Name: growth, purification, and titration of oncolytic herpes simplex virus
Uploaded: 2021-05-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus at JoVE.com

Forskning i Saha lab blev delvist støttet af midler fra DOD (W81XWH-20-1-0702) og Dodge Jones Foundation-Abilene. Samuel D. Rabkin og Melissa R.M. Humphrey blev delvist støttet af NIH (R01 CA160762).

1) oHSV vækst
BEMÆRK: Sørg for institutionel godkendelse af biosikkerhedsudvalg, før du arbejder med oHSV. Denne undersøgelse blev gennemført i henhold til den godkendte IBC-protokol nr. Bevar BSL2 forholdsregler: blege alle pipetter, tips, rør og andre materialer, der kommer i kontakt med virus. Sprayhandsker med 70% isopropylalkohol, før hænderne forlader BSL2-cellekulturhætten. Vask altid hænder grundigt med sæbevand efter at have arbejdet med en virus.
<ol><li>På dag -1, fr?...

<ol>
	<li>Harrington, K., Freeman, D. J., Kelly, B., Harper, J., Soria, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+oncolytic+virotherapy+in+cancer+treatment.">Optimizing oncolytic virotherapy in cancer treatment.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (9), 689-706 (2019).</li><li>Zhang, S., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discovery+and+development+of+oncolytic+viruses:+are+they+the+future+of+cancer+immunotherapy.">The discovery and development of oncolytic viruses: are they the future of cancer immunotherapy.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (4), 391-410 (2021).</li><li>Bommareddy, P. K., Peters, C., Saha, D., Rabkin, S. D., Kaufman, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+herpes+simplex+viruses+as+a+paradigm+for+the+treatment+of+cancer.">Oncolytic herpes simplex viruses as a paradigm for the treatment of cancer.</a> Annual Review of Cancer Biology. 2 (1), 155-173 (2018).</li><li>Peters, C., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+herpes+viruses+as+oncolytics.">Designing herpes viruses as oncolytics.</a> Molecular Therapy-Oncolytics. 2, 15010 (2015).</li><li>Nguyen, H. -. M., Saha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+current+state+of+oncolytic+herpes+simplex+virus+for+glioblastoma+treatment.">The current state of oncolytic herpes simplex virus for glioblastoma treatment.</a> Oncolytic Virotherapy. 10, 1-27 (2021).</li><li>Koch, M. S., Lawler, S. E., Chiocca, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSV-1+oncolytic+viruses+from+bench+to+bedside:+an+overview+of+current+clinical+trials.">HSV-1 oncolytic viruses from bench to bedside: an overview of current clinical trials.</a> Cancers. 12 (12), 3514 (2020).</li><li>Menotti, L., Avitabile, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+oncolytic+immunovirotherapy:+the+blossoming+branch+of+multimodal+therapy.">Herpes simplex virus oncolytic immunovirotherapy: the blossoming branch of multimodal therapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8310 (2020).</li><li>Nguyen, H. M., Guz-Montgomery, K., Saha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+virus+encoding+a+master+pro-inflammatory+cytokine+interleukin+12+in+cancer+immunotherapy.">Oncolytic virus encoding a master pro-inflammatory cytokine interleukin 12 in cancer immunotherapy.</a> Cells. 9 (2), 400 (2020).</li><li>Agarwalla, P. K., Aghi, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+herpes+simplex+virus+engineering+and+preparation.">Oncolytic herpes simplex virus engineering and preparation.</a> Methods in Molecular Biology. 797, 1-19 (2012).</li><li>Grosche, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+propagation,+titration+and+single-step+growth+curves.">Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves.</a> Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).</li><li>Sutter, S. O., Marconi, P., Meier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+growth,+preparation,+and+assay.">Herpes simplex virus growth, preparation, and assay.</a> Methods in Molecular Biology. 2060, 57-72 (2020).</li><li>Froechlich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrity+of+the+antiviral+STING-mediated+DNA+sensing+in+tumor+cells+is+required+to+sustain+the+immunotherapeutic+efficacy+of+herpes+simplex+oncolytic+virus.">Integrity of the antiviral STING-mediated DNA sensing in tumor cells is required to sustain the immunotherapeutic efficacy of herpes simplex oncolytic virus.</a> Cancers. 12 (11), 3407 (2020).</li><li>Froechlich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+novel+mesothelin-targeted+oncolytic+herpes+virus+and+implemented+strategies+for+manufacturing.">Generation of a novel mesothelin-targeted oncolytic herpes virus and implemented strategies for manufacturing.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 477 (2021).</li><li>Mosca, J. D., Pitha, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+and+posttranscriptional+regulation+of+exogenous+human+beta+interferon+gene+in+simian+cells+defective+in+interferon+synthesis.">Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis.</a> Molecular and Cellular Biology. 6 (6), 2279-2283 (1986).