Name: growth, purification, and titration of oncolytic herpes simplex virus
Uploaded: 2021-05-13T14:30:00
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La recherche dans le laboratoire Saha a été financée en partie par des fonds du DOD (W81XWH-20-1-0702) et de la Fondation Dodge Jones-Abilene. Samuel D. Rabkin et Melissa R.M. Humphrey ont été partiellement soutenus par les NIH (R01 CA160762).

1) Croissance de l’oHSV
NOTA : Assurer l’approbation du comité de biosécurité de l’établissement avant de travailler avec le VSSO. Cette étude a été menée dans le cadre du Protocole N° 18007 approuvé par le CIB. Maintenir les précautions BSL2 : blanchir toutes les pipettes, pointes, tubes et autres matières qui entrent en contact avec le virus. Vaporisez les gants avec 70% d’alcool isopropylique avant que les mains ne quittent la hotte de culture cellulaire BSL2. Lavez-vous t...

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	<li>Harrington, K., Freeman, D. J., Kelly, B., Harper, J., Soria, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+oncolytic+virotherapy+in+cancer+treatment.">Optimizing oncolytic virotherapy in cancer treatment.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (9), 689-706 (2019).</li><li>Zhang, S., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discovery+and+development+of+oncolytic+viruses:+are+they+the+future+of+cancer+immunotherapy.">The discovery and development of oncolytic viruses: are they the future of cancer immunotherapy.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (4), 391-410 (2021).</li><li>Bommareddy, P. K., Peters, C., Saha, D., Rabkin, S. D., Kaufman, H. 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A., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus:+propagation,+quantification,+and+storage.">Herpes simplex virus: propagation, quantification, and storage.</a> Current Protocols in Microbiology. , 1 (2005).</li><li>Malenovska, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+stabilizers+and+rates+of+freezing+on+preserving+of+structurally+different+animal+viruses+during+lyophilization+and+subsequent+storage.">The influence of stabilizers and rates of freezing on preserving of structurally different animal viruses during lyophilization and subsequent storage.</a> Journal of Applied Microbiology. 117 (6), 1810-1819 (2014).</li><li>Vahlne, A. G., Blomberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+herpes+simplex+virus.">Purification of herpes simplex virus.</a> Journal of General Virology. 22 (2), 297-302 (1974).</li><li>Sathananthan, B., Rodahl, E., Flatmark, T., Langeland, N., Haarr, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+herpes+simplex+virus+type+1+by+density+gradient+centrifugation+and+estimation+of+the+sedimentation+coefficient+of+the+virion.">Purification of herpes simplex virus type 1 by density gradient centrifugation and estimation of the sedimentation coefficient of the virion.</a> APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 105 (3), 238-246 (1997).</li><li>Mundle, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-purity+preparation+of+HSV-2+vaccine+candidate+ACAM529+is+immunogenic+and+efficacious+in+vivo.">High-purity preparation of HSV-2 vaccine candidate ACAM529 is immunogenic and efficacious in vivo.</a> PLoS One. 8 (2), 57224 (2013).</li><li>Jiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+cobalt+affinity+chromatography+provides+a+novel,+efficient+method+for+herpes+simplex+virus+type+1+gene+vector+purification.">Immobilized cobalt affinity chromatography provides a novel, efficient method for herpes simplex virus type 1 gene vector purification.</a> Journal of Virology. 78 (17), 8994-9006 (2004).</li><li>Grosche, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+propagation,+titration+and+single-step+growth+curves.">Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves.</a> Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).</li><li>Svennerholm, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+herpes+simplex+virus+virions+and+nucleocapsids+on+Percoll+gradients.">Separation of herpes simplex virus virions and nucleocapsids on Percoll gradients.</a> Journal of Virological Methods. 1 (6), 303-309 (1980).</li><li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+concentration+determination+through+plaque+assays:+using+traditional+and+novel+overlay+systems.">Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).</li><li>Miyatake, S., Iyer, A., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+targeting+of+herpes+simplex+virus+for+cell-specific+replication.">Transcriptional targeting of herpes simplex virus for cell-specific replication.</a> Journal of Virology. 71 (7), 5124-5132 (1997).</li><li>Fabiani, M., Limongi, D., Palamara, A. T., De Chiara, G., Marcocci, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+titrate+herpes+simplex+virus-1+(HSV-1)+using+laser-based+scanning+of+near-infrared+fluorophores+conjugated+antibodies.">A novel method to titrate herpes simplex virus-1 (HSV-1) using laser-based scanning of near-infrared fluorophores conjugated antibodies.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1085 (2017).</li></ol>

Le protocole commence par la croissance de l’oHSV dans les cellules Vero à faible passage. La confluence de la monocouche de cellules Vero devrait être d’environ 80% au moment de l’inoculation du virus, car les cellules envahies par la prolifération peuvent développer des structures fibreuses serrées qui peuvent réduire l’entrée de l’oHSV dans les cellules vero20. Une fois que 90-100% CPE est observé, le surnageant de culture est retiré, les cellules sont récoltées, remises en...

