Name: imaging dendritic spines in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2021-09-27T13:30:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

L'imaging e l'analisi su Imaris sono stati eseguiti nella Vanderbilt Cell Imaging Shared Resource (CIRS) supportata da NIH (CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 e EY08126). LSM 880 è supportato dalla sovvenzione 1S10OD201630. L'imaging su un disco rotante Nikon è stato eseguito presso il Nikon Center of Excellence. Ringraziamo Jenny Schafer, direttore del CISR, e Bryan Millis per la formazione e le discussioni approfondite e i membri del laboratorio Burnette: Dylan Burnette, Aidan Fenix e Nilay Taneja per i consigli. Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del National Institutes of Health a DMM (R01NS081259 e R01NS106951) e una sovvenzione dell'American Heart Association ad ACC (18PRE33960581).

1. Determinazione della struttura delle spine dendritiche DD
<ol><li>Creare vermi transgenici per etichettare le spine DD<ol><li>Utilizzare il promotore flp-13 per costruire un vettore di espressione per l'etichetta di interesse (ad esempio, mCherry citoplasmatico, MYR::mRuby, LifeAct::GFP, GFP::utrophin) (Figura 1). Vedere l'elenco completo dei plasmidi nel file supplementare 1.</li>
		<li>Utilizzare metodi consolidati per generare una linea transgenica che etichetta le spine DD 8,9.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare il sigillante<ol><li>Realizzare una miscela 1:1 di mezzo di incorporamento a base di paraffina10 (vedere Tabella dei materiali).</li>
		<li>Riscaldare il mezzo a 60 °C fino alla fusione, quindi aliquote in provette da microcentrifuga con tappo da 1,5 mL e mantenere un blocco riscaldante a 60-70 °C. NOTA: Il sigillante può durare per 4 settimane nel blocco di riscaldamento.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare un anestetico.<ol><li>Preparare soluzioni madre in H2O distillato di tricaina all'1% e levamisolo 1 M (vedi tabella dei materiali). Conservare a -20 °C.</li>
		<li>Preparare una soluzione di lavoro allo 0,05% di tricaina e 15 mM di anestetico levamisolo, come descritto nei punti 1.3.3-1.3.511.</li>
		<li>Mescolare 75 μL di 1% di tricaina e 22,5 μL di 1 M levamisolo.</li>
		<li>Aggiungere il buffer M9 a un volume finale di 1,5 ml.</li>
		<li>Aliquote 10 μL di tricaina allo 0,05%, 15 mM di levamisolo in provette da microcentrifuga da 0,5 mL e conservare a -20 °C. NOTA: La miscela anestetica è sensibile alla temperatura e le singole aliquote della soluzione di lavoro non devono essere ricongelate dopo lo scongelamento per ogni esperimento. Vedere il file supplementare 2 per una ricetta per il buffer M9.</li>
	</ol></li>
	<li>Acquisizione di immagini ad alta risoluzione<ol><li>Preparare il 10% di agarosio e mantenerlo a bagnomaria a 60 °C. NOTA: vedere il rapporto di Monica Driscoll in WormBook12.</li>
		<li>Montare 15-20 giovani adulti su tamponi di agarosio al 10% e aggiungere 3 μL di anestetico (vedi fase 3).</li>
		<li>Applicare il coprislip (i vermi vengono immobilizzati entro 5 minuti).</li>
		<li>Sigillare i bordi del vetrino con una miscela sigillante adesiva fusa (vedi Tabella dei materiali).</li>
		<li>Acquisire immagini<ol><li>Acquisizione in super-risoluzione<ol><li>Utilizzare un microscopio confocale a scansione laser dotato di microscopia a super-risoluzione con un obiettivo a olio Plan-Apochromat 63x/1.40 per ottenere una dimensione di pixel ridotta (ad esempio, < 50 nm). Acquisire Z-stack utilizzando la dimensione del passo consigliata dal software del produttore (vedere Tabella dei materiali).</li>
				<li>Raccogliere una serie di sezioni ottiche che coprono il volume totale del processo ventrale DD (ad esempio, 15-20 fette a 0,19 μm di dimensione del passo o 2-3μm di spessore). Invia Z-stacks per l'elaborazione delle immagini utilizzando il software del produttore e analizza le immagini con un punteggio superiore a 7 (Figura 1B, Figura 2 e Figura 3).</li>
			</ol></li>
			<li>Acquisizione di Nyquist<ol><li>Utilizzare un microscopio confocale a scansione laser per selezionare la dimensione ottimale dei pixel per la lunghezza d'onda della luce e l'apertura numerica dell'obiettivo in uso (ad esempio, obiettivo 40x/1.4 Plan Fluor oil). NOTA: La dimensione dei pixel più piccola rivelerà la struttura fine delle spine DD.</li>
				<li>Inviare stack per la deconvoluzione 3D utilizzando l'algoritmo automatico (vedere la tabella dei materiali) (Figura 3).</li>
			</ol></li>
			<li>Utilizzare il più piccolo Z-step possibile (ad esempio, determinato dallo stadio piezoelettrico) perché il sovracampionamento in Z può produrre immagini più nitide dopo la deconvoluzione 3D13.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Analisi delle immagini<ol><li>Utilizzare un software di elaborazione delle immagini appropriato (vedere Tabella dei materiali) per creare proiezioni di massima intensità degli Z-stacks14.</li>
		<li>Contare manualmente le sporgenze sul dendrite DD. NOTA: Le sporgenze sono estensioni perpendicolari dall'albero principale (Figura 1B, punte di freccia).</li>
		<li>Determinare la lunghezza del dendrite DD segnato per calcolare la densità delle spine per 10 μm di dendrite DD (Figura 1C).</li>
		<li>Classificare le spine come sottili/funghi, filopodiali, tozze o ramificate (Figura 2A). NOTA: Le spine sottili / fungo mostrano una base stretta (collo) e una punta più ampia (testa). Le spine filopodiali non mostrano una base ristretta (senza collo) ma hanno una larghezza costante. Le spine tozze hanno una base e una punta larghe. Le spine ramificate sono sporgenze con più di una punta.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Valutazione dell'attivazione delle spine dendritiche DD mediante segnalazione colinergica presinaptica