</li><li>Gousseinoz, E., Kools, W., Pattnaik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+impurity+reduction+in+viral+vaccine+manufacturing.">Nucleic acid impurity reduction in viral vaccine manufacturing.</a> BioProcess International. 12 (2), 59-68 (2014).</li><li>Diefenbach, R. J., Fraefel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus:+methods+and+protocols.">Herpes simplex virus: methods and protocols.</a> Methods in Molecular Biology. , (2014).</li><li>Hadi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+trial+to+prepared+&#947;1+34.5+herpes+simplex+virus+1+immunogene+by+cloning+technique.">An experimental trial to prepared &#947;1 34.5 herpes simplex virus 1 immunogene by cloning technique.</a> Systematic Review Pharmacy. 11 (5), 140-149 (2020).</li><li>Kuroda, T., Martuza, R. L., Todo, T., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flip-Flop+HSV-BAC:+bacterial+artificial+chromosome+based+system+for+rapid+generation+of+recombinant+herpes+simplex+virus+vectors+using+two+independent+site-specific+recombinases.">Flip-Flop HSV-BAC: bacterial artificial chromosome based system for rapid generation of recombinant herpes simplex virus vectors using two independent site-specific recombinases.</a> BMC Biotechnology. 6, 40 (2006).</li><li>Motamedifar, M., Noorafshan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytopathic+effect+of+the+herpes+simplex+virus+type+1+appears+stereologically+as+early+as+4+h+after+infection+of+Vero+cells.">Cytopathic effect of the herpes simplex virus type 1 appears stereologically as early as 4 h after infection of Vero cells.</a> Micron. 39 (8), 1331-1334 (2008).</li><li>Blaho, J. A., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus:+propagation,+quantification,+and+storage.">Herpes simplex virus: propagation, quantification, and storage.</a> Current Protocols in Microbiology. , 1 (2005).</li><li>Malenovska, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+stabilizers+and+rates+of+freezing+on+preserving+of+structurally+different+animal+viruses+during+lyophilization+and+subsequent+storage.">The influence of stabilizers and rates of freezing on preserving of structurally different animal viruses during lyophilization and subsequent storage.</a> Journal of Applied Microbiology. 117 (6), 1810-1819 (2014).</li><li>Vahlne, A. G., Blomberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+herpes+simplex+virus.">Purification of herpes simplex virus.</a> Journal of General Virology. 22 (2), 297-302 (1974).</li><li>Sathananthan, B., Rodahl, E., Flatmark, T., Langeland, N., Haarr, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+herpes+simplex+virus+type+1+by+density+gradient+centrifugation+and+estimation+of+the+sedimentation+coefficient+of+the+virion.">Purification of herpes simplex virus type 1 by density gradient centrifugation and estimation of the sedimentation coefficient of the virion.</a> APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 105 (3), 238-246 (1997).</li><li>Mundle, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-purity+preparation+of+HSV-2+vaccine+candidate+ACAM529+is+immunogenic+and+efficacious+in+vivo.">High-purity preparation of HSV-2 vaccine candidate ACAM529 is immunogenic and efficacious in vivo.</a> PLoS One. 8 (2), 57224 (2013).</li><li>Jiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+cobalt+affinity+chromatography+provides+a+novel,+efficient+method+for+herpes+simplex+virus+type+1+gene+vector+purification.">Immobilized cobalt affinity chromatography provides a novel, efficient method for herpes simplex virus type 1 gene vector purification.</a> Journal of Virology. 78 (17), 8994-9006 (2004).</li><li>Grosche, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+propagation,+titration+and+single-step+growth+curves.">Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves.</a> Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).</li><li>Svennerholm, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+herpes+simplex+virus+virions+and+nucleocapsids+on+Percoll+gradients.">Separation of herpes simplex virus virions and nucleocapsids on Percoll gradients.</a> Journal of Virological Methods. 1 (6), 303-309 (1980).</li><li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+concentration+determination+through+plaque+assays:+using+traditional+and+novel+overlay+systems.">Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).</li><li>Miyatake, S., Iyer, A., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+targeting+of+herpes+simplex+virus+for+cell-specific+replication.">Transcriptional targeting of herpes simplex virus for cell-specific replication.</a> Journal of Virology. 71 (7), 5124-5132 (1997).</li><li>Fabiani, M., Limongi, D., Palamara, A. T., De Chiara, G., Marcocci, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+titrate+herpes+simplex+virus-1+(HSV-1)+using+laser-based+scanning+of+near-infrared+fluorophores+conjugated+antibodies.">A novel method to titrate herpes simplex virus-1 (HSV-1) using laser-based scanning of near-infrared fluorophores conjugated antibodies.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1085 (2017).</li></ol>