Les virus oncolytiques (VE) sont une forme émergente et unique d’immunothérapie du cancer. Les OV se répliquent sélectivement dans les cellules tumorales et les lysent (épargnant les cellules normales/saines)1 tout en induisant une immunité antitumorale2. Le virus oncolytique de l’herpès simplex (oHSV) est l’un des virus les plus étudiés parmi tous les OVs. Il est le plus avancé dans la clinique, talimogene laherparepvec (T-VEC) étant le premier et le seul OV à recevoir l’approbation de la FDA aux États-Unis pour le traitement du mélanome avancé3. En plus du T-VEC, de nombreux autres oHSVs génétiquement modifiés sont testés précliniquement et cliniquement dans différents types de cancer3,4,5,6,7,8. La biotechnologie avancée actuelle de l’ADN recombinant a encore augmenté la faisabilité de l’ingénierie de nouveaux oHSVs codant pour le(s) transgène(s) thérapeutique(s)3,5. Un système efficace de propagation, de purification et de détermination du titre de l’oHSV est essentiel avant qu’un oHSV (nouvellement développé) puisse être testé pour des études in vitro et in vivo. Cet article décrit une méthode simple étape par étape de croissance de l’oHSV (dans les cellules vero), de purification (par la méthode de gradient de saccharose) et de titrage (par un dosage de plaque de l’oHSV dans les cellules de Vero)(Figure 1). Il peut être facilement adopté dans n’importe quel laboratoire de niveau de biosécurité 2 (BSL2) pour obtenir un stock viral de haute qualité pour les études précliniques.
Vero, une lignée cellulaire de rein de singe vert africain, est la lignée cellulaire la plus couramment utilisée pour la propagation de l’oHSV9,10,11,12, 13carles cellules Vero ont une voie de signalisation antivirale d’interférondéfectueuse 14. D’autres lignées cellulaires avec stimulateur inactivé des gènes d’interféron (STING) signalisation peuvent également être utilisés pour la croissance de l’oHSV12,13. Ce protocole utilise des cellules Vero pour la croissance d’oHSV et l’analyse de plaque. Après la propagation, les cellules infectées par le vHSo sont récoltées, lysées et soumises à une purification, dans laquelle les cellules lysées sont d’abord traitées avec de la nucléase benzonase pour dégrader l’ADN de la cellule hôte, empêcher l’agrégation acide nucléique-protéine et réduire la viscosité du lysat cellulaire. Comme l’activation correcte de la benzonase nécessite souventmg2+,1-2 mMMgCl2 est utilisé dans ce protocole15. Les débris de cellules hôtes du lysat de cellules benzonase-traités sont en outre éliminés par filtration en série avant la centrifugation à gradient de saccharose à grande vitesse. Un coussin visqueux de solution de saccharose à 25% aide à assurer un taux de migration plus lent du virus à travers la couche de saccharose, laissant les composants liés à la cellule hôte dans le surnageant, améliorant ainsi la purification et limitant la perte de virus dans la pastille16. L’oHSV purifié est ensuite titré sur les cellules Vero, et les plaques virales sont visualisées par coloration Giemsa17 ou coloration X-gal (pour lacZ codant oHSVs)18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.7 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polypropylene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E8263-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>179693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3007003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-262-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-21-021-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Glucose Dulbecco&#8217;s Phosphate-buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human immune globulin</td>
			<td>Gamastan</td>
			<td>NDC 13533-335-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Sterilization filter, 250 mL</td>
			<td>Nalgene, Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-25E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Sterilization filter, 500 mL</td>
			<td>Nalgene, Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-25C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Red solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N4638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>&#160;15710S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate rocker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>88861043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferricyanide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferrocyanide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 16R Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75004381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 21R Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75002446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 0.45 PVDF</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLHV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 0.8 MCE</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLAA033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, 5 &#181;m PVDF</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLSV025LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T150 culture flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>355001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>MP Biomedicals LLC</td>
			<td>816116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic water bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX-952-116R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-101-RF</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