<ol><li>Creare vermi transgenici usando tecniche convenzionali (ad esempio, microiniezione)8,9<ol><li>Utilizzare il promotore flp-13 per guidare l'espressione del sensore Ca++ , GCaMP6s, nei neuroni DD e il promotore unc-4 per guidare l'espressione di Chrimson, una channelrhodopsina spostata verso il rosso, nei neuroni VA presinaptici (Figura 4A). Vedere l'elenco dei plasmidi nel file supplementare 1.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare All-trans Retinal (ATR) e piastre di controllo. NOTA: ATR è un cofattore necessario affinché Chrimson funzioni come canale ionico optogeneticamente attivato.<ol><li>Preparare una soluzione madre ATR da 100 mM in etanolo (100%). Conservare a -20 °C in 1 mL di aliquote.</li>
		<li>Sotto una cappa a flusso laminare, aggiungere 300 μL di coltura batterica OP50 durante la notte e 0,25 μL di ATR a ciascuna piastra di agar nutriente NGM (Nematode Growth Medium) da 60 mm e distribuire con una bacchetta di vetro sterile.</li>
		<li>Per i controlli, aggiungere 300 μL di batteri OP50 e 0,25 μL di etanolo (100%) a un gruppo separato di piastre NGM.</li>
		<li>Lasciare riposare le piastre nel cappuccio a temperatura ambiente per 24 ore (al riparo dalla luce ambientale) per consentire la crescita batterica. NOTA: Le piastre possono essere utilizzate dopo l'incubazione iniziale di 24 ore o mantenute a 4 °C per l'uso entro 5 giorni.</li>
	</ol></li>
	<li>Impostazione dell'esperimento<ol><li>Posizionare cinque larve dello stadio NC3569 L4 su ATR o piastre di controllo con semi OP50 che mancano di ATR e crescono nell'oscurità a 23 ° C.</li>
		<li>Tre giorni dopo, utilizzare un microscopio da dissezione stereoscopico per confermare lo sviluppo della vulva per selezionare la progenie dello stadio L4 da ATR e piastre di controllo per l'imaging come descritto nei passaggi 2.4.1-2.4.3.</li>
		<li>Su un vetrino da microscopio, posizionare 2 μL di poliperline da 0,05 μm (2,5% di solidi p/v) (vedi Tabella dei materiali).</li>
		<li>Utilizzare un filo di platino ("worm pick") per aggiungere un piccolo globulo di super colla alla soluzione e ruotare delicatamente per generare "fili" filamentosi di colla. Quindi aggiungere 3 μL di tampone M9 (Figura 4B).</li>
		<li>Posizionare circa dieci larve di L4 nella soluzione e applicare un vetrino. NOTA: le fibre di colla contatteranno casualmente i vermi e li immobilizzeranno dopo l'applicazione del vetrino. I vermi che sono incorporati in grandi globuli di colla appaiono essiccati e non dovrebbero essere fotografati.</li>
		<li>Sigillare i bordi del foglietto come indicato al punto 1.4.4.</li>
	</ol></li>
	<li>Registrazione di transitori Ca++ evocati in spine dendritiche.<ol><li>Utilizzare un microscopio confocale a disco rotante dotato di una telecamera CCD sensibile, un obiettivo a olio TIRF 100x e linee laser da 488 nm e 561 nm (vedi Tabella dei materiali).</li>
		<li>Regolare lo stadio del microscopio per posizionare le spine DD nel piano focale.</li>
		<li>Impostare l'acquisizione time-lapse per illuminare il campione con la linea laser a 488 nm ogni fotogramma (per rilevare la fluorescenza GCaMP6s) e la linea laser a 561 nm a intervalli periodici (per l'eccitazione Chrimson). NOTA: ad esempio, utilizzare la luce a 488 nm per acquisire istantanee consecutive (200 ms) del segnale GCaMP6s accoppiato con un impulso di 200 ms di luce di 561 nm ogni 5° fotogramma (Figura 4C-E). Con questa configurazione, i livelli di GCaMP prima e dopo ogni impulso a 561 nm vengono rilevati a ~1 s di distanza (200 ms di laser a 488 nm per rilevare GCaMP prima dell'attivazione di VA, 200 ms di impulso a 561 nm per attivare VA e ~600 ms per passare tra linee laser e filtri di emissione. Con questa configurazione, i neuroni VA vengono attivati ogni 2,5 s.</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi dell'imaging Ca++ in vivo<ol><li>Utilizzare la deconvoluzione 2D e l'allineamento dell'immagine per correggere deviazioni minori derivanti dal movimento della vite senza fine durante l'acquisizione (vedere Tabella dei materiali).</li>
		<li>Definire la colonna vertebrale dendritica DD come la regione di interesse (ROI nelle figure 4C-D).</li>
		<li>Duplicare il ROI e spostarlo in una regione vicina all'interno del worm per raccogliere il segnale di fondo (ad esempio, il rumore).</li>
		<li>Utilizzare il software appropriato (vedere Tabella dei materiali) per esportare le intensità GCaMP6s in Excel per ogni punto temporale. Sottrarre la fluorescenza di fondo dalla fluorescenza del ROI della colonna vertebrale.</li>
		<li>Determinare la variazione della fluorescenza sottraendo la fluorescenza GCaMP6s nel fotogramma immediatamente prima dell'eccitazione a 561 nm (F0) da ciascun punto temporale dopo l'eccitazione (ΔF), quindi dividendo per F0 per determinare ΔF/F0 (Figura 4E).</li>
		<li>Rappresentare graficamente le tracce normalizzate (vedere la tabella dei materiali).</li>
		<li>Eseguire un test statistico accoppiato per ogni misurazione della fluorescenza GCaMP6s prima e dopo ogni impulso di luce a 561 nm. NOTA: Questo approccio esclude efficacemente fluttuazioni casuali nella fluorescenza di GCaMP6s che altrimenti riducono il potere statistico del confronto del segnale medio GCaMP6s da tutte le misurazioni prima e dopo l'eccitazione a 561 nm (Figura 4F).</li>
		<li>Per le misurazioni che mostrano una distribuzione normale o gaussiana, utilizzare un test ANOVA parametrico accoppiato e correggere per confronti multipli per ciascuno dei due gruppi (ATR prima vs. dopo, nessun ATR prima vs. dopo). In alternativa, per i dati che non sono normalmente distribuiti, utilizzare un ANOVA non parametrico con correzione posthoc per test multipli. NOTA: i worm cresciuti su piastre prive di ATR ("no ATR") sono controlli necessari e non dovrebbero mostrare transitori Ca++ attivati a 561 nm perché ATR è richiesto per la funzione Chrimson.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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Elegans.</a> Elife. 7, 35692 (2018).</li><li>Oliver, D., Alexander, K., Francis, M. 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Non dichiariamo conflitti di interesse.