Protokollen starter med væksten af oHSV i lav-passage Vero celler. Sammenløbet af Vero celle monolayer bør ~ 80% på tidspunktet for virus podning som tilgroede celler kan udvikle stramme fiber strukturer, der kan reducere oHSV indrejse i Vero celler20. Når 90-100% CPE er observeret, fjernes dyrknings-supernatanten, cellerne høstes, genbruges i VB/supernatant (se trin 1.4.6), snap-frosne og opbevares ved -80 °C til senere rensning. Blaho og kolleger ansat en lidt anden metode til høst og op...

Oncolytic virus (OVs) er en ny og unik form for kræft immunterapi. CV'er selektivt kopiere i og lyse tumorceller (skåne normale / sunde celler)1, mens fremkalde anti-tumor immunitet2. Oncolytic herpes simplex virus (oHSV) er en af de mest omfattende undersøgt virus blandt alle OVs. Det er længst henne i klinikken, med Talimogene laherparepvec (T-VEC) er den første og eneste OV til at modtage FDA godkendelse i USA til behandling af avanceret melanom3. Ud over T-VEC testes mange andre gensplejsede oHSV'er præklinisk og klinisk i forskellige kræfttyper3,4,5,6,7,8. Den nuværende avancerede rekombinant DNA-bioteknologi har yderligere øget muligheden for at udvikle nye OHSV-kodning til terapeutiske transgener3,5. Et effektivt system af oHSV-formering, rensning og titerbestemmelse er kritisk, før nogen (nyudviklet) oHSV kan testes for in vitro- og in vivo-undersøgelser. Dette papir beskriver en simpel trinvis metode til oHSV-vækst (i Vero-celler), rensning (ved saccharose-gradientmetoden) og titrering (ved en oHSV-plakanalyse i Vero-celler) (Figur 1). Det kan let vedtages i enhver Biosafety Level 2 (BSL2) laboratorieindstilling for at opnå en viral bestand af høj kvalitet til prækliniske undersøgelser.
Vero, en afrikansk grøn abe nyrecelle linje, er den mest almindeligt anvendte celle linje for oHSV formering9,10,11,12,13 som Vero celler har en defekt antiviral interferon signalering vej14. Andre cellelinjer med inaktiveret stimulator af interferongener (STING) signalering kan også bruges til oHSV vækst12,13. Denne protokol bruger Vero celler til oHSV vækst og plak assay. Efter formering høstes, lyses og renses oHSV-inficerede celler, hvori lyserede celler først behandles med benzonasekerner for at nedbryde værtscelle-DNA, forhindre nukleinsyreproteinsammenlægning og reducere viskositeten af cellelysatet. Da korrekt aktivering af benzonase ofte kræver Mg2+, anvendes 1-2 mM MgCl2 i denne protokol15. Værtscelleaffaldet fra benzonasebehandlet cellelyat elimineres yderligere ved seriefiltrering før højhastigheds-saccharose-gradient centrifugering. En tyktflydende 25% saccharoseopløsningspude hjælper med at sikre en langsommere virusmigration gennem saccharoselaget, hvilket efterlader værtscellerelaterede komponenter i supernatanten og forbedrer dermed rensningen og begrænser virustabet i pellet16. Den rensede oHSV er derefter titreret på Vero celler, og viral plaques visualiseres af Giemsa farvning17 eller X-gal farvning (for LacZ kodning oHSVs)18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.7 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polypropylene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E8263-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>179693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3007003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-262-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-21-021-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Glucose Dulbecco&#8217;s Phosphate-buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human immune globulin</td>
			<td>Gamastan</td>
			<td>NDC 13533-335-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Sterilization filter, 250 mL</td>
			<td>Nalgene, Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-25E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Sterilization filter, 500 mL</td>
			<td>Nalgene, Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-25C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Red solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N4638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>&#160;15710S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate rocker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>88861043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferricyanide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferrocyanide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 16R Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75004381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 21R Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75002446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 0.45 PVDF</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLHV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 0.8 MCE</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLAA033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, 5 &#181;m PVDF</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLSV025LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T150 culture flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>355001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>MP Biomedicals LLC</td>
			<td>816116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic water bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX-952-116R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-101-RF</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