growth, purification, and titration of oncolytic herpes simplex virus

Les virus oncolytiques (OV), tels que le virus oncolytique de l’herpès simplex (oHSV), sont une stratégie de traitement en croissance rapide dans le domaine de l’immunothérapie du cancer. Les VQ, y compris le VSS O, se répliquent sélectivement dans les cellules cancéreuses et les tuent (épargnant les cellules saines/normales) tout en induisant une immunité antitumorale. En raison de ces propriétés uniques, les stratégies de traitement basées sur le vHS OHS sont de plus en plus utilisées pour le traitement du cancer, précliniquement et cliniquement, y compris le talimogene laherparevec (T-Vec) approuvé par la FDA. La croissance, la purification et le titrage sont trois techniques de laboratoire essentielles pour tout OV, y compris les VHSO, avant qu’ils ne puissent être utilisés pour des études expérimentales. Cet article décrit une méthode simple étape par étape pour amplifier l’oHSV en cellules de Vero. À mesure que les vhso se multiplient, ils produisent un effet cytopathique (CPE) dans les cellules vero. Une fois que 90-100% des cellules infectées montrent un CPE, elles sont doucement récoltées, traitées avec de la benzonase et du chlorure de magnésium (MgCl2),filtrées, et soumises à la purification utilisant la méthode de saccharose-gradient. Après purification, le nombre d’oHSV infectieux (désigné comme unités formant plaque ou PPU) est déterminé par un « test de plaque » dans les cellules Vero. Le protocole décrit ici peut être employé pour préparer le stock d’oHSV de haut-titre pour des études in vitro dans la culture cellulaire et les expériences in vivo d’animal.

Un bref aperçu de l’ensemble du protocole est représenté à la figure 1,qui représente les étapes critiques impliquées dans la croissance, la purification et le titrage de l’oHSV. Les CPE dans les cellules Vero peuvent être détectées dès 4 h après l’infection par le VHS19. La figure 2 montre l’ŒP dans les cellules Vero à trois moments différents suivant l’infection par le VHSO. Le niveau du CPE augmente au fil du t...

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Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus

Dans ce manuscrit, nous décrivons une méthode simple de croissance, de purification, et de titrage du virus oncolytique de simplex d’herpès pour l’usage préclinique.

Croissance, purification et titrage du virus oncolytique de l’herpès simplex

Oncolytic viruses (OVs), such as&#160;the&#160;oncolytic herpes simplex virus (oHSV), are a rapidly growing treatment strategy in the field of cancer ...