Il rivelatore Airyscan è stato selezionato per acquisire istantanee di spine DD perché offre un rapporto segnale-rumore più elevato e una risoluzione migliore rispetto ai microscopi confocali convenzionali 19,20. L'imaging AiryScan consente anche l'uso di proteine fluorescenti convenzionali (ad esempio, GFP, mCherry, ecc.), ora ampiamente disponibili per C. elegans. Sebbene immagini ad alta risoluzione possano essere ottenute con altri metodi di super-risoluzione (ad esempio, STORM, STED, PALM), questi metodi richiedono proteine fluorescenti foto-attivabili o foto-commutabili21. In alternativa ad Airyscan, si raccomandano microscopi confocali convenzionali. Ad esempio, l'imaging con acquisizione Nyquist (Figura 3) raggiunge la dimensione dei pixel utilizzando un obiettivo 40x/1,3 di 123,9 nm, sufficiente a distinguere i tipi morfologici della colonna vertebrale (Figura 2).
Per determinare la densità della colonna vertebrale, si raccomanda di utilizzare una proteina fluorescente citosolica come (1) mCherry o GFP, (2) LifeAct per marcare il citoscheletro di actina o (3) una proteina fluorescente miristoilata (ad esempio, MYR::mRuby) per marcare la membrana plasmatica (Figura 1B). In confronto, la proteina legante la F-actina Utrophin riduce la densità della colonna vertebrale (Figura 1C), indicando un effetto negativo sulla morfogenesi della colonna vertebrale quando l'Utrophin è sovraespressa.
Gli attuali metodi di imaging dovrebbero aiutare a identificare le varianti genetiche che governano la morfologia della colonna vertebrale 1,16. La morfologia della colonna vertebrale DD (cioè sottile/fungo, filopodiale, tozza, ramificata, vedi Figura 2) può essere valutata da singole proiezioni 2D delle immagini laterali del cordone nervoso ventrale poiché la maggior parte delle spine DD adotta un orientamento tipicamente diretto ventralmente. In questi confronti, è essenziale utilizzare lo stesso marcatore fluorescente per ogni condizione poiché i tipi morfologici apparenti della colonna vertebrale sembrano essere influenzati dal metodo di etichettatura (ad esempio, MYR::mRuby vs. LifeAct::GFP). Inoltre, è stato notato che le forme della colonna vertebrale sono dinamiche e probabilmente cambiano forma in risposta ai segnali esterni 2,16. Pertanto, è anche essenziale confrontare le forme della colonna vertebrale tra genotipi in fasi di sviluppo simili e in condizioni simili.
L'orientamento del cordone ventrale di C. elegans è fondamentale per un'acquisizione accurata delle immagini. Sia le corde ventrali che dorsali sui lati opposti dell'animale dovrebbero essere visibili nello stesso piano Z, indicando che il verme è orientato su un lato (Figura 1B). È meglio non raccogliere immagini di vermi in movimento o in contatto con altri vermi o bolle vicino al cordone ventrale, poiché ciò può degradare le immagini delle spine.
Per l'imaging del calcio in vivo , i vetrini freschi devono essere preparati immediatamente prima di ogni acquisizione. È meglio visualizzare i vermi a contatto solo con fibre di colla sottili vs. "globi" di colla che tendono a seccare i vermi e degradare l'immagine (Figura 4B). Nell'esperimento mostrato in Figura 4, l'impulso della luce a 561 nm attiva l'intero campo visivo. Per aumentare la risoluzione temporale e spaziale per rilevare transitori Ca++ locali, ad esempio, all'interno di singole spine DD, è possibile utilizzare un mini scanner galvo impostato per la linea laser a 561 nm per stimolare una regione di interesse più piccola17.