growth, purification, and titration of oncolytic herpes simplex virus

Oncolytic virus (OVs), såsom oncolytic herpes simplex virus (oHSV), er en hastigt voksende behandlingsstrategi inden for kræft immunterapi. OVs, herunder oHSV, selektivt kopiere i og dræbe kræftceller (skåne sunde / normale celler), mens fremkalde anti-tumor immunitet. På grund af disse unikke egenskaber, oHSV-baserede behandlingsstrategier bliver i stigende grad anvendes til behandling af kræft, præklinisk og klinisk, herunder FDA-godkendte talimogene laherparevec (T-Vec). Vækst, rensning og titrering er tre væsentlige laboratorieteknikker for alle CV'er, herunder oHSV'er, før de kan anvendes til eksperimentelle undersøgelser. Dette papir beskriver en enkel trinvis metode til at forstærke oHSV i Vero-celler. Efterhånden som oHSV'er formere sig, producerer de en cytopatisk effekt (CPE) i Vero-celler. Når 90-100% af de inficerede celler viser en CPE, høstes de forsigtigt, behandles med benzonase og magnesiumchlorid (MgCl2), filtreres og underkastes rensning ved hjælp af saccharosegradientmetoden. Efter rensning bestemmes antallet af infektiøse oHSV (udpeget som plaquedannende enheder eller PPU'er) af en "plaque assay" i Vero-celler. Den heri beskrevne protokol kan anvendes til at forberede højtitler oHSV-bestand til in vitro-undersøgelser i cellekultur og in vivo-dyreforsøg.

En kort oversigt over hele protokollen er afbildet i figur 1, som repræsenterer de kritiske skridt, der er involveret i vækst, rensning og titrering af oHSV. CPE i Vero celler kan påvises så tidligt som 4 timer efter HSV infektion19. Figur 2 viser CPE i Vero-celler på tre forskellige tidspunkter efter oHSV-infektion. CPE-niveauet øges med tiden. I denne protokol observeres 90-100% CPE normalt inden for 48 timer efter lavMOI oHSV-pod...

Watch this Scientific Journal Video about Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus at JoVE.com

Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus

I dette manuskript beskriver vi en simpel metode til vækst, rensning og titrering af den oncolytiske herpes simplex virus til præklinisk brug.

Vækst, rensning og titrering af oncolytic Herpes Simplex Virus

Oncolytic viruses (OVs), such as&#160;the&#160;oncolytic herpes simplex virus (oHSV), are a rapidly growing treatment strategy in the field of cancer ...

