Name: imaging dendritic spines in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2021-09-27T13:30:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Avbildning och analys på Imaris utfördes i Vanderbilt Cell Imaging Shared Resource (CIRS) som stöds av NIH (CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 och EY08126). LSM 880 stöds av bidrag 1S10OD201630. Avbildning på en Nikon-spinnskiva utfördes vid Nikon Center of Excellence. Vi tackar Jenny Schafer, CISR-chef, och Bryan Millis för utbildning och insiktsfulla diskussioner och medlemmar i Burnette-labbet: Dylan Burnette, Aidan Fenix och Nilay Taneja för råd. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health-bidrag till DMM (R01NS081259 och R01NS106951) och ett American Heart Association-bidrag till ACC (18PRE33960581).

1. Bestämning av strukturen hos DD dendritiska spines
<ol><li>Skapa transgena maskar för att märka DD-taggar<ol><li>Använd flp-13-promotorn för att bygga en uttrycksvektor för etiketten av intresse (t.ex. cytoplasmatisk mCherry, MYR::mRuby, LifeAct::GFP, GFP:::utrophin) (figur 1). Se den fullständiga listan över plasmider i tilläggsfil 1.</li>
		<li>Använd etablerade metoder för att generera en transgen linje som märker DD-ryggar 8,9.</li>
	</ol></li>
	<li>Förbered tätningsmedlet<ol><li>Gör en 1:1-blandning av paraffinbaserat inbäddningsmedium10 (se Materialförteckning).</li>
		<li>Värm mediet vid 60 °C tills det smälter, alikvotera sedan i 1,5 ml täckta mikrocentrifugrör och håll ett värmeblock vid 60–70 °C. OBS: Tätningsmedel kan hålla i 4 veckor i värmeblocket.</li>
	</ol></li>
	<li>Förbered ett bedövningsmedel.<ol><li>Gör stamlösningar i destillerad H2O-plastikel av 1 % trikain och 1 M levamisol (se materialtabell). Förvaras vid -20 °C.</li>
		<li>Bered en arbetslösning av 0,05% trikain och 15 mM levamisolebedövningsmedel, enligt beskrivningen i steg 1.3.3-1.3.511.</li>
		<li>Blanda 75 μl 1 % trikainstam och 22,5 μl 1 M levamisol.</li>
		<li>Tillsätt M9-buffert till en slutlig volym på 1,5 ml.</li>
		<li>Alikvot 10 μl 0,05 % trikain, 15 mM levamisol i 0,5 ml mikrocentrifugrör och förvaras vid -20 °C. OBS: Narkosblandningen är känslig för temperatur, och individuella alikvoter av arbetslösningen bör inte frysas om efter upptining för varje experiment. Se tilläggsfil 2 för ett recept på M9-buffert.</li>
	</ol></li>
	<li>Skaffa högupplösta bilder<ol><li>Förbered 10% agaros och håll den i vattenbadet vid 60 °C. OBS: Se rapporten av Monica Driscoll i WormBook12.</li>
		<li>Montera 15-20 unga vuxna på 10% agaroskuddar och tillsätt 3 μL bedövningsmedel (se steg 3).</li>
		<li>Applicera coverslip (maskar immobiliseras inom 5 min).</li>
		<li>Försegla kanterna på täckglaset med smält självhäftande tätningsblandning (se Materialförteckning).</li>
		<li>Hämta bilder<ol><li>Förvärv med superupplösning<ol><li>Använd ett laserscanningskonfokalmikroskop utrustat för superupplösningsmikroskopi med en 63x / 1.40 Plan-Apochromat oljeobjektivlins för att uppnå en liten pixelstorlek (t.ex. < 50 nm). Skaffa Z-stackar med den stegstorlek som rekommenderas av tillverkarens programvara (se Materialförteckning).</li>
				<li>Samla en serie optiska sektioner som sträcker sig över den totala volymen av DD-ventralprocessen (t.ex. 15-20 skivor med 0,19 μm stegstorlek eller 2- 3 μm tjock). Skicka in Z-stackar för bildbehandling med tillverkarens programvara och analysera bilder med en poäng högre än 7 (figur 1B, figur 2 och figur 3).</li>
			</ol></li>
			<li>Nyquist förvärv<ol><li>Använd ett konfokalmikroskop för laserskanning för att välja den optimala pixelstorleken för ljusets våglängd och numeriska bländare för objektivlinsen som används (t.ex. 40x / 1.4 Plan Fluoroljemål). OBS: Den mindre pixelstorleken kommer att avslöja den fina strukturen hos DD-ryggar.</li>
				<li>Skicka in stack för 3D-dekonvolution med automatisk algoritm (se materialförteckning) (bild 3).</li>
			</ol></li>
			<li>Använd minsta möjliga Z-steg (t.ex. bestämt av Piezo-steg) eftersom översampling i Z kan ge skarpare bilder efter 3D-dekonvolution13.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Bildanalys<ol><li>Använd lämplig bildbehandlingsprogramvara (se materialförteckning) för att skapa projektioner med maximal intensitet av Z-stackarna14.</li>
		<li>Räkna utsprången manuellt på DD-dendriten. OBS: Utsprång är vinkelräta förlängningar från huvudaxeln (figur 1B, pilspetsar).</li>
		<li>Bestäm längden på DD-dendriten som görs för att beräkna ryggradens densitet per 10 μm DD-dendrit (figur 1C).</li>
		<li>Klassificera ryggar som tunna/svampiga, filopodiala, stubbiga eller grenade (figur 2A). OBS: Tunna / svampryggar uppvisar en smal bas (nacke) och en bredare spets (huvud). Filopodial spines visar inte en trång bas (ingen nacke) men har en konstant bredd. Stubby spines har en bred bas och spets. Grenade spines är utsprång med mer än en spets.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Bedömning av aktivering av DD-dendritiska ryggar genom presynaptisk kolinerg signalering
<ol><li>Skapa transgena maskar med konventionella tekniker (t.ex. mikroinjektion)8,9<ol><li>Använd flp-13-promotorn för att driva uttryck av Ca++ -sensorn, GCaMP6s, i DD-neuroner och unc-4-promotorn för att driva uttryck av Chrimson, en rödförskjuten channelrhodopsin, i presynaptiska VA-neuroner (figur 4A). Se listan över plasmider i tilläggsfil 1.</li>