Le spine dendritiche sono strutture cellulari specializzate che ricevono input dai neuroni vicini per la trasmissione sinaptica. L'attivazione dei recettori dei neurotrasmettitori eleva il calcio intracellulare e le vie di segnalazione a valle in queste caratteristiche protrusioni neuronali1. A causa dell'importanza fondamentale delle spine dendritiche per la neurotrasmissione e la loro errata regolazione nelle malattie dello sviluppo neurologico1, la scoperta di fattori che modulano la morfogenesi e la funzione della colonna vertebrale dendritica è di grande interesse per il campo delle neuroscienze.
Recentemente, sono state identificate spine dendritiche nel sistema nervoso di C. elegans sulla base di caratteristiche chiave condivise con le spine dei mammiferi2. Questa determinazione è cruciale perché apre la possibilità di sfruttare i vantaggi di C. elegans per studiare la biologia della colonna vertebrale. Le spine dendritiche sui motoneuroni dorsali D (DD) ricevono input dai neuroni colinergici (VA e VB) nel cordone nervoso ventrale (Figura 1A)2,3,4. Qui, vengono presentati metodi di imaging per esplorare la struttura delle spine dendritiche DD e la loro funzione in vivo in un sistema nervoso intatto che è facilmente accessibile all'imaging dal vivo e all'analisi genetica. Per il monitoraggio della forma delle spine dendritiche, (1) proteine fluorescenti citosoliche, che riempiono il processo dendritico e le spine; (2) proteine fluorescenti legate alla membrana, che decorano il bordo delle spine dendritiche e dei dendriti; o (3) vengono utilizzati i marcatori di actina, LifeAct5 o Utrophin6, che sono arricchiti in spine dendritiche, rivelando così la loro forma. Per monitorare la funzionalità delle spine DD, la fluorescenza GCaMP viene utilizzata per rilevare i transitori Ca++ evocati dall'attivazione dell'opsina spostata verso il rosso, Chrimson, nei neuroni colinergici presinaptici7. Entrambe le strategie dovrebbero facilitare lo studio delle spine dendritiche DD in animali selvatici e mutanti.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>All-trans retinal (ATR)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2500-100MG</td>
			<td>Necessary cofactor for neuronal excitation with Chrimson</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diH2O</td>
			<td>MilliQ</td>
			<td></td>
			<td>To prepare M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td>To dilute ATR and make control plates for neuronal excitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (tricaine)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To immobilize animals for imaging dendritic spines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>(Schindelin J et al., 2012)</td>
			<td>Open source image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>7758-11-4</td>
			<td>To prepare M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16595-80-5</td>
			<td>To immobilize animals for imaging dendritic spines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M63-500</td>
			<td>To prepare M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12542B</td>
			<td>To mount animals for microscopy acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S369-500</td>
			<td>To prepare M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S671-3</td>
			<td>To prepare M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements version 05.21</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>To analyze images and movies (e.g., Deconvolution, image alignment)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybeads carboxylate 0.05um microspheres</td>
			<td>Polysciences, Inc</td>
			<td>15913-10</td>
			<td>To immobilize animals for imaging Ca++ transients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For statistical analysis and graphing normalized Ca++ transients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKen ME agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50014</td>
			<td>To make agarose pads to mount animals for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>The gorilla company</td>
			<td></td>
			<td>To immobilize animals for imaging Ca++ transients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost microscope slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-034-980</td>
			<td>To mount animals for microscopy acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vaseline</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8884430300</td>
			<td>To seal sample for confocal snapshots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>23-021-399</td>
			<td>Paraplast tissue embedding medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope for super-resolution imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM880</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AiryScan detector</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apochromat (oil) 63x/ 1.40 NA, WD = 0.19 mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage controller</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope for Nyquist image acquisition</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1R Confocal</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Fluor (oil) 40x/1.3 NA, WD 0.24 mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 nm, 16mW</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>561 nm, 17mW</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope to monitor evoked Ca++ transients in dendritic spines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning Disk Confocal</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor DU-897 EMCCD camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disk Head CSU-X1</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo TIRF (oil) 100x/1.49 NA ,WD 0.12 mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 nm, 65mW</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>561 nm, 86mW</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>525 nm (+/- 18 nm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>605 nm (+/- 35 nm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging dendritic spines in caenorhabditis elegans