Le virus oncolytique de l’herpès simplex est une forme émergente d’immunothérapie du cancer. Un système efficace de propagation, de purification et de détermination titerique du virus est essentiel pour l’utilisation dans les études expérimentales. Cette méthode est très simple et peut être facilement adoptée dans n’importe quel laboratoire de niveau de biosécurité deux pour recevoir un stock viral de haute qualité pour les études précliniques.La production d’un stock viral pur et de haute qualité est cruciale car il est utilisé pour étudier la réponse immunitaire anticancéreuse et pour développer une nouvelle forme d’immunothérapie du cancer à base de virus. Ce protocole peut être utilisé pour purifier n’importe quel virus de l’herpès simplex de type sauvage ou génétiquement modifié. Ce protocole devrait être facile à lire et facile à suivre pour une personne qui n’a jamais exécuté cette technique avant.Les matériaux et réactifs énumérés doivent être en place avant d’essayer cette technique pour la première fois. Commencez par laver les flacons T-150 centimètres carrés avec du DPBS de glucose deux fois élevé complété par 1% IFCS. Aspirer le DPBS et ajouter sept millilitres d’inoculum de virus par flacon.Balancer délicatement les fioles pendant cinq minutes et incuber à 37 degrés Celsius pendant 1,5 à 2 heures. Ensuite, retirez l’inoculum et ajoutez 25 millilitres de DMEM complétés par 1% d’IFCS à chaque fiole. Après incubation à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant deux à quatre jours, recueillir 20 millilitres du surnageant de culture de chaque fiole dans des tubes à centrifuger de 50 millilitres.À l’aide d’un grattoir à cellules, grattez les cellules du fond des fioles. Ajouter environ 15 millilitres du surnageant de culture précédemment recueilli dans chaque fiole pour porter le volume à 20 millilitres, puis utiliser une pipette sérologique stérile de 10 millilitres pour laver doucement le fond des fioles plusieurs fois. Recueillir les cellules avec du milieu dans des tubes à centrifuger coniques de 50 millilitres placés sur de la glace.Centrifuger les tubes à 300 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Ressusciter soigneusement chaque pastille dans 1,25 millilitres de tampon viral, ou VB, et 1,25 millilitres de surnageant de culture précédemment recueilli. Mélanger toutes les pastilles remises en suspension dans un tube de centrifugeuse conique de 50 millilitres.Enciquez les cellules remises en suspension à l’aide de glace carbonique et d’éthanol à 100% et stockez-les à moins 80 degrés Celsius. Décongeler les cellules congelées précédemment cassées dans un bain d’eau chaude à 37 degrés Celsius et soniquer pendant une minute pendant trois cycles dans un bain-marie. Ajouter 175 unités de benzonase nucléase et deux microlitres de deux chlorures de magnésium millimolaires par millilitre du lysat cellulaire et du vortex.Après une incubation de 30 minutes et un bain d’eau tiède à 37 degrés Celsius, placez le tube sur de la glace. Faire tourner le lysat cellulaire à 300 fois G pendant 10 minutes. Recueillir le surnageant dans un nouveau tube de centrifugeuse conique de 50 millilitres et ressusciter la pastille cellulaire dans 500 microlitres de VB. Désignez-le comme granulé un.Faites tourner à nouveau le surnageant collecté à 500 fois G pendant 10 minutes et conservez le surnageant séparément dans un tube de centrifugation conique frais de 50 millilitres pour l’utiliser plus tard. Ressusciter la pastille cellulaire dans 500 microlitres de VB, en la désignant comme pastille deux. Mélanger le pastille remise en suspension un et le granulé deux dans un nouveau tube de centrifugation de 1,75 millilitre et vortex et sonique deux fois au bain-marie avant de faire tourner les tubes à 400 fois G pendant 10 minutes.Recueillir le surnageant à partir d’un tube de centrifugation de 1,7 millilitre et le combiner avec le tube de centrifugation conique de 50 millilitres précédemment collecté. Filtrez le surnageant à travers un filtre à membrane PVDF stérile de cinq micromètres dans un nouveau tube à centrifuger de 50 millilitres appelé tube un. Ajoutez un millilitre de VB au tube de centrifugation de 50 millilitres, vidé après avoir filtré le surnageant de l’étape précédente, le vortex, et passez-le à travers le même filtre à membrane PVDF placé sur le tube un.Passez le filtrat du tube un à travers un filtre à membrane MCE stérile de 0,8 micromètre placé sur un nouveau tube à centrifuger de 50 millilitres appelé tube deux. Ajoutez un millilitre de VB au tube vidé un, vortex, et passez-le à travers le même filtre MCE placé sur le tube deux. Passez le filtrat du tube deux à travers un filtre PVDF stérile de 0,45 micromètre placé sur un nouveau tube centrifuge de 50 millilitres étiqueté tube trois.Comme décrit précédemment, répétez le lavage du tube deux avec un millilitre de VB pour ajouter du filtrat au tube trois. Dans cette analyse représentative, l’effet cytopathic a pu être observé dans les cellules de Vero à 36, 48, et 72 heures d’infection d’oHSV avec l’arrondi des cellules affectées. Le niveau croissant de CPE au fil du temps est évident tel que visualisé par l’expression de mCherry.À 72 heures d’infection de poteau, des plaques virales ont été souillées avec X-gal pour visualiser l’oHSVs avec l’expression de lacZ. Il est essentiel de nettoyer doucement les cellules infectées par le virus et de laver doucement le fond du ballon pour garder intactes toutes les cellules infectées par le VHS afin d’obtenir un stock viral à titre élevé.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

Création d&#39;Epstein-Barr Virus croissance transformées lignées lymphoblastoïdes

Infection of B cells with Epstein-Barr virus (EBV) leads to proliferation and subsequent immortalization, resulting in establishment of lymphoblastoid ...

Recherche

Immunologie et infection

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Un système de neurones primaires de la culture pour l&#39;étude de l&#39;herpès simplex virus de latence et de réactivation

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

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Purification par affinité des complexes virus de la grippe ribonucléoprotéiques de la chromatine des cellules infectées

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Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

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Ex Vivo infection de murin épiderme avec le virus Herpes simplex de type 1

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