	</ol></li>
	<li>Förbered All-trans Retinal (ATR) och kontrollplattor. OBS: ATR är en nödvändig kofaktor för att Chrimson ska fungera som en optogenetiskt aktiverad jonkanal.<ol><li>Bered 100 mM ATR stamlösning i etanol (100%). Förvaras vid -20 °C i alikvoter på 1 ml.</li>
		<li>Under en laminär flödeshuv, tillsätt 300 μL OP50 bakteriekultur över natten och 0,25 μL ATR till varje 60 mm NGM (Nematode Growth Medium) näringsagarplatta och sprid med en steril glasstav.</li>
		<li>För kontroller, tillsätt 300 μl OP50-bakterier och 0,25 μl etanol (100%) till en separat grupp av NGM-plattor.</li>
		<li>Låt plattorna sitta i huven vid rumstemperatur i 24 timmar (skyddade mot omgivande ljus) för att möjliggöra bakterietillväxt. OBS: Plattorna kan användas efter den första 24 timmars inkubationen eller hållas vid 4 °C för användning inom 5 dagar.</li>
	</ol></li>
	<li>Konfigurera experimentet<ol><li>Placera fem NC3569 L4-stegslarver på OP50-seedade ATR- eller kontrollplattor som saknar ATR och växer i mörker vid 23 °C.</li>
		<li>Tre dagar senare, använd ett stereodissekeringsmikroskop för att bekräfta vulvautveckling för att plocka L4-stegavkomma från ATR och kontrollplattor för avbildning enligt beskrivningen i steg 2.4.1-2.4.3.</li>
		<li>Placera 2 μl 0,05 μm polypärlor (2,5 % fasta ämnen w/v) på mikroskopglas (se materialförteckning).</li>
		<li>Använd en platinatråd ("maskplockning") för att lägga till en liten kula superlim till lösningen och virvla försiktigt för att generera trådformiga "trådar" av lim. Tillsätt sedan 3 μL M9-buffert (figur 4B).</li>
		<li>Placera cirka tio L4-larver i lösningen och applicera en täckglas. OBS: Limfibrer kommer slumpmässigt att kontakta maskar och immobilisera dem efter att täckglaset har applicerats. Ormar som är inbäddade i stora limkulor verkar torkade och bör inte avbildas.</li>
		<li>Försegla kanterna på täckglaset enligt steg 1.4.4.</li>
	</ol></li>
	<li>Inspelning av framkallade Ca++ -transienter i dendritiska ryggar.<ol><li>Använd ett konfokalmikroskop med snurrande skivor utrustat med en känslig CCD-kamera, en 100x TIRF-oljeobjektivlins och 488 nm och 561 nm laserlinjer (se materialtabell).</li>
		<li>Justera mikroskopsteget för att placera DD-ryggar i fokalplanet.</li>
		<li>Ställ in time-lapse-förvärv för att belysa provet med 488 nm laserlinje varje ram (för detektering av GCaMP6s fluorescens) och 561 nm laserlinje med jämna mellanrum (för Chrimson excitation). OBS: Använd till exempel 488 nm-ljus för att fånga på varandra följande ögonblicksbilder (200 ms) av GCaMP6s-signalen i kombination med en 200 ms puls på 561 nm ljus var 5: e bildruta (figur 4C-E). Med denna konfiguration detekteras GCaMP-nivåer före och efter varje 561 nm-puls ~ 1 s från varandra (200 ms 488 nm laser för att detektera GCaMP före VA-aktivering, 200 ms 561 nm puls för att aktivera VA och ~ 600 ms för att växla mellan laserlinjer och emissionsfilter. Med denna inställning aktiveras VA-neuroner var 2,5: e sekund.</li>
	</ol></li>
	<li>Analys av in vivo Ca++ -avbildning<ol><li>Använd 2D-dekonvolution och bildjustering för att korrigera mindre avvikelser som uppstår från maskrörelsen under förvärvet (se materialförteckningen).</li>
		<li>Definiera DD-dendritisk ryggrad som intresseområdet (ROI i figurerna 4C-D).</li>
		<li>Duplicera avkastningen och flytta till en angränsande region inuti masken för att samla in bakgrundssignal (dvs. brus).</li>
		<li>Använd lämplig programvara (se Materialförteckning) för att exportera GCaMP6s-intensiteter för att utmärka sig för varje tidpunkt. Subtrahera bakgrundsfluorescens från ryggradens ROI-fluorescens.</li>
		<li>Bestäm förändringen i fluorescens genom att subtrahera GCaMP6s-fluorescensen i ramen omedelbart före 561 nm excitation (F0) från varje tidpunkt efter excitation (ΔF) och dividera sedan med F0 för att bestämma ΔF / F0 (figur 4E).</li>
		<li>Diagram över de normaliserade spåren (se Materialförteckning).</li>
		<li>Utför ett parat statistiskt test för varje mätning av GCaMP6s fluorescens före och efter varje puls på 561 nm ljus. OBS: Detta tillvägagångssätt utesluter effektivt slumpmässiga fluktuationer i GCaMP6s-fluorescens som annars minskar den statistiska effekten av att jämföra den genomsnittliga GCaMP6s-signalen från alla mätningar före och efter 561 nm excitation (figur 4F).</li>
		<li>För mätningar som visar en normal eller Gaussisk fördelning, använd ett parat parametriskt ANOVA-test och korrigera för flera jämförelser för var och en av de två grupperna (ATR före vs. efter, ingen ATR före vs. efter). Alternativt, för data som normalt inte distribueras, använd en icke-parametrisk ANOVA med posthoc-korrigering för flera tester. OBS: Maskar som odlas på plattor som saknar ATR ("ingen ATR") är nödvändiga kontroller och bör inte visa 561 nm-aktiverade Ca ++ transienter eftersom ATR krävs för Chrimson-funktionen.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Sala, C., Segal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Spines:+The+Locus+of+Structural+and+Functional+Plasticity.">Dendritic Spines: The Locus of Structural and Functional Plasticity.</a> Physiological Reviews. 94 (1), 141-188 (2014).