Le spine dendritiche sono siti specializzati di innervazione sinaptica modulata dall'attività e servono come substrati per l'apprendimento e la memoria. Recentemente, le spine dendritiche sono state descritte per i neuroni DD GABAergici come siti di input dai neuroni colinergici presinaptici nel circuito motorio di Caenorhabditis elegans. Questo circuito sinaptico può ora servire come un nuovo potente modello in vivo della morfogenesi e della funzione della colonna vertebrale che sfrutta la facile genetica e la pronta accessibilità di C. elegans all'imaging di cellule vive. 
Questo protocollo descrive le strategie sperimentali per valutare la struttura e la funzione della colonna vertebrale DD. In questo approccio, viene utilizzata una strategia di imaging a super-risoluzione per visualizzare le forme intricate delle spine dendritiche ricche di actina. Per valutare la funzione della colonna vertebrale DD, l'opsina attivata dalla luce, Chrimson, stimola i neuroni colinergici presinaptici e l'indicatore di calcio, GCaMP, riporta i transitori di calcio evocati nelle spine DD postsinaptiche. Insieme, questi metodi comprendono potenti approcci per identificare i determinanti genetici delle spine dendritiche in C. elegans che potrebbero anche dirigere la morfogenesi e la funzione della colonna vertebrale nel cervello.

