Name: growth, purification, and titration of oncolytic herpes simplex virus
Uploaded: 2021-05-13T14:30:00
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Die Forschung im Saha-Labor wurde teilweise durch Mittel des DOD (W81XWH-20-1-0702) und der Dodge Jones Foundation-Abilene unterstützt. Samuel D. Rabkin und Melissa R.M. Humphrey wurden teilweise von NIH unterstützt (R01 CA160762).

1) oHSV-Wachstum
HINWEIS: Stellen Sie die Genehmigung des institutionellen Biosicherheitsausschusses sicher, bevor Sie mit oHSV zusammenarbeiten. Diese Studie wurde unter dem genehmigten IBC-Protokoll Nr. 18007 durchgeführt. Halten Sie die BSL2-Vorsichtsmaßnahmen ein: Bleichen Sie alle Pipetts, Spitzen, Röhrchen und andere Materialien, die mit dem Virus in Kontakt kommen. Sprühen Sie Handschuhe mit 70% Isopropylalkohol, bevor die Hände die BSL2-Zellkulturhaube verlassen. Waschen Sie die Hä...

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	<li>Harrington, K., Freeman, D. J., Kelly, B., Harper, J., Soria, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+oncolytic+virotherapy+in+cancer+treatment.">Optimizing oncolytic virotherapy in cancer treatment.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (9), 689-706 (2019).</li><li>Zhang, S., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discovery+and+development+of+oncolytic+viruses:+are+they+the+future+of+cancer+immunotherapy.">The discovery and development of oncolytic viruses: are they the future of cancer immunotherapy.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (4), 391-410 (2021).</li><li>Bommareddy, P. K., Peters, C., Saha, D., Rabkin, S. D., Kaufman, H. 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A., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus:+propagation,+quantification,+and+storage.">Herpes simplex virus: propagation, quantification, and storage.</a> Current Protocols in Microbiology. , 1 (2005).</li><li>Malenovska, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+stabilizers+and+rates+of+freezing+on+preserving+of+structurally+different+animal+viruses+during+lyophilization+and+subsequent+storage.">The influence of stabilizers and rates of freezing on preserving of structurally different animal viruses during lyophilization and subsequent storage.</a> Journal of Applied Microbiology. 117 (6), 1810-1819 (2014).</li><li>Vahlne, A. G., Blomberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+herpes+simplex+virus.">Purification of herpes simplex virus.</a> Journal of General Virology. 22 (2), 297-302 (1974).</li><li>Sathananthan, B., Rodahl, E., Flatmark, T., Langeland, N., Haarr, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+herpes+simplex+virus+type+1+by+density+gradient+centrifugation+and+estimation+of+the+sedimentation+coefficient+of+the+virion.">Purification of herpes simplex virus type 1 by density gradient centrifugation and estimation of the sedimentation coefficient of the virion.</a> APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 105 (3), 238-246 (1997).</li><li>Mundle, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-purity+preparation+of+HSV-2+vaccine+candidate+ACAM529+is+immunogenic+and+efficacious+in+vivo.">High-purity preparation of HSV-2 vaccine candidate ACAM529 is immunogenic and efficacious in vivo.</a> PLoS One. 8 (2), 57224 (2013).</li><li>Jiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+cobalt+affinity+chromatography+provides+a+novel,+efficient+method+for+herpes+simplex+virus+type+1+gene+vector+purification.">Immobilized cobalt affinity chromatography provides a novel, efficient method for herpes simplex virus type 1 gene vector purification.</a> Journal of Virology. 78 (17), 8994-9006 (2004).</li><li>Grosche, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+propagation,+titration+and+single-step+growth+curves.">Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves.</a> Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).</li><li>Svennerholm, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+herpes+simplex+virus+virions+and+nucleocapsids+on+Percoll+gradients.">Separation of herpes simplex virus virions and nucleocapsids on Percoll gradients.</a> Journal of Virological Methods. 1 (6), 303-309 (1980).</li><li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+concentration+determination+through+plaque+assays:+using+traditional+and+novel+overlay+systems.">Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).</li><li>Miyatake, S., Iyer, A., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+targeting+of+herpes+simplex+virus+for+cell-specific+replication.">Transcriptional targeting of herpes simplex virus for cell-specific replication.</a> Journal of Virology. 71 (7), 5124-5132 (1997).</li><li>Fabiani, M., Limongi, D., Palamara, A. T., De Chiara, G., Marcocci, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+titrate+herpes+simplex+virus-1+(HSV-1)+using+laser-based+scanning+of+near-infrared+fluorophores+conjugated+antibodies.">A novel method to titrate herpes simplex virus-1 (HSV-1) using laser-based scanning of near-infrared fluorophores conjugated antibodies.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1085 (2017).</li></ol>

Das Protokoll beginnt mit dem Wachstum von oHSV in Vero-Zellen mit niedriger Passage. Die Konfluenz der Vero-Zellmonoschicht sollte zum Zeitpunkt der Virusimpfung ~ 80% betragen, da überwachsene Zellen enge faserige Strukturen entwickeln können, die den Eintritt von oHSV in Vero-Zellen reduzieren können20. Sobald 90-100% CPE beobachtet wurde, wird der Kulturüberstand entfernt, Zellen geerntet, in VB/Überstand resuspendiert (siehe Schritt 1.4.6), einrastig eingefroren und bei -80 °C zur spät...

Onkolytische Viren (OVs) sind eine aufkommende und einzigartige Form der Krebsimmuntherapie. OVs replizieren sich selektiv in tumoren Zellen und lysieren sie (schonen normale/gesunde Zellen)1 und induzieren gleichzeitig eine Antitumorimmunität2. Das onkolytische Herpes-simplex-Virus (oHSV) ist eines der am umfangreichsten untersuchten Viren unter allen OVs. Talimogene Laherparepvec (T-VEC) ist die erste und einzige OV, die in den USA die FDA-Zulassung für die Behandlung des fortgeschrittenen Melanoms3erhalten hat. Neben T-VEC werden viele weitere gentechnisch veränderte oHSVs präklinisch und klinisch bei verschiedenen Krebsarten3,4,5,6,7, 8getestet. Die derzeitige fortgeschrittene rekombinante DNA-Biotechnologie hat die Machbarkeit der Entwicklung neuer oHSVs, die für therapeutische Transgene kodieren, weiter erhöht3,5. Ein effizientes System der oHSV-Vermehrung, -Aufreinigung und -bestimmung ist entscheidend, bevor ein (neu entwickeltes) oHSV für In-vitro- und In-vivo-Studien getestet werden kann. Dieser Artikel beschreibt eine einfache Schritt-für-Schritt-Methode des oHSV-Wachstums (in Vero-Zellen), der Reinigung (durch die Saccharose-Gradienten-Methode) und der Titration (durch einen oHSV-Plaque-Assay in Vero-Zellen) (Abbildung 1). Es kann leicht in jedem Labor der Biosicherheitsstufe 2 (BSL2) eingesetzt werden, um einen qualitativ hochwertigen Virusbestand für präklinische Studien zu erhalten.
Vero, eine afrikanische grüne Affennierenzelllinie, ist die am häufigsten verwendete Zelllinie für die oHSV-Vermehrung9,10,11,12,13, da Vero-Zellen einen defekten antiviralen Interferon-Signalweg haben14. Andere Zelllinien mit inaktiviertem Stimulator der Interferon-Gene (STING) signalisierung können auch für das oHSV-Wachstum verwendet werden12,13. Dieses Protokoll verwendet Vero-Zellen für oHSV-