</li><li>Cuentas-Condori, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+neurons+have+functional+dendritic+spines.">C. elegans neurons have functional dendritic spines.</a> Elife. 8, 47918 (2019).</li><li>Philbrook, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurexin+directs+partner-specific+synaptic+connectivity+in+C.+Elegans.">Neurexin directs partner-specific synaptic connectivity in C. Elegans.</a> Elife. 7, 35692 (2018).</li><li>Oliver, D., Alexander, K., Francis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanisms+Directing+Spine+Outgrowth+and+Synaptic+Partner+Selection+in+Caenorhabditis+elegans.">Molecular Mechanisms Directing Spine Outgrowth and Synaptic Partner Selection in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Experimental Neuroscience. 12, 10-13 (2018).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nature Methods. 5, 605-607 (2008).</li><li>Ladt, K., Ganguly, A., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+actin+in+action:+Imaging+actin+dynamics+in+neurons.">Axonal actin in action: Imaging actin dynamics in neurons.</a> Methods of Cell Biology. 131, 91-106 (2016).</li><li>Schild, L. C., Glauser, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+color+neural+activation+and+behavior+control+with+chrimson+and+CoChR+in+Caenorhabditis+elegans.">Dual color neural activation and behavior control with chrimson and CoChR in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (4), 1029-1034 (2015).</li><li>Mello, C., Kramer, J., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.+elegans:+extrahcormosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C. elegans: extrahcormosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> The EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).</li><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Stable+Transgenic+C+.+elegans+Using+Microinjection.">Generation of Stable Transgenic C . elegans Using Microinjection.</a> Journal of Visualized Experiments. (18), e833 (2008).</li><li>Smith, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+and+cell-specific+expression+profiling+reveal+dynamic+branching+and+molecular+determinants+of+a+multi-dendritic+nociceptor+in+C.+elegans.">Time-lapse imaging and cell-specific expression profiling reveal dynamic branching and molecular determinants of a multi-dendritic nociceptor in C. elegans.</a> Developemntal Biology. 345 (1), 18-33 (2010).</li><li>Mccarter, J., Bartlett, B., Dang, T., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soma+-+Germ+Cell+Interactions+in+Caenorhabditis+elegans+:+Multiple+Events+of+Hermaphrodite+Germline+Development+Require+the+Somatic+Sheath+and+Spermathecal+Lineages.">Soma - Germ Cell Interactions in Caenorhabditis elegans : Multiple Events of Hermaphrodite Germline Development Require the Somatic Sheath and Spermathecal Lineages.</a> Developemntal Biology. 181 (2), 121-143 (1997).</li><li>Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mounting+animals+for+observation+with+Nomarski+DIC+optics.">Mounting animals for observation with Nomarski DIC optics.</a> WormBook. , (2008).</li><li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing?+A+beginners'+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition.">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Hotulainen, P., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+in+dendritic+spines+connecting+dynamics+to+function.">Actin in dendritic spines connecting dynamics to function.</a> Journal of Cell Biology. 189 (4), 619-629 (2010).</li><li>Berry, K. P., Nedivi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spine+Dynamics:+Are+They+All+the+Same.">Spine Dynamics: Are They All the Same.</a> Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).</li><li>Miller, D. M., Niemeyer, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+unc-4+homeoprotein+in+Caenorhabditis+elegans+motor+neurons+specifies+presynaptic+input.">Expression of the unc-4 homeoprotein in Caenorhabditis elegans motor neurons specifies presynaptic input.</a> Development. 121 (9), 2877-2886 (1995).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Structure+of+the+Ventral+Nerve+Cord+of+Caenorhadbitis+elegans.">The Structure of the Ventral Nerve Cord of Caenorhadbitis elegans.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society. 275 (938), 327-348 (1976).</li><li>Huff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Airyscan+detector+from+ZEISS+confocal+imaging+with+improved+signal-to-noise+ratio+and+super-resolution.">The Airyscan detector from ZEISS confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution.</a> Nature Methods. 12, (2015).</li><li>Huff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fast+mode+for+ZEISS+LSM+880+with+Airyscan+high-speed+confocal+imaging+with+super-resolution+and+improved+signal-to-noise+ratio.">The Fast mode for ZEISS LSM 880 with Airyscan high-speed confocal imaging with super-resolution and improved signal-to-noise ratio.</a> Nature Methods. 13, (2016).</li><li>Jacquemet, G., Carisey, A. F., Hamidi, H., Henriques, R., Leterrier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biologist's+guide+to+super-resolution+microscopy.">The cell biologist's guide to super-resolution microscopy.</a> Journal of Cell Science. 133 (11), 240713 (2020).</li></ol>