Le misurazioni con tre marcatori indipendenti (citosolic mCherry, LifeAct::GFP, MYR::mRuby) hanno prodotto una densità media di 3,4 ± 1,03 spine dendritiche DD per 10 μm di dendrite DD in giovani adulti wild-type (Figura 1B,C). Per questa analisi, le misurazioni ottenute con il marcatore GFP::Utrophin che ha prodotto una densità della colonna vertebrale significativamente inferiore sono state escluse (2,4 ± 0,74, Figura 1) a causa delle interazioni di Utrophin con il citoscheletro di actina6 che potenzialmente guida la morfogenesi della colonna vertebrale15. Le misure della densità della colonna vertebrale al microscopio ottico sono paragonabili al valore di 4,2 spine/10 μm di dendrite ottenuto dalla ricostruzione di 12 spine da micrografie elettroniche del neurone DD12. L'approccio di imaging delle cellule vive ha confermato che la morfologia sottile/a forma di fungo delle spine DD predomina nelle forme della colonna vertebrale adulta rispetto a quelle alternative (ad esempio, filopodiali, tozze, ramificate) (Figura 2B), che è anche tipica per le spine nel sistema nervoso maturo dei mammiferi16.
Una strategia optogenetica è stata utilizzata per chiedere se le presunte spine dendritiche rilevate dalla microscopia ottica ad alta risoluzione (Figura 1 e Figura 2) rispondono al rilascio di neurotrasmettitori dai siti presinaptici, un segno distintivo caratteristico delle spine dendritiche nei neuroni dei mammiferi. La luce verde (561 nm) è stata utilizzata per attivare una variante channelrhodopsin, Chrimson, nei neuroni colinergici presinaptici e la luce blu (488 nm) per rilevare la fluorescenza Ca++-dipendente emessa da una sonda GCaMP citoplasmatica nelle spine dendritiche DD postsinaptiche. Questo esperimento ha rilevato esplosioni transitorie del segnale GCaMP nelle spine DD immediatamente dopo l'attivazione optogenetica di Chrimson nei neuroni VA presinaptici (Figura 3). Il successo di questo esperimento dipende dall'espressione affidabile di Chrimson in tutti i neuroni VA presinaptici. In questo caso, è stato utilizzato un integrante cromosomico17 del marcatore Punc-4::Chrimson per garantire un'espressione VA coerente. Questo esperimento potrebbe anche essere condotto con un array extracromosomico. L'espressione cremisi in uno specifico neurone VA può essere confermata indipendentemente, ad esempio, accoppiando il transgene Chrimson a una sequenza leader transplicata SL2 con una GFP localizzata nucleare a valle come marcatore di co-espressione2. È essenziale eseguire un esperimento di controllo in assenza di ATR per confermare che il segnale GCaMP misurato dipende dall'attivazione optogenetica di Chrimson, che è strettamente ATR-dipendente (Figura 4D). Infine, poiché i segnali Ca++ evocati sono transitori, è fondamentale adottare un protocollo di imaging che consenta la commutazione rapida (<1 s) tra l'eccitazione a 561 nm e l'acquisizione del segnale GCaMP con il laser a 488 nm (Figura 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62676/62676fig1v2.jpg"> Figura 1: Marcatura delle spine dendritiche DD . (A) (In alto) Sei neuroni dorsali D (DD1-DD6) nel cordone nervoso ventrale di C. elegans. (In basso) Negli adulti, le spine DD dirette ventralmente (punta di freccia) contattano i terminali presinaptici dei motoneuroni Ventrale A (VA) e Ventral B (VB) (magenta) e le commessure DD si estendono al cordone nervoso dorsale per fornire l'output GABAergico ai muscoli del corpo (freccia)18. Questa cifra è stata modificata rispetto al riferimento2. (B) Micrografie fluorescenti (Airyscan) di spine DD marcate con mCherry citosolico, mRuby miristoilato (MYR::mRuby), LifeAct::GFP e GFP::Utrophin in vermi giovani adulti. Le punte di freccia grigie indicano le spine. Barra della scala = 2 μm. (C) Densità (spine/10 μm) delle spine dendritiche del neurone DD marcate con mCherry citosolico (3,77 ± 0,9), MYR::mRuby (3,09 ± 0,8), LifeAct::GFP (3,44 ± 1,1) o GFP::Utrophin (2,41 ± 0,8). Tutti i campioni sono normalmente distribuiti. One-Way ANOVA mostra che le densità della colonna vertebrale per mCherry citosolico, MYR::mRuby e LifeAct::GFP non sono significativamente (NS) diverse, mentre la densità della colonna vertebrale è ridotta per GFP::Utrophin vs. mCherry (p = 0,0016) e LifeAct::GFP (p = 0,0082). La linea rossa tratteggiata rappresenta la densità della colonna vertebrale dei neuroni DD valutati dalla ricostruzione EM 3D (4,2 spine / 10 μm). Questa cifra è stata modificata rispetto al riferimento2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62676/62676fig1v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62676/62676fig02.jpg"> Figura 2: Imaging delle spine dendritiche DD. (A) (In alto) Schema delle forme della colonna vertebrale. (In basso) Immagini Airyscan