Name: growth, purification, and titration of oncolytic herpes simplex virus
Uploaded: 2021-05-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus at JoVE.com

تم دعم الأبحاث في مختبر ساها جزئيا بأموال من إدارة المكافحة (W81XWH-20-1-0702) ومؤسسة دودج جونز-أبيلين. صموئيل د. رابكين وميليسا ر.M همفري كانا مدعومين جزئيا من قبل المعاهد القومية للصحة (R01 CA160762).

1) oHSV النمو
ملاحظة: ضمان موافقة لجنة السلامة البيولوجية المؤسسية قبل العمل مع oHSV. أجريت هذه الدراسة بموجب البروتوكول المعتمد رقم 18007 للجنة. الحفاظ على احتياطات BSL2: تبييض جميع الأنابيب والنصائح والأنابيب وغيرها من المواد التي تتلامس مع الفيروس. رش قفازات مع الكحول isopropyl 70٪ قبل ?...

<ol>
	<li>Harrington, K., Freeman, D. J., Kelly, B., Harper, J., Soria, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+oncolytic+virotherapy+in+cancer+treatment.">Optimizing oncolytic virotherapy in cancer treatment.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (9), 689-706 (2019).</li><li>Zhang, S., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discovery+and+development+of+oncolytic+viruses:+are+they+the+future+of+cancer+immunotherapy.">The discovery and development of oncolytic viruses: are they the future of cancer immunotherapy.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (4), 391-410 (2021).</li><li>Bommareddy, P. K., Peters, C., Saha, D., Rabkin, S. D., Kaufman, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+herpes+simplex+viruses+as+a+paradigm+for+the+treatment+of+cancer.">Oncolytic herpes simplex viruses as a paradigm for the treatment of cancer.</a> Annual Review of Cancer Biology. 2 (1), 155-173 (2018).</li><li>Peters, C., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+herpes+viruses+as+oncolytics.">Designing herpes viruses as oncolytics.</a> Molecular Therapy-Oncolytics. 2, 15010 (2015).</li><li>Nguyen, H. -. M., Saha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+current+state+of+oncolytic+herpes+simplex+virus+for+glioblastoma+treatment.">The current state of oncolytic herpes simplex virus for glioblastoma treatment.</a> Oncolytic Virotherapy. 10, 1-27 (2021).</li><li>Koch, M. S., Lawler, S. E., Chiocca, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSV-1+oncolytic+viruses+from+bench+to+bedside:+an+overview+of+current+clinical+trials.">HSV-1 oncolytic viruses from bench to bedside: an overview of current clinical trials.</a> Cancers. 12 (12), 3514 (2020).</li><li>Menotti, L., Avitabile, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+oncolytic+immunovirotherapy:+the+blossoming+branch+of+multimodal+therapy.">Herpes simplex virus oncolytic immunovirotherapy: the blossoming branch of multimodal therapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8310 (2020).</li><li>Nguyen, H. M., Guz-Montgomery, K., Saha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+virus+encoding+a+master+pro-inflammatory+cytokine+interleukin+12+in+cancer+immunotherapy.">Oncolytic virus encoding a master pro-inflammatory cytokine interleukin 12 in cancer immunotherapy.</a> Cells. 9 (2), 400 (2020).</li><li>Agarwalla, P. K., Aghi, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+herpes+simplex+virus+engineering+and+preparation.">Oncolytic herpes simplex virus engineering and preparation.</a> Methods in Molecular Biology. 797, 1-19 (2012).</li><li>Grosche, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+propagation,+titration+and+single-step+growth+curves.">Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves.</a> Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).</li><li>Sutter, S. O., Marconi, P., Meier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+growth,+preparation,+and+assay.">Herpes simplex virus growth, preparation, and assay.</a> Methods in Molecular Biology. 2060, 57-72 (2020).</li><li>Froechlich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrity+of+the+antiviral+STING-mediated+DNA+sensing+in+tumor+cells+is+required+to+sustain+the+immunotherapeutic+efficacy+of+herpes+simplex+oncolytic+virus.">Integrity of the antiviral STING-mediated DNA sensing in tumor cells is required to sustain the immunotherapeutic efficacy of herpes simplex oncolytic virus.</a> Cancers. 12 (11), 3407 (2020).</li><li>Froechlich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+novel+mesothelin-targeted+oncolytic+herpes+virus+and+implemented+strategies+for+manufacturing.">Generation of a novel mesothelin-targeted oncolytic herpes virus and implemented strategies for manufacturing.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 477 (2021).</li><li>Mosca, J. D., Pitha, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+and+posttranscriptional+regulation+of+exogenous+human+beta+interferon+gene+in+simian+cells+defective+in+interferon+synthesis.">Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis.</a> Molecular and Cellular Biology. 6 (6), 2279-2283 (1986).</li><li>Gousseinoz, E., Kools, W., Pattnaik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+impurity+reduction+in+viral+vaccine+manufacturing.">Nucleic acid impurity reduction in viral vaccine manufacturing.