Vi förklarar inga intressekonflikter.

Airyscan-detektorn valdes för att få ögonblicksbilder av DD-ryggar eftersom den ger ett högre signal-brusförhållande och bättre upplösning än konventionella konfokalmikroskop19,20. AiryScan-avbildning tillåter också användning av konventionella fluorescerande proteiner (t.ex. GFP, mCherry, etc.), nu allmänt tillgängliga för C. elegans. Även om bilder med högre upplösning kan erhållas med andra superupplösningsmetoder (t.ex. STORM, STED, PALM), kräver dessa metoder fotoaktiverbara eller fotoomkopplingsbara fluorescerande proteiner21. Som ett alternativ till Airyscan rekommenderas konventionella konfokalmikroskop. Till exempel uppnår avbildning med Nyquist-förvärv (figur 3) pixelstorleken med ett 40x / 1.3-mål på 123,9 nm, tillräckligt för att skilja de ryggradsmorfologiska typerna (figur 2).
För bestämning av ryggradstätheten rekommenderas användning av ett cytosoliskt fluorescerande protein såsom (1) mCherry eller GFP, (2) LifeAct för att märka aktincytoskeletten eller (3) ett myristoylerat fluorescerande protein (t.ex. MYR::mRuby) för att märka plasmamembranet (figur 1B). Som jämförelse minskar det F-aktinbindande proteinet Utrophin ryggradstätheten (figur 1C), vilket indikerar en negativ effekt på ryggradsmorfogenesen när Utrophin är överuttryckt.
De nuvarande avbildningsmetoderna bör hjälpa till att identifiera genetiska varianter som styr ryggradsmorfologin 1,16. DD-ryggradsmorfologi (dvs. tunn/svamp, filopodial, stubbig, grenad, se figur 2) kan bedömas från enstaka 2D-projektioner av de ventrala nervkabelns laterala bilder eftersom de flesta DD-ryggar antar en karakteristiskt ventralt riktad orientering. I dessa jämförelser är det viktigt att använda samma fluorescerande markör för varje tillstånd eftersom uppenbara ryggradsmorfologiska typer verkar påverkas av märkningsmetoden (t.ex. MYR::mRuby vs. LifeAct::GFP). Dessutom noterades att ryggformerna är dynamiska och sannolikt ändrar form som svar på de yttre signalerna 2,16. Således är det också viktigt att jämföra ryggradsformer mellan genotyper i liknande utvecklingsstadier och under liknande förhållanden.
Orienteringen av C. elegans ventrala sladd är kritiskt avgörande för korrekt bildförvärv. Både ventrala och dorsala sladdar på motsatta sidor av djuret ska vara synliga i samma Z-plan, vilket indikerar att masken är orienterad på sin sida (Figur 1B). Det är bäst att inte samla bilder av maskar som rör sig eller kommer i kontakt med andra maskar eller bubblor nära ventralkabeln, eftersom detta kan försämra bilder av spines.
För kalciumavbildning in vivo måste färska objektglas beredas omedelbart före varje förvärv. Det är bäst att avbilda maskar i kontakt med endast tunna limfibrer vs. "globs" av lim som tenderar att torka maskar och försämra bilden (figur 4B). I experimentet som visas i figur 4 aktiverar pulsen på 561 nm ljus hela synfältet. För att öka den tidsmässiga och rumsliga upplösningen för att detektera lokala Ca++ -transienter, till exempel inom enskilda DD-ryggar, kan en galvo-miniskanner som ställts in för 561 nm-laserlinjen användas för att stimulera ett mindre område av intresse17.