di ogni tipo di colonna vertebrale (barra di scala = 500 nm) etichettate con LifeAct::GFP (verde) e ricostruzioni 3D mediante micrografie elettroniche seriali di un adulto congelato ad alta pressione (blu). (B) Frequenza della colonna vertebrale per tipo, visualizzata con LifeAct::GFP: Sottile/Fungo (55,5 ± 14,5%), Filopodiale (10,3 ± 8,70%), Tozzo (18,8 ± 10,7%), Ramificata (15,42 ± 6,01%). Frequenza delle spine per tipo visualizzata con MYR::mRubino: Sottile/Fungo (52,2 ± 16,5%), Filopodiale (5,68 ± 7,0%), Tozzo (33,1 ± 14,8%), Ramificata (9,02 ± 9,6%). Test T spaiato, filopodiale (p = 0,0339); Le spine Stubby (p = 0.0009) e Branched (p = 0.011) etichettate con il marcatore MYR::mRuby sono significativamente diverse da LifeAct::GFP. Questa cifra è stata modificata rispetto al riferimento2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62676/62676fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62676/62676fig03.jpg"> Figura 3: Strategie per l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione delle spine DD . (A-B) (Inizio pagina) Immagini fluorescenti di dendriti DD1 marcate con un marcatore citosolico (mCherry) mediante (A) rivelatore Airyscan e (B) acquisizione Nyquist. (In basso) La dendrite DD (rossa) è raffigurata con un software di analisi delle immagini (opzione auto-path del tracciante del filamento) e le spine DD (blu) sono illustrate graficamente utilizzando il modulo di rilevamento delle spine semi-automatico. Le frecce puntano alla spina ramificata allargata in C e D. Le punte di freccia indicano le spine sottili / fungo vicine ingrandite in C e D. Barra di scala = 2 μm. (C-D) Esempi ingranditi di (in alto) spina ramificata (freccia) e (in basso) due spine sottili / a fungo vicine (punte di freccia) ottenute con (C) rivelatore Airyscan o per (D) acquisizione di Nyquist. Barra della scala = 500 nm. Dati riprodotti da2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62676/62676fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62676/62676fig04.jpg"> Figura 4: Valutazione della funzione delle spine DD. (A) I motoneuroni DD esprimono l'indicatore Ca++ GCaMP6s (verde) e i motoneuroni VA esprimono la variante channelrhodopsin, Chrimson (magenta)7. (B) Metodo di rappresentazione schematica per il montaggio di worm per misure di Ca++ . (1) Su un vetrino da microscopio pulito, (2) posizionare 2 μL di perline di poli da 0,05 μm, (3) utilizzare un filo di platino ("worm pick") per aggiungere un piccolo globulo di super colla e (4) ruotare nella soluzione per generare fili filamentosi di colla. (5) Aggiungere 3μL di tampone M9. (6) Posizionare circa dieci larve di L4 nella soluzione, (7) applicare il coprislip e sigillare i bordi con vaselina/cera. (C-D) L'attivazione dei neuroni VA è correlata con i transitori Ca++ nelle spine DD1. La fluorescenza GCaMP6s ripresa (a intervalli di 0,5 s) con attivazione periodica della luce di Chrimson (intervalli di 2,5 s) evoca transitori Ca++ con (C) + ATR (n = 12) ma non nei controlli (D) (-ATR, n = 12). I pannelli sono istantanee nel tempo (s), prima e dopo l'impulso di 561 nm di luce (linea rosa verticale). Barre di scala = 2 μm. Il segnale GCaMP6s viene acquisito da un ROI (Regione di interesse) sulla punta di ciascuna spina. (E) Fluorescenza GCaMP6s durante il periodo di registrazione di 10 s tracciato per +ATR (verde) vs -ATR (controllo, grigio) (n = 12 video). Le barre rosa verticali indicano l'illuminazione a 561 nm (ad esempio, l'attivazione Chrimson). Ogni animale è stato stimolato 4 volte con 561 nm di luce. Le misurazioni sono state raccolte prima e dopo ogni impulso di luce a 561 nm. (F) Grafico della fluorescenza GCaMP6s prima e dopo ogni impulso di luce a 561 nm. La fluorescenza GCaMP6s è stata misurata 1 s dopo ogni impulso di luce a 561 nm. Poiché i campioni non sono normalmente distribuiti, è stato applicato un test di Friedman non parametrico accoppiato per correggere i confronti multipli della fluorescenza GCaMP6 prima rispetto a quelli con GCaMP6. dopo stimolazione luminosa a 561 nm per vermi cresciuti con ATR (+ATR, verde) (*** p = 0,0004, n = 48 misurazioni) o in assenza di ATR (-ATR, grigio) (NS, non significativo, p = 0,0962, n = 48 misurazioni). Questa cifra è stata modificata rispetto al riferimento2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62676/62676fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
File supplementare 1: Elenco dei plasmidi utilizzati nello studio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62676/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 2: Composizione e preparazione del buffer M9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62676/Supplementary%20File%202.docx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