</a> BioProcess International. 12 (2), 59-68 (2014).</li><li>Diefenbach, R. J., Fraefel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus:+methods+and+protocols.">Herpes simplex virus: methods and protocols.</a> Methods in Molecular Biology. , (2014).</li><li>Hadi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+trial+to+prepared+&#947;1+34.5+herpes+simplex+virus+1+immunogene+by+cloning+technique.">An experimental trial to prepared &#947;1 34.5 herpes simplex virus 1 immunogene by cloning technique.</a> Systematic Review Pharmacy. 11 (5), 140-149 (2020).</li><li>Kuroda, T., Martuza, R. L., Todo, T., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flip-Flop+HSV-BAC:+bacterial+artificial+chromosome+based+system+for+rapid+generation+of+recombinant+herpes+simplex+virus+vectors+using+two+independent+site-specific+recombinases.">Flip-Flop HSV-BAC: bacterial artificial chromosome based system for rapid generation of recombinant herpes simplex virus vectors using two independent site-specific recombinases.</a> BMC Biotechnology. 6, 40 (2006).</li><li>Motamedifar, M., Noorafshan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytopathic+effect+of+the+herpes+simplex+virus+type+1+appears+stereologically+as+early+as+4+h+after+infection+of+Vero+cells.">Cytopathic effect of the herpes simplex virus type 1 appears stereologically as early as 4 h after infection of Vero cells.</a> Micron. 39 (8), 1331-1334 (2008).</li><li>Blaho, J. A., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus:+propagation,+quantification,+and+storage.">Herpes simplex virus: propagation, quantification, and storage.</a> Current Protocols in Microbiology. , 1 (2005).</li><li>Malenovska, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+stabilizers+and+rates+of+freezing+on+preserving+of+structurally+different+animal+viruses+during+lyophilization+and+subsequent+storage.">The influence of stabilizers and rates of freezing on preserving of structurally different animal viruses during lyophilization and subsequent storage.</a> Journal of Applied Microbiology. 117 (6), 1810-1819 (2014).</li><li>Vahlne, A. G., Blomberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+herpes+simplex+virus.">Purification of herpes simplex virus.</a> Journal of General Virology. 22 (2), 297-302 (1974).</li><li>Sathananthan, B., Rodahl, E., Flatmark, T., Langeland, N., Haarr, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+herpes+simplex+virus+type+1+by+density+gradient+centrifugation+and+estimation+of+the+sedimentation+coefficient+of+the+virion.">Purification of herpes simplex virus type 1 by density gradient centrifugation and estimation of the sedimentation coefficient of the virion.</a> APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 105 (3), 238-246 (1997).</li><li>Mundle, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-purity+preparation+of+HSV-2+vaccine+candidate+ACAM529+is+immunogenic+and+efficacious+in+vivo.">High-purity preparation of HSV-2 vaccine candidate ACAM529 is immunogenic and efficacious in vivo.</a> PLoS One. 8 (2), 57224 (2013).</li><li>Jiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+cobalt+affinity+chromatography+provides+a+novel,+efficient+method+for+herpes+simplex+virus+type+1+gene+vector+purification.">Immobilized cobalt affinity chromatography provides a novel, efficient method for herpes simplex virus type 1 gene vector purification.</a> Journal of Virology. 78 (17), 8994-9006 (2004).</li><li>Grosche, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+propagation,+titration+and+single-step+growth+curves.">Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves.</a> Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).</li><li>Svennerholm, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+herpes+simplex+virus+virions+and+nucleocapsids+on+Percoll+gradients.">Separation of herpes simplex virus virions and nucleocapsids on Percoll gradients.</a> Journal of Virological Methods. 1 (6), 303-309 (1980).</li><li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+concentration+determination+through+plaque+assays:+using+traditional+and+novel+overlay+systems.">Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).</li><li>Miyatake, S., Iyer, A., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+targeting+of+herpes+simplex+virus+for+cell-specific+replication.">Transcriptional targeting of herpes simplex virus for cell-specific replication.</a> Journal of Virology. 71 (7), 5124-5132 (1997).</li><li>Fabiani, M., Limongi, D., Palamara, A. T., De Chiara, G., Marcocci, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+titrate+herpes+simplex+virus-1+(HSV-1)+using+laser-based+scanning+of+near-infrared+fluorophores+conjugated+antibodies.">A novel method to titrate herpes simplex virus-1 (HSV-1) using laser-based scanning of near-infrared fluorophores conjugated antibodies.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1085 (2017).</li></ol>