Dendritiska spines är specialiserade cellulära strukturer som tar emot input från närliggande neuroner för synaptisk överföring. Aktivering av neurotransmittorreceptorer höjer intracellulära kalcium- och nedströms signalvägar i dessa karakteristiska neuronala utsprång1. På grund av den grundläggande betydelsen av dendritiska spines för neurotransmission och deras felreglering i neurodevelopmental sjukdomar1, är upptäckten av faktorer som modulerar dendritisk ryggradsmorfogenes och funktion av stort intresse för neurovetenskapens område.
Nyligen har dendritiska ryggar identifierats i C. elegans nervsystem baserat på viktiga egenskaper som delas med däggdjurs ryggar2. Denna bestämning är avgörande eftersom den öppnar möjligheten att utnyttja fördelarna med C. elegans för att undersöka ryggradsbiologi. Dendritiska ryggar på dorsala D (DD) motorneuroner får input från kolinerga neuroner (VA och VB) i ventral nervkabel (figur 1A)2,3,4. Här presenteras avbildningsmetoder för att utforska strukturen hos DD-dendritiska ryggar och deras funktion in vivo i ett intakt nervsystem som är lättillgängligt för levande avbildning och genetisk analys. För övervakning av formen av dendritiska spines, (1) cytosoliska fluorescerande proteiner, som fyller den dendritiska processen och ryggraden; (2) membranbundna fluorescerande proteiner, som dekorerar gränsen för dendritiska spines och dendriter; eller (3) aktinmarkörerna, LifeAct5 eller Utrophin6, som är berikade i dendritiska ryggar används, vilket avslöjar deras form. För att övervaka funktionaliteten hos DD-spines används GCaMP-fluorescens för att detektera Ca++-transienter som framkallas genom aktivering av det rödförskjutna opsinet, Chrimson, i presynaptiska kolinerga neuroner7. Båda strategierna förväntas underlätta studien av DD-dendritiska ryggar hos vilda och muterade djur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>All-trans retinal (ATR)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2500-100MG</td>
			<td>Necessary cofactor for neuronal excitation with Chrimson</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diH2O</td>
			<td>MilliQ</td>
			<td></td>
			<td>To prepare M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td>To dilute ATR and make control plates for neuronal excitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (tricaine)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To immobilize animals for imaging dendritic spines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>(Schindelin J et al., 2012)</td>
			<td>Open source image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>7758-11-4</td>
			<td>To prepare M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16595-80-5</td>
			<td>To immobilize animals for imaging dendritic spines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M63-500</td>
			<td>To prepare M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12542B</td>
			<td>To mount animals for microscopy acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S369-500</td>
			<td>To prepare M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S671-3</td>
			<td>To prepare M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements version 05.21</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>To analyze images and movies (e.g., Deconvolution, image alignment)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybeads carboxylate 0.05um microspheres</td>
			<td>Polysciences, Inc</td>
			<td>15913-10</td>
			<td>To immobilize animals for imaging Ca++ transients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For statistical analysis and graphing normalized Ca++ transients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKen ME agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50014</td>
			<td>To make agarose pads to mount animals for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>The gorilla company</td>
			<td></td>
			<td>To immobilize animals for imaging Ca++ transients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost microscope slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-034-980</td>
			<td>To mount animals for microscopy acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vaseline</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8884430300</td>
			<td>To seal sample for confocal snapshots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>23-021-399</td>
			<td>Paraplast tissue embedding medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope for super-resolution imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM880</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AiryScan detector</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apochromat (oil) 63x/ 1.40 NA, WD = 0.19 mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage controller</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope for Nyquist image acquisition</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1R Confocal</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Fluor (oil) 40x/1.3 NA, WD 0.24 mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 nm, 16mW</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>561 nm, 17mW</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope to monitor evoked Ca++ transients in dendritic spines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning Disk Confocal</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor DU-897 EMCCD camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disk Head CSU-X1</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo TIRF (oil) 100x/1.49 NA ,WD 0.12 mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 nm, 65mW</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>561 nm, 86mW</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>525 nm (+/- 18 nm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>605 nm (+/- 35 nm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging dendritic spines in caenorhabditis elegans

Dendritiska spines är specialiserade platser för synaptisk innervation modulerad av aktivitet och fungerar som substrat för inlärning och minne. Nyligen har dendritiska ryggar beskrivits för DD GABAergiska neuroner som ingångsställen från presynaptiska kolinerga neuroner i motorkretsen av Caenorhabditis elegans. Denna synaptiska krets kan nu fungera som en kraftfull ny in vivo-modell av ryggradsmorfogenes och funktion som utnyttjar den facila genetiken och den färdiga tillgängligheten hos C. elegans till levande cellavbildning. 
Detta protokoll beskriver experimentella strategier för att bedöma DD-ryggradens struktur och funktion. I detta tillvägagångssätt används en superupplöst bildstrategi för att visualisera de invecklade formerna av aktinrika dendritiska ryggar. För att utvärdera DD-ryggradsfunktionen stimulerar det ljusaktiverade opsinet, Chrimson, de presynaptiska kolinerga neuronerna, och kalciumindikatorn, GCaMP, rapporterar de framkallade kalciumtransienterna i postsynaptiska DD-spines. Tillsammans omfattar dessa metoder kraftfulla metoder för att identifiera genetiska determinanter för dendritiska ryggar i C. elegans som också kan styra ryggradens morfogenes och funktion i hjärnan.

Mätningar med tre oberoende markörer (cytosolic mCherry, LifeAct::GFP, MYR::mRuby) gav en genomsnittlig densitet på 3,4 ± 1,03 DD dendritiska ryggar per 10 μm DD-dendrit hos unga vuxna av vildtyp (figur 1B,C). För denna analys exkluderades de mätningar som erhölls med GFP::Utropfinmarkören som gav en signifikant lägre ryggradstäthet (2,4 ± 0,74, figur 1) på grund av interaktioner mellan Öfte och aktincytoskelettet6 som potentiellt driver ryggradsmorfogenesen15. Mätningarna av ryggradstätheten i ljusmikroskopet är jämförbara med värdet 4,2 spines/10 μm dendrit erhållen från rekonstruktionen av 12 spines från elektronmikrografer av DD1-neuronen2. Avbildningsmetoden med levande celler bekräftade att DD-ryggradens tunna/svampformade morfologi dominerar i vuxna kontra alternativa ryggradsformer (t.ex. filopodial, stubbig, grenad) (figur 2B), vilket också är typiskt för ryggar i det mogna däggdjursnervsystemet16.
En optogenetisk strategi användes för att fråga om de presumtiva dendritiska ryggraden som detekteras med högupplöst ljusmikroskopi (figur 1 och figur 2) är mottagliga för neurotransmittorfrisättning från presynaptiska platser, ett karakteristiskt kännetecken för dendritiska ryggar i däggdjursneuroner. Grönt ljus (561 nm) användes för att aktivera en channelrhodopsin-variant, Chrimson, i presynaptiska kolinerga neuroner och blått ljus (488 nm) för att detektera Ca++-beroende fluorescens som emitteras av en cytoplasmatisk GCaMP-sond i postsynaptiska DD-dendritiska ryggar. Detta experiment detekterade övergående skurar av GCaMP-signal i DD-ryggar omedelbart efter optogenetisk aktivering av Chrimson i presynaptiska VA-neuroner (figur 3). Framgången för detta experiment beror på det tillförlitliga uttrycket av Chrimson i alla presynaptiska VA-neuroner. I detta fall användes en kromosomalintegrant 17 av Punc-4::Chrimson-markören för att säkerställa ett konsekvent VA-uttryck. Detta experiment kan också utföras med en extrakromosomal array. Chrimson-uttryck i en specifik VA-neuron kan bekräftas oberoende, till exempel genom att koppla Chrimson-transgenen till en SL2-transplicerad ledarsekvens med en nedströms kärnlokaliserad GFP som en samuttrycksmarkör2. Det är viktigt att utföra ett kontrollexperiment i frånvaro av ATR för att bekräfta att den uppmätta GCaMP-signalen beror på optogenetisk aktivering av Chrimson, som är strikt ATR-beroende (figur 4D). Slutligen, eftersom framkallade Ca ++ -signaler är övergående, är det viktigt att anta ett bildprotokoll som möjliggör snabb växling (<1 s) mellan 561 nm excitation och GCaMP-signalförvärv med 488 nm-lasern (figur 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62676/62676fig1v2.jpg"> Figur 1: Märkning av DD dendritiska ryggar . (A) (Överst) Sex dorsala D (DD1-DD6) neuroner i den ventrala nervkabeln hos C. elegans. (Nederst) Hos vuxna kontaktar ventralt riktade DD-ryggar (pilspets) presynaptiska terminaler av ventrala A (VA) och ventrala B (VB) motorneuroner (magenta), och DD-kommissurer sträcker sig till dorsalnervkabeln för att ge GABAergisk utgång till kroppsmuskler (pil)18. Denna siffra har ändrats från referens2. (B) Fluorescerande mikrografer (Airyscan) av DD-ryggar märkta med cytosolisk mCherry, myristoylerad mRuby (MYR::mRuby), LifeAct::GFP och GFP::Utrophin hos unga vuxna maskar. Grå pilspetsar pekar på ryggar. Skalstreck = 2 μm. (C) Densitet (ryggar/10 μm) av DD neuron dendritiska ryggar märkta med cytosolisk mCherry (3,77 ± 0,9), MYR::mRuby (3,09 ± 0,8), LifeAct::GFP (3,44 ± 1,1) eller GFP::Utrophin (2,41 ± 0,8). Alla prover distribueras normalt. Envägs ANOVA visar att ryggradstätheten för cytosolisk mCherry, MYR::mRuby och LifeAct::GFP inte är signifikant (NS) olika, medan ryggradstätheten reduceras för GFP::Utrophin vs. cytosoliskt märkt mCherry (p = 0,0016) och LifeAct::GFP (p = 0,0082). Den streckade röda linjen representerar ryggradstätheten hos DD-neuroner bedömda från 3D EM-rekonstruktion (4,2 spines/10 μm). Denna siffra har ändrats från referens2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62676/62676fig1v2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62676/62676fig02.jpg"> Figur 2: Imaging DD dendritiska ryggar. (A) (Överst) Schematisk över ryggformer. (Nederst) Airyscan-bilder av varje typ av ryggrad (skalstång = 500 nm) märkta med LifeAct::GFP (grön) och 3D-rekonstruktioner av seriella elektronmikrografer av en högtrycksfrusen vuxen (blå). (B) Ryggradsfrekvens efter typ, visualiserad med LifeAct::GFP: Tunn/Svamp (55,5 ± 14,5%), Filopodial (10,3 ± 8,70%), Stubby (18,8 ± 10,7%), Grenad (15,42 ± 6,01%). Spines frekvens efter typ visualiserad med MYR::mRuby: Thin/Mushroom (52,2 ± 16,5%), Filopodial (5,68 ± 7,0%), Stubby (33,1 ± 14,8%), Grenad (9,02 ± 9,6%). Oparat T-test, Filopodial (p = 0,0339); Stubbiga (p = 0,0009) och grenade (p = 0,011) ryggar märkta med MYR::mRuby-markören skiljer sig avsevärt från LifeAct::GFP. Denna siffra har ändrats från referens2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62676/62676fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62676/62676fig03.jpg"> Figur 3: Strategier för att få högupplösta bilder av DD-ryggar. (A-B) (Överst) Fluorescerande bilder av DD1-dendriter märkta med en cytosolisk markör (mCherry) av (A) Airyscan-detektor och (B) Nyquist-förvärv. (Nederst) DD-dendrit (röd) avbildas med en bildanalysprogramvara (auto-path option of filament tracer), och DD-spines (blå) illustreras grafiskt med hjälp av den halvautomatiska spinesdetekteringsmodulen. Pilen pekar på grenad ryggrad förstorad i C och D. Pilspetsar betecknar angränsande tunna/svampryggar förstorade i C och D. Skalstång = 2 μm. (C-D) Förstorade exempel på (övre) grenad ryggrad (pil) och (nedre) två angränsande tunna/svampryggar (pilspetsar) erhållna med (C) Airyscan-detektor eller genom (D) Nyquist-förvärv. Skalstreck = 500 nm. Data som återges från2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62676/62676fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62676/62676fig04.jpg"> Figur 4: Bedömning av DD-ryggarnas funktion. (A) DD-motorneuroner uttrycker Ca ++ -indikatorn GCaMP6s (grön) och VA-motorneuroner uttrycker channelrhodopsin-varianten, Chrimson (magenta)7. (B) Schematisk avbildningsmetod för montering av maskar för Ca++ -mätningar. (1) På ett rent mikroskopglas, (2) placera 2 μL 0,05 μm polypärlor, (3) använd en platinatråd ("maskplockning") för att lägga till en liten kula av superlim och (4) virvla in i lösningen för att generera trådformiga limsträngar. (5) Lägg till 3 μl M9-buffert. (6) Placera cirka tio L4-larver i lösningen, (7) applicera täckglas och försegla kanter med vaselin/vax. (C–D) Aktivering av VA-neuroner korrelerar med Ca++ -transienter i DD1-ryggar. GCaMP6s fluorescens avbildad (med 0,5 s intervall) med periodisk ljusaktivering av Chrimson (2,5 s intervall) framkallar Ca++ transienter med (C) +ATR (n = 12) men inte i (D) kontroller (-ATR, n = 12). Paneler är ögonblicksbilder över tid (er), före och efter puls på 561 nm ljus (vertikal rosa linje). Skalstänger = 2 μm. GCaMP6s-signalen förvärvas från en ROI (Region of Interest) vid spetsen av varje ryggrad. (E) GCaMP6s-fluorescens under den inspelningsperiod på 10 s som ritats för +ATR (grön) vs -ATR (kontroll, grå) (n = 12 videor). Vertikala rosa staplar betecknar 561 nm belysning (t.ex. Chrimson-aktivering). Varje djur stimulerades 4 gånger med 561 nm ljus. Mätningar samlades in före och efter varje puls på 561 nm ljus. (F) Diagram över GCaMP6s-fluorescensen före och efter varje puls på 561 nm ljus. GCaMP6s fluorescens mättes 1 s efter varje puls på 561 nm ljus. Eftersom prover inte distribueras normalt användes ett parat icke-parametriskt Friedman-test för att korrigera för flera jämförelser av GCaMP6s fluorescens före vs. efter 561 nm ljusstimulering för maskar odlade antingen med ATR (+ATR, grön) (*** p = 0,0004, n = 48 mätningar) eller i frånvaro av ATR (-ATR, grå) (NS, Inte signifikant, p = 0,0962, n = 48 mätningar). Denna siffra har ändrats från referens2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62676/62676fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Tilläggsfil 1: Lista över plasmider som används i studien. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62676/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Tilläggsfil 2: Sammansättning och beredning av M9-buffert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62676/Supplementary%20File%202.docx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Dendritiska spines är viktiga cellulära egenskaper i nervsystemet. Här beskrivs levande avbildningsmetoder för att bedöma strukturen och funktionen hos dendritiska ryggar i C. elegans. Dessa tillvägagångssätt stöder utvecklingen av mutanta skärmar för gener som definierar dendritisk ryggradsform eller funktion.

Imaging Dendritic Spines i Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are specialized sites of synaptic innervation modulated by activity and serve as substrates for learning and memory. Recently, dendritic ...

Detta protokoll beskriver metoder för att visualisera dendritiska ryggradsmorfologier och kalciumtransienter i C.elegans-neuroner. Vårt tillvägagångssätt bör underlätta genetiska tillvägagångssätt för att upptäcka determinanter för en ryggradsmorfogenes och funktion. Vårt protokoll innehåller dendritiska ryggar i GABAergic neuroner.Spines i andra klasser av C.elegans neuroner kan också undersökas med dessa metoder. Vårt protokoll beskriver metoder för immobilisering av levande C.elegans. Det är särskilt viktigt att förhindra djurrörelser under bildförvärv och att välja rätt laserkonfigurationer för att excitera och registrera neuronal aktivitet.För att få högupplösta bilder, tillsätt tre mikroliter bedövningslösning och mängd 15 till 20 unga vuxna maskar på 10% agaroskuddar. Applicera sedan täckglaset för att immobilisera maskarna och försegla täckglasets kanter med en smält självhäftande tätningsblandning. För ett superupplösningsförvärv, använd ett laserskanningskonfokalmikroskop utrustat med superupplösningsmikroskopi.Skaffa Z-stackar med den stegstorlek som rekommenderas av tillverkarens programvara. Samla en serie optiska sektioner som sträcker sig över den totala volymen av dorsal D- eller DD-ventralprocessen. Skicka in Z-stackarna för bildbehandling med tillverkarens programvara och analysera bilder med en poäng högre än sju.För Nyquists förvärv, använd ett konfokalmikroskop för laserskanning och välj den optimala pixelstorleken för ljusets våglängd och objektivlinsens numeriska bländare. Skicka sedan in stacken för 3D-dekonvolution med hjälp av en automatisk algoritm. För bildanalys, använd en lämplig bildbehandlingsprogramvara för att skapa projektioner med maximal intensitet av Z-staplarna.Och räkna manuellt utsprången på DD-dendriten. Bestäm sedan längden på den poängsatta DD-dendriten för att beräkna tätheten av spines per 10 mikrometer DD-dendrit. Klassificera sedan ryggraden som tunn eller svamp, filopodial, stubbig eller grenad.Med hjälp av konventionella tekniker som mikroinjektion skapar du transgena maskar som uttrycker kalciumsensorn GCaMP i DD-neuroner och Chrimson, en rödförskjuten kanalrhodopsin i presynaptiska VA-neuroner. Förbered sedan alla trans-retinal- eller ATR-plattor under en laminär huva genom att tillsätta 300 mikroliter övernattad OP50-bakteriekultur och 0,25 mikroliter ATR till varje 60 millimeter nematodtillväxtmedium näringsagarplatta. Sprid sedan kulturen med en steril glasstäng.För kontrollplattor, tillsätt 300 mikroliter OP50-bakterier och 0,25 mikroliter etanol. För att tillåta bakterietillväxt, inkubera plattorna vid rumstemperatur i 24 timmar, skyddade mot omgivande ljus. För att ställa in experimentet, placera fem L4-steglarver på OP50-seedade ATR- eller kontrollplattor och inkubera plattorna i mörkret vid 23 grader Celsius.Efter tre dagar, använd ett stereodissekeringsmikroskop för att bekräfta vulvautvecklingen och välj L4-stegavkomma från ATR- och kontrollplattorna för avbildning. Placera sedan två mikroliter 0,05 mikrometer polypärlor på en mikroskopbild. Och placera cirka 10 L4 larver i lösningen.Använd en platinatråd och tillsätt en liten kula superlim till lösningen. Virvla lösningen försiktigt för att generera trådformiga limsträngar. Tillsätt sedan tre mikroliter M9-buffert.Applicera sedan en täckglidning och täta kanterna som visats tidigare. För att registrera framkallade kalciumtransienter i de dendritiska ryggraden, använd ett snurrande skivkonfokalmikroskop och justera mikroskopsteget för att placera DD-ryggraden i fokalplanet. Ställ sedan in time-lapse-förvärv för att belysa provet med en 488 nanometer laserlinje i varje ram för att detektera GCaMP-fluorescens och en 561 nanometer laserlinje med jämna mellanrum för Chrimson-excitation.För kalciumavbildning in vivo, använd 2D-dekonvolution och bildjustering för att korrigera mindre avvikelser från maskrörelsen under förvärvet. Definiera sedan DD-dendritisk ryggrad som intresseområdet eller ROI. Duplicera avkastningen och flytta till en angränsande region inuti masken för att samla in bakgrundssignalen.Använd sedan lämplig programvara, exportera GFP-intensiteterna till Excel för varje tidpunkt och subtrahera bakgrundsfluorescens från ryggradens ROI-fluorescens. Bestäm förändringen i fluorescens genom att subtrahera GFP-fluorescensen i ramen omedelbart före 561 nanometer excitation eller vid noll från varje tidpunkt efter excitation eller Delta F.Dela sedan med F noll för att bestämma Delta F över F noll. Och rita de normaliserade spåren.Bestäm först om data normalt distribueras med hjälp av ett Shapiro-Wilk-test. För data som normalt inte distribueras använder du en icke-parametrisk ANOVA med post-hoc-korrigering för flera tester. Alternativt, för mätningar som visar normal eller Gaussisk fördelning, utför ett parat parametriskt ANOVA-test för varje mätning av GCaMP-fluorescens före och efter varje 561 nanometerpuls.Och korrigera för flera jämförelser i var och en av de två grupperna. Märkning av DD-dendritiska ryggar med tre oberoende markörer, cytosolisk mCherry, MYR: mRuby och LifeAct: GFP gav en genomsnittlig densitet på 3,4 DD dendritiska ryggar per 10 mikron DD-dendrit hos unga vuxna av vild typ. GFP:Utropfinmarkören uteslöts från denna analys eftersom den gav en signifikant lägre ryggradstäthet, potentiellt på grund av interaktioner mellan övergödning och aktincytoskelettet som driver ryggradsmorfogenesen.Den levande cellavbildningsmetoden bekräftade att den tunna svampformade morfologin hos DD-ryggraden dominerar hos vuxna jämfört med alternativa ryggradsformer som filopodial, stubbig och grenad. Aktivering av DD-dendritiska ryggar bedömdes genom presynaptisk kolinerg signalering i transgena maskar som uttrycker GCaMP i DD-neuroner och Chrimson i presynaptiska VA-neuroner. Övergående skurar av GCaMP-signal detekterades i DD-ryggar omedelbart efter optogenetisk aktivering av Chrimson i presynaptiska VA-neuroner.Ett kontrollexperiment i frånvaro av ATR bekräftade att måttet till GCaMP-signalen beror på den optogenetiska aktiveringen av Chrimson som är strikt ATR-beroende. För att visualisera DD-spines är det bäst att avbilda djur som ligger på deras sida, till exempel ryggraden som sticker ut är i rät vinkel mot ljusvägen. Med denna metod kan forskare också använda farmakologiska manipuleringar för att förstå mekanismerna som driver kalciumtransienter i DD-ryggar.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP) av fluorescens märkta proteiner i Dendritutskotten hos odlade hippocampus nervceller

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Spänningskänsliga Dye Inspelning från axoner, dendriter och Dendritutskotten av enskilda nervceller i hjärnan skivor

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

ETT<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Modellsystem för Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Snabb Micro-iontophoresis av glutamat och GABA: Ett användbart verktyg för att undersöka Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Metoder för att studera verkningsmekanismerna för antipsykotiska läkemedel i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Imaging Dendritutskotten av Rat Primär hippocampus nervceller med hjälp av strukturerade Illumination Mikroskopi

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging av Dendritutskotten i mus Cortex Använda en förtunnad-skalle Förberedelse

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Agarose Microchambers för Långsiktig Kalcium Imaging av<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Analysera Dendritic morfologi i kolumner och lager

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Nutritionell statusbaserad koppar-aversionsanalys

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their ...