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Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Le spine dendritiche sono importanti caratteristiche cellulari del sistema nervoso. Qui vengono descritti metodi di imaging dal vivo per valutare la struttura e la funzione delle spine dendritiche in C. elegans. Questi approcci supportano lo sviluppo di schermi mutanti per i geni che definiscono la forma o la funzione della colonna vertebrale dendritica.

Imaging delle spine dendritiche in Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are specialized sites of synaptic innervation modulated by activity and serve as substrates for learning and memory. Recently, dendritic ...

Questo protocollo descrive i metodi per visualizzare le morfologie della colonna vertebrale dendritica e i transitori di calcio nei neuroni di C.elegans. Il nostro approccio dovrebbe facilitare gli approcci genetici per scoprire i determinanti della morfogenesi e della funzione della colonna vertebrale. Il nostro protocollo presenta spine dendritiche nei neuroni GABAergici.Anche le spine in altre classi di neuroni di C.elegans possono essere studiate con questi metodi. Il nostro protocollo descrive i metodi per immobilizzare i C.elegans viventi. È particolarmente importante prevenire il movimento degli animali durante l'acquisizione delle immagini e scegliere le giuste configurazioni laser per eccitare e registrare l'attività neuronale.Per acquisire immagini ad alta risoluzione, aggiungere tre microlitri di soluzione anestetica e quantità da 15 a 20 giovani vermi adulti su tamponi di agarosio al 10%. Quindi applicare il coprislip per immobilizzare i vermi e sigillare i bordi del coprislip con una miscela sigillante adesiva fusa. Per un'acquisizione a super-risoluzione, utilizzare un microscopio confocale a scansione laser dotato di microscopia a super-risoluzione.Acquisisci Z-stack utilizzando la dimensione del passo consigliata dal software del produttore. Raccogli una serie di sezioni ottiche che coprono il volume totale del processo ventrale Dorsale D o DD. Invia gli Z-stack per l'elaborazione delle immagini utilizzando il software del produttore e analizza le immagini con un punteggio superiore a sette.Per l'acquisizione Nyquist, utilizzare un microscopio confocale a scansione laser e selezionare la dimensione ottimale dei pixel per la lunghezza d'onda della luce e l'apertura numerica dell'obiettivo. Quindi invia lo stack per la deconvoluzione 3D utilizzando un algoritmo automatico. Per l'analisi delle immagini, utilizzare un software di elaborazione delle immagini appropriato per creare proiezioni di massima intensità degli stack Z.E contare manualmente le sporgenze sul dendrite DD. Quindi determinare la lunghezza del dendrite DD segnato per calcolare la densità delle spine per 10 micrometri di dendrite DD. Quindi classificare le spine come sottili o funghi, filopodiali, tozze o ramificate.Utilizzando tecniche convenzionali come la microiniezione, creare vermi transgenici che esprimono il sensore di calcio GCaMP nei neuroni DD e Chrimson, una rodopsina canale spostata verso il rosso nei neuroni VA presinaptici. Successivamente, sotto un cappuccio laminare, preparare tutte le piastre transretiniche o ATR aggiungendo 300 microlitri di coltura batterica OP50 coltivata durante la notte e 0,25 microlitri di ATR a ciascuna piastra di agar nutriente da 60 millimetri di crescita dei nematodi. Quindi distribuire la cultura con una bacchetta di vetro sterile.Per le piastre di controllo, aggiungere 300 microlitri di batteri OP50 e 0,25 microlitri di etanolo. Per consentire la crescita batterica, incubare le piastre a temperatura ambiente per 24 ore, al riparo dalla luce ambientale. Per impostare l'esperimento, posizionare cinque larve dello stadio L4 su ATR o piastre di controllo con semi OP50 e incubare le piastre al buio a 23 gradi Celsius.Dopo tre giorni, utilizzare un microscopio da dissezione stereo per confermare lo sviluppo della vulva e scegliere la progenie dello stadio L4 dall'ATR e dalle piastre di controllo per l'imaging. Quindi, posizionare due microlitri di poliperline da 0,05 micrometri su un vetrino da microscopio. E metti circa 10 larve di L4 nella soluzione.Utilizzando un filo di platino, aggiungere un piccolo globulo di super colla alla soluzione. Ruotare delicatamente la soluzione per generare fili filamentosi di colla. Quindi aggiungere tre microlitri di tampone M9.Quindi applicare una vetrina di copertura e sigillarne i bordi come dimostrato in precedenza. Per registrare i transitori di calcio evocati nelle spine dendritiche, utilizzare un microscopio confocale a disco rotante e regolare lo stadio del microscopio per posizionare le spine DD nel piano focale. Quindi impostare l'acquisizione time-lapse per illuminare il campione con una linea laser a 488 nanometri in ogni fotogramma per rilevare la fluorescenza GCaMP e una linea laser a 561 nanometri a intervalli periodici per l'eccitazione Chrimson.Per l'imaging del calcio in vivo, utilizzare la deconvoluzione 2D e l'allineamento dell'immagine per correggere deviazioni minori dal movimento del verme durante l'acquisizione. Quindi definisci la colonna vertebrale dendritica DD come la regione di interesse o ROI. Duplicare il ROI e spostarlo in una regione vicina all'interno del worm per raccogliere il segnale di background.Quindi, utilizzando il software appropriato, esportare le intensità GFP in Excel per ogni punto temporale e sottrarre la fluorescenza di fondo dalla fluorescenza del ROI della colonna vertebrale. Determinare la variazione della fluorescenza sottraendo la fluorescenza GFP nel fotogramma immediatamente prima dell'eccitazione a 561 nanometri o a zero da ciascun punto temporale dopo l'eccitazione o Delta F.Quindi dividere per F zero per determinare Delta F su F zero. E rappresentare graficamente le tracce normalizzate.Innanzitutto, determinare se i dati sono normalmente distribuiti utilizzando un test di Shapiro-Wilk. Per i dati che non sono normalmente distribuiti, utilizzare un ANOVA non parametrico con correzione post-hoc per test multipli. In alternativa, per le misurazioni che mostrano la distribuzione normale o gaussiana, eseguire un test ANOVA parametrico accoppiato per ogni misurazione della fluorescenza GCaMP prima e dopo ogni impulso a 561 nanometri.E correggere per più confronti in ciascuno dei due gruppi. L'etichettatura delle spine dendritiche DD con tre marcatori indipendenti, citosolici mCherry, MYR: mRuby e LifeAct: GFP ha prodotto una densità media di 3,4 spine dendritiche DD per 10 micron di dendrite DD in giovani adulti wild-type. Il marcatore GFP:Utrophin è stato escluso da questa analisi perché ha prodotto una densità della colonna vertebrale significativamente inferiore, potenzialmente a causa delle interazioni dell'utrofina con il citoscheletro di actina che guida la morfogenesi della colonna vertebrale.L'approccio di imaging delle cellule vive ha confermato che la sottile morfologia a forma di fungo delle spine DD predomina nell'adulto rispetto alle forme alternative della colonna vertebrale come filopodiale, tozza e ramificata. L'attivazione delle spine dendritiche DD è stata valutata mediante segnalazione colinergica presinaptica nei vermi transgenici che esprimono GCaMP nei neuroni DD e Chrimson nei neuroni VA presinaptici. Esplosioni transitorie di segnale GCaMP sono state rilevate nelle spine DD immediatamente dopo l'attivazione optogenetica di Chrimson nei neuroni VA presinaptici.Un esperimento di controllo in assenza di ATR ha confermato che la misura del segnale GCaMP dipende dall'attivazione optogenetica di Chrimson che è strettamente ATR-dipendente. Per visualizzare le spine DD, è meglio immaginare gli animali che giacciono su un fianco come le spine che sporgono sono ad angolo retto rispetto al percorso della luce. Con questo metodo, gli scienziati possono anche utilizzare manipolazioni farmacologiche per comprendere i meccanismi che guidano i transitori di calcio nelle spine DD.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Recupero della fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) di fluorescenza proteine ​​Tagged in spine dendritiche di colture di neuroni ippocampali

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Ricerca

Neuroscienze

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Tensione sensibile registrazione Dye da assoni, dendriti e spine dendritiche dei singoli neuroni in fettine di cervello

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

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A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Sistema modello per Amylopathy Studio

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Veloce micro-ionoforesi di glutammato e GABA: un utile strumento per indagare l&#39;integrazione Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Metodi per studiare i meccanismi d&#39;azione di farmaci antipsicotici in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Imaging spine dendritiche di Rat Primaria neuroni dell&#39;ippocampo utilizzando Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di spine dendritiche nella corteccia mouse Uso un teschio Diluito-Preparazione

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Microchambers Agarose per lungo termine Imaging di calcio<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

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Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Analizzando dendritiche Morfologia in colonne e strati

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

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UN<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Analisi di Aversione di rame basata sullo stato nutrizionale

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their ...