يبدأ البروتوكول بنمو oHSV في خلايا Vero منخفضة المرور. يجب أن يكون التقاء أحادي الطبقة الخلية Vero ~ 80٪ في وقت تلقيح الفيروسات كما يمكن للخلايا المتضخمة تطوير هياكل ليفية ضيقة يمكن أن تقلل من دخول oHSV إلى خلايا Vero20. مرة واحدة لوحظ 90-100٪ CPE، تتم إزالة الطبيعة الثقافية، يتم حصاد الخلايا، ...

الفيروسات الأورام (OVs) هي شكل ناشئ وفريد من أشكال العلاج المناعي للسرطان. OVs تكرار انتقائي في وlyse الخلايا السرطانية (تجنيب الخلايا الطبيعية / السليمة)1 في حين حفز مناعة مضادة للورم2. فيروس الهربس البسيط Oncolytic (oHSV) هو واحد من الفيروسات الأكثر دراسة على نطاق واسع بين جميع OVs. هو أبعد على طول في العيادة, مع Talimogene laherparepvec (T-VEC) كونها OV الأولى والوحيدة التي تتلقى موافقة ادارة الاغذية والعقاقير في الولايات المتحدة لعلاج سرطان الجلد المتقدمة3. بالإضافة إلى T-VEC، يتم اختبار العديد من oHSVs الأخرى المعدلة وراثيا قبل السريرية وسريريا في أنواع السرطان المختلفة3،4،5،6،7،8. وقد زادت التكنولوجيا الحيوية المتقدمة الحالية الحمض النووي المؤتلف من جدوى هندسة جديدة oHSVs الترميز لtransgene العلاجية (ق)3،5. يعد وجود نظام فعال لنشر oHSV وتنقية وتأليف التيتر أمرا بالغ الأهمية قبل أن يتم اختبار أي oHSV (تم تطويره حديثا) في المختبر وفي الدراسات الحية. تصف هذه الورقة طريقة بسيطة خطوة بخطوة لنمو oHSV (في خلايا Vero) ، والتنقية (عن طريق طريقة تدرج السكروز) ، والتكييف (بواسطة فحص لوحة oHSV في خلايا Vero) (الشكل 1). ويمكن اعتماده بسهولة في أي إعداد مختبري من المستوى 2 للسلامة البيولوجية (BSL2) لتحقيق مخزون فيروسي عالي الجودة للدراسات ما قبل السريرية.
Vero، وهو خط خلايا الكلى القرد الأخضر الأفريقي، هو خط الخلية الأكثر استخداما لنشر oHSV9،10،11،12،13 كما خلايا فيرو لديها معيبة المضادة للفيروسات الانترفيرون إشارة المسار14. خطوط الخلايا الأخرى مع محفز معطل من جينات الإنترفيرون (STING) الإشارات يمكن أيضا أن تستخدم لنمو oHSV12,13. يستخدم هذا البروتوكول خلايا Vero لنمو oHSV و المقايسة البلاك. بعد الانتشار، يتم حصاد الخلايا المصابة ب oHSV، والتحلل، وتعرض للتنقية، حيث يتم التعامل مع الخلايا المتحللة أولا بنوكلياز البنزونازي لإضعاف الحمض النووي للخلية المضيفة، ومنع تراكم البروتين الحمضي النووي، والحد من لزوجة ليسات الخلية. كما التنشيط السليم للبنزوناز غالبا ما يتطلب ملغ2 +, 1-2 M MgCl2 يستخدم في هذا البروتوكول15. يتم التخلص من حطام الخلية المضيفة من ليسات الخلية المعالجة بالبنزوناز عن طريق الترشيح التسلسلي قبل الطرد المركزي عالي السرعة من السكروز المتدرجة. يساعد وسادة محلول السكروز اللزجة بنسبة 25٪ على ضمان معدل أبطأ لهجرة الفيروس من خلال طبقة السكروز ، تاركا المكونات المرتبطة بالخلية المضيفة في الفائقة ، وبالتالي تحسين تنقية والحد من فقدان الفيروس في بيليه16. ثم يتم titrated oHSV المنقى على خلايا Vero ، ويتم تصور لويحات الفيروسية من قبل Giemsaتلطيخ 17 أو X-gal تلطيخ (لترميز LacZ oHSVs)18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.7 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polypropylene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E8263-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>179693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3007003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-262-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-21-021-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Glucose Dulbecco&#8217;s Phosphate-buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human immune globulin</td>
			<td>Gamastan</td>
			<td>NDC 13533-335-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Sterilization filter, 250 mL</td>
			<td>Nalgene, Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-25E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Sterilization filter, 500 mL</td>
			<td>Nalgene, Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-25C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Red solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N4638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>&#160;15710S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate rocker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>88861043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferricyanide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferrocyanide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 16R Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75004381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 21R Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75002446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 0.45 PVDF</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLHV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 0.8 MCE</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLAA033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, 5 &#181;m PVDF</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLSV025LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T150 culture flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>355001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>MP Biomedicals LLC</td>
			<td>816116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic water bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX-952-116R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-101-RF</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

