talimatlarını izleyerek UV ile muamele edilmiş hücrelerden sitokinleri değerlendirmek için kullanılan aynı multipleks platformunu kullanın. 24 kuyucuklu kollajen 1 kaplı kültür plakasının her bir kuyucuğunda mililitre HOEM başına 1 x 10 ila 5. tohum hücreleri ve 24 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edilir.İnkübasyondan sonra, ortamı çıkarın ve hücreleri 5 dakika boyunca PBS'de% 0.001 BAK,% 0.005 BAK ve% 0.01 BAK dahil olmak üzere 1 mililitre kimyasal toksine maruz bırakın. Maruz kaldıktan sonra, kimyasal toksinleri çıkarın, kuyucukları 1 mililitre PBS ile durulayın ve her bir oyuğa 1 mililitre HOEM ekleyin. 20 saatlik inkübasyondan sonra, hücreleri 37 santigrat derecede 20 dakika boyunca kalsein, ethidyum homodimer ve eksin 5 içeren 500 mikrolitre ekin boyama tamponu çözeltisi ile boyayın.Ek 5, kalsein için 495 ve 515 nanometre ve ethidyum 1 boyama için 528 ve 617 nanometre uyarma ve emisyon dalga boylarındaki yoğunlukları ölçmek için mikroskobu ayarlayın. Daha sonra floresan mikroskobu kullanarak hücrelerin görüntülerini elde edin. İHCEC'lerin 10 ila 20 mikrometre arasında değişen küçük hücreler olduğu ve pHCEC'lerin 24 saatlik büyümeden sonra 20 ila 50 mikrometre aralığında olduğu bulundu.48 saatlik büyümeden sonra iHCEC'ler ve pHCEC'ler için boyut aralığında benzer farklılıklar gözlenmiştir. UV'ye maruz kalmayan hücrelerle karşılaştırıldığında, ışınlanmış pHCEC'lerin metabolik aktivitesi 20 dakikalık maruziyette önemli ölçüde azalmıştır. İHCEC'ler için, hem 5 hem de 20 dakikada ışınlanan hücreler için metabolik aktivite azalmıştır.Bu nedenle, pHCEC'lerin metabolik aktivitesini azaltmak iHCEC'lerden daha uzun bir maruz kalma süresi aldı. İHCEC'ler tarafından maksimum sitokin salınımı 5 dakikalık UV maruziyetinde idi. pHCEC'ler için maksimum sitokin salınımı 20 dakikalık UV maruziyetinde meydana geldi.Toplam inflamatuar sitokin miktarları açısından, pHCEC'ler iHCEC'lerden önemli ölçüde daha fazla interlökin-1 beta, interlökin 8 ve TNF-alfa salgılarken, iHCEC'ler daha fazla interlökin 6 salgıladı. Hem pHCEC'ler hem de iHCEC'ler, her üç kimyasala maruz kaldıktan sonra interlökin 6 salınımında bir değişiklik gösterdi. BAK, hem primer hem de ölümsüzleştirilmiş HCEC'lerin kontrolüne kıyasla interlökin 6 salınımında bir azalmaya neden olmuştur.Hidrojen peroksit, iHCEC'lerden interlökin 6 salınımında bir artışa ve pHCEC'lerden salınımda bir azalmaya neden olmuştur. Hem pHCEC'ler hem de iHCEC'ler BAK'ın %0.005'inde ve %0.1'inde önemli ölçüde hasar görmüştür. Oküler hücre toksisitesinin in vitro değerlendirmeleri yapıldıktan sonra, bir oküler ürünün kornea sinirleri veya oküler bağışıklık sistemi üzerindeki etkisini belirlemek için oküler toksisitenin başka hayvan modelleri de yapılabilir.Bu teknikler, gözdeki kimyasal ve ürün formülasyonu toksisitesinin mekanizmalarını belirlemek için gereklidir ve ürün geliştirme testleri için hayvan kullanımını en aza indirmeye yardımcı olacaktır.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Eksplantlar gelen Yetiştirilen İlköğretim İnsan Bronşiyal Epitel Hücreleri

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

İyonlaştırıcı Radyasyon Cevabı γH2AX Foci Kantitasyonu

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX following Ionizing Radiation

Radyasyondan aşağıdaki γH2AX Mekansal Dağılımı Değerlendirilmesi

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Polarize Epitel Hücreleri içine Plazmidler, Mikroenjeksiyon Küçük GTPases Fonksiyon Analizi

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Kültür İlköğretim İnsan Fallop Tüp Epitel Hücreleri

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Mezenkimal Geçiş indüksiyon ve Epitel Analizi

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Hava Sıvı Arayüz İnsan Burun Epitel Hücrelerinin ekimi

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Endotel Hücre yapışma miktarının belirlenmesi<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Scap analizi<em&gt; K</em&gt; İnsan Hücreleri -glycosylation ve Ticareti

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of ...

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

Tehlike Değerlendirmesi İçin Epitel Hücreleri ve Primer İmmün Hücrelerden Oluşan Çok Hücreli İnsan Alveoler Modeli

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...