Oncolytic herpes simplex virus er en emergent form for kræft immunterapi. Et effektivt system af virusformering, rensning og titerisk bestemmelse er afgørende for brugen i eksperimentelle undersøgelser. Denne metode er meget enkel og kan let vedtages i enhver biosikkerhed niveau to laboratorium indstilling til at modtage en høj kvalitet viral bestand for prækliniske undersøgelser.Produktion af en høj kvalitet, ren viral bestand er afgørende, da det bruges til at studere anticancer immunrespons og til at udvikle en ny form for virus baseret kræft immunterapi. Denne protokol kan bruges til at rense enhver vildtype eller genetisk manipuleret herpes simplex virus. Denne protokol skal være let at læse og let at følge for en person, der aldrig har udført denne teknik før.De anførte materialer og reagenser skal være på plads, før du prøver denne teknik for første gang. Begynd med at vaske T-150 kvadratcentimeter kolberne med to gange høj glukose DPBS suppleret med 1%IFCS. Aspirere DPBS og tilsæt syv milliliter virus inoculum per kolbe.Sten forsigtigt kolberne i fem minutter og inkuber ved 37 grader Celsius i 1,5 til 2 timer. Fjern derefter inoculumet og tilsæt 25 milliliter DMEM suppleret med 1%IFCS til hver kolbe. Efter inkubation ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i to til fire dage opsamles 20 milliliter af dyrknings-supernatanten fra hver kolbe i 50 milliliter centrifugerrør.Skrab cellerne fra bunden af kolberne ved hjælp af en celleskraber. Der tilsættes ca. 15 milliliter af det tidligere opsamlede dyrknings-supernatant til hver kolbe for at bringe volumenet op til 20 milliliter, og brug derefter en 10 milliliter steril serologisk pipette til forsigtigt at vaske bunden af kolberne et par gange. Opsamles cellerne med medium i 50 milliliter koniske centrifugerør placeret på is.Centrifuge rørene ved 300 gange G i 10 minutter ved fire grader Celsius. Resuspend hver pellet grundigt i 1,25 milliliter virus buffer, eller VB, og 1,25 milliliter af tidligere indsamlet kultur supernatant. Bland alle genbrugte pellets i en 50 milliliter konisk centrifuge rør.Snap fryse de genanvendelige celler ved hjælp af tøris og 100% ethanol og opbevares ved minus 80 grader Celsius. Tø de tidligere knækkede frosne celler i et varmt vandbad ved 37 grader Celsius og sonicate i et minut i tre cyklusser i et vandbad. Der tilsættes 175 enheder benzonasekerne og to mikroliter af to millimolar magnesiumchlorid pr. milliliter cellens lysat og vortex.Efter en inkubation på 30 minutter og varmt vandbad ved 37 grader Celsius, læg røret på is. Drej cellen lysat ved 300 gange G i 10 minutter. Opsamle supernatanten i et nyt 50 milliliter konisk centrifugerør og genbrug cellepillen i 500 mikroliter VB. Benævn det som pellet 1.Drej den opsamlede supernatant igen ved 500 gange G i 10 minutter og opbevar supernatanten separat i et friskt 50 milliliter konisk centrifugerør, der skal bruges senere. Genbrug cellepillen i 500 mikroliter VB, der betegner den som pellet to. Kombiner den genanvendelige pellet en og pellet to i en ny 1,75 milliliter centrifuge rør og vortex og sonikere to gange i et vandbad, før spinding rørene på 400 gange G i 10 minutter.Opsamle supernatanten fra 1,7 milliliter centrifugerøret og kombiner det med det supernatant, der tidligere er indsamlet 50 milliliter konisk centrifugerør. Supernatanten filtreres gennem et sterilt fem mikrometer PVDF-membranfilter i et nyt 50 milliliter centrifugerør kaldet rør et. Tilsæt en milliliter VB til 50 milliliter centrifugerøret, tømt efter filtrering af supernatanten fra det foregående trin, vortex, og send den gennem det samme PVDF membranfilter placeret på rør et.Send filtrat fra rør et gennem et sterilt 0,8 mikrometer MCE membranfilter placeret på et nyt 50 milliliter centrifugerør kaldet rør to. Tilsæt en milliliter VB til det tømte rør en, vortex, og send det gennem det samme MCE-filter placeret på rør to. Send filtrat fra rør to gennem et sterilt 0,45 mikrometer PVDF filter placeret på en ny 50 milliliter centrifuge rør mærket rør tre.Som beskrevet før skal du gentage vask af rør to med en milliliter VB for at tilføje filtrat til rør tre. I denne repræsentative analyse kunne den cytopatiske effekt observeres i Vero-celler ved 36, 48 og 72 timer efter oHSV-infektion med afrunding af de berørte celler. Det stigende niveau af CPE over tid er tydeligt som visualiseret af mCherry udtryk.På 72 timer efter infektion, viral plaques blev plettet med X-gal at visualisere oHSVs med lacZ udtryk. Forsigtigt skrubbe virus inficerede celler og forsigtigt vaske bunden på kolben er afgørende for at holde alle HSV inficerede celle intakt, således at en høj titer viral bestand kan opnås.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

Etablering af Epstein-Barr virus Vækst-transformerede lymfoblastoide cellelinjer

Infection of B cells with Epstein-Barr virus (EBV) leads to proliferation and subsequent immortalization, resulting in establishment of lymphoblastoid ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

En primær Neuron Kultur System for Studiet af Herpes Simplex Virus Latency og genaktivering

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Affinitetsrensning af Influenzavirus ribonukleoprotein komplekser fra kromatin af inficerede celler

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex vivo infektion af murint Epidermis med herpes simplex virus type 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering og analyse for at fastslå deres rolle i lymfom Cell Følsomhed til terapeutiske midler

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

Registrering og fjernelse af nukleasen forurening under oprensning af rekombinante Prototype skummende Virus Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

Forsamling og rensning af Prototype skummende Virus Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Tidsmæssig analyse af nukleare til cytoplasmatisk omplantning af en Herpes Simplex Virus 1 Protein af immunfluorescent konfokalmikroskopi

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

Identifikation af kodning og ikke-kodende RNA klasser udtrykt i svin fuldblod

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

Generation, forstærkning og titrering af rekombinant respiratorisk Syncytial virus

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...