growth, purification, and titration of oncolytic herpes simplex virus

الفيروسات الأورام (OVs)، مثل فيروس الهربس البسيط oncolytic (oHSV)، هي استراتيجية علاج سريعة النمو في مجال العلاج المناعي للسرطان. OVs، بما في ذلك oHSV، تكرار انتقائي في وقتل الخلايا السرطانية (تجنيب الخلايا السليمة / الطبيعية) في حين حفز المناعة المضادة للورم. وبسبب هذه الخصائص الفريدة، يتم استخدام استراتيجيات العلاج القائمة على oHSV بشكل متزايد لعلاج السرطان، قبل السريرية وسريريا، بما في ذلك talimogene laherparevec المعتمدة من إدارة الأغذية والعقاقير (T-Vec). النمو والتنقية والتكرير هي ثلاث تقنيات مختبرية أساسية لأي OVs ، بما في ذلك oHSVs ، قبل أن يمكن استخدامها للدراسات التجريبية. تصف هذه الورقة طريقة بسيطة خطوة بخطوة لتضخيم oHSV في خلايا Vero. كما oHSVs تتكاثر، فإنها تنتج تأثير cytopathic (CPE) في خلايا Vero. مرة واحدة 90-100٪ من الخلايا المصابة تظهر CPE، يتم حصادها بلطف، تعامل مع البنزوناز وكلوريد المغنيسيوم (MgCl2)،وتصفيتها، وتعرض للتنقية باستخدام طريقة السكروز التدرج. بعد تنقية، يتم تحديد عدد oHSV المعدية (المعينة كوحدات تشكيل البلاك أو PFUs) من خلال "فحص البلاك" في خلايا Vero. يمكن استخدام البروتوكول الموصوف هنا لإعداد مخزون oHSV عالي التأر للدراسات المختبرية في زراعة الخلايا وفي التجارب الحيوانية الحية.

ويرد عرض موجز للبروتوكول بأكمله في الشكل 1، والذي يمثل الخطوات الحاسمة التي ينطوي عليها نمو وتنقية و titration من oHSV. CPE في خلايا Vero يمكن الكشف عنها في وقت مبكر من 4 ح بعد الإصابة HSV19. يوضح الشكل 2 CPE في خلايا Vero في ثلاث نقاط زمنية مختلفة بعد عدوى oHSV. يتم ?...

Watch this Scientific Journal Video about Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus at JoVE.com

Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus

في هذه المخطوطة، نقوم بوصف طريقة بسيطة للنمو والتنقية والتكرير لفيروس الهربس البسيط oncolytic للاستخدام قبل السريري.

نمو وتنقية وتكرير فيروس الهربس البسيط Oncolytic

Oncolytic viruses (OVs), such as&#160;the&#160;oncolytic herpes simplex virus (oHSV), are a rapidly growing treatment strategy in the field of cancer ...

فيروس الهربس البسيط Oncolytic هو شكل ناشئ من العلاج المناعي للسرطان. إن وجود نظام فعال لنشر الفيروس وتنقية وتحديده بالتأليه أمر بالغ الأهمية للاستخدام في الدراسات التجريبية. هذه الطريقة بسيطة جدا ويمكن اعتمادها بسهولة في أي مستوى السلامة البيولوجية اثنين من إعداد المختبر لتلقي مخزون الفيروسية عالية الجودة للدراسات ما قبل السريرية.إنتاج عالية الجودة، والمخزون الفيروسي النقي أمر بالغ الأهمية لأنه يستخدم لدراسة الاستجابة المناعية المضادة للسرطان وتطوير شكل جديد من العلاج المناعي السرطان القائم على الفيروس. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتنقية أي نوع البرية أو فيروس الهربس البسيط المعدلة وراثيا. يجب أن يكون هذا البروتوكول سهلة القراءة وسهلة المتابعة للفرد الذي لم يسبق له تنفيذ هذه التقنية من قبل.يجب أن تكون المواد والكواشف المذكورة في مكانها قبل تجربة هذه التقنية لأول مرة. ابدأ بغسل قوارير T-150 سم مربع مع جلوكوز DPBS مرتفع مرتين مع تكملة 1٪ IFCS. أسبيرات DPBS وإضافة سبعة ملليلتر من الفيروس inoculum لكل قارورة.يهز بلطف قوارير لمدة خمس دقائق واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 1.5 إلى 2 ساعة. ثم قم بإزالة inoculum وإضافة 25 ملليلتر من DMEM تكملها مع 1٪ IFCS إلى كل قارورة. بعد الحضانة عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة يومين إلى أربعة أيام، اجمع 20 ملليلتر من الناطقة الثقافية من كل قارورة إلى 50 أنبوب طرد مركزي ملليلتر.باستخدام مكشطة الخلية، كشط الخلايا من أسفل القوارير. إضافة ما يقرب من 15 ملليلتر من الثقافة التي تم جمعها سابقا supernatant إلى كل قارورة لجعل حجم يصل إلى 20 ملليلتر، ثم استخدام ماصة المصلية العقيمة 10 ملليلتر لغسل بلطف الجزء السفلي من القوارير عدة مرات. جمع الخلايا مع المتوسطة في 50 ملليلتر أنابيب الطرد المركزي المخروطية وضعت على الجليد.طرد الأنابيب في 300 مرة G لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. Resuspend كل بيليه تماما في 1.25 ملليلتر من الفيروس العازلة، أو VB، و 1.25 ملليلتر من الثقافة التي تم جمعها سابقا supernatant. اخلط جميع الكريات التي أعيد إنفاقها في أنبوب طرد مركزي مخروطي واحد 50 ملليلتر.المفاجئة تجميد الخلايا التي أعيد إنفاقها باستخدام الجليد الجاف والإيثانول 100٪ وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية. إذابة الخلايا المجمدة قطعت سابقا في حمام مائي دافئ في 37 درجة مئوية و sonicate لمدة دقيقة واحدة لمدة ثلاث دورات في حمام مائي. إضافة 175 وحدة من نواة البنزوناسي واثنين من ميكرولتر من اثنين من كلوريد المغنيسيوم ملليمولار لكل ملليلتر من ليسات الخلية ودوامة.بعد حضانة لمدة 30 دقيقة وحمام مائي دافئ عند 37 درجة مئوية ، ضع الأنبوب على الجليد. تدور الخلية lysate في 300 مرة G لمدة 10 دقائق. جمع supernatant في أنبوب طرد مركزي مخروطي 50 ملليلتر جديدة وإعادة إنفاق بيليه الخلية في 500 ميكرولتر من VB. تعيينها على أنها بيليه واحد.تدور supernatant التي تم جمعها مرة أخرى في 500 مرة G لمدة 10 دقائق وتخزين supernatant بشكل منفصل في أنبوب طرد مركزي مخروطي الطازجة 50 ملليلتر لاستخدامها في وقت لاحق. Resuspend بيليه الخلية في 500 ميكرولتر من VB، وتعيينه على أنه بيليه اثنين. الجمع بين بيليه resuspended واحد و بيليه اثنين في أنبوب الطرد المركزي 1.75 ملليلتر جديدة ودوامة و sonicate مرتين في حمام مائي قبل الغزل الأنابيب في 400 مرة G لمدة 10 دقائق.جمع supernatant من أنبوب الطرد المركزي 1.7 ملليلتر والجمع بين ذلك مع supernatant جمعت سابقا 50 ملليلتر أنبوب الطرد المركزي المخروطي. تصفية supernatant من خلال مرشح غشاء PVDF خمسة ميكرومتر معقمة في أنبوب طرد مركزي جديد 50 ملليلتر يسمى أنبوب واحد. أضف ملليلتر واحد من VB إلى أنبوب الطرد المركزي 50 ملليلتر ، أفرغ بعد تصفية الفائق من الخطوة السابقة ، دوامة ، وتمريره من خلال نفس مرشح غشاء PVDF الموضوع على الأنبوب الأول.تمرير filtrate من أنبوب واحد من خلال عقيمة 0.8 ميكرومتر MCE مرشح الغشاء وضعت على أنبوب طرد مركزي 50 ملليلتر جديدة تسمى أنبوب اثنين. إضافة ملليلتر واحد من VB إلى أنبوب واحد إفراغ، دوامة، وتمريره من خلال مرشح MCE نفسه وضعت على أنبوب اثنين. تمرير filtrate من أنبوب اثنين من خلال معقمة 0.45 ميكرومتر PVDF مرشح وضعت على أنبوب طرد مركزي 50 ملليلتر جديدة وصفت أنبوب ثلاثة.كما هو موضح من قبل، كرر غسل أنبوب اثنين مع ملليلتر واحد من VB لإضافة filtrate إلى أنبوب ثلاثة. في هذا التحليل التمثيلي ، يمكن ملاحظة التأثير الباثوتي في خلايا Vero في 36 و 48 و 72 ساعة بعد عدوى oHSV مع تقريب الخلايا المصابة. مستوى متزايد من CPE مع مرور الوقت واضح كما تصور من قبل التعبير mCherry.في 72 ساعة بعد العدوى ، كانت ملطخة لويحات الفيروسية مع X - غال لتصور oHSVs مع التعبير lacZ. تنقية بلطف قبالة الخلايا المصابة بالفيروس وغسل بلطف الجزء السفلي على القارورة أمر بالغ الأهمية للحفاظ على جميع الخلايا المصابة HSV سليمة بحيث يمكن الحصول على مخزون الفيروسية التيتر عالية.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

إنشاء فيروس ابشتاين بار النمو وتحولت خطوط الخليوي Lymphoblastoid

Infection of B cells with Epstein-Barr virus (EBV) leads to proliferation and subsequent immortalization, resulting in establishment of lymphoblastoid ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

والثقافة الخلية العصبية الأولية نظام لدراسة فيروس العقبول البسيط الكمون وإعادة تنشيط

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

تنقية تقارب من المجمعات الأنفلونزا فيروس بروتين نووي ريبوزي من لونين من الخلايا المصابة

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

العدوى فيفو السابقين الفئران البشرة مع فيروس الهربس البسيط من النوع 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

عزل وتحليل العدلة لتحديد ما دورها في الغدد اللمفاوية حساسية الخلية وكلاء العلاجية

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

كشف وإزالة التلوث Nuclease أثناء تنقية Integrase فيروس مزبد النموذج المؤتلف

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

الجمعية وتنقية من النموذج إينتاسوميس فيروس مزبد

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

التحليل الزمني إزفاء النووية إلى هيولى بروتين الفيروس 1 الحلأ البسيط بالفحص المجهري [كنفوكل] إيمونوفلوريسسينت

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

وأعرب عن تحديد الترميز وفئات الحمض النووي الريبي غير الترميز في الخنازير الدم كله

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

جيل، والتضخيم، ومعايرة المؤتلف من فيروسات الجهاز التنفسي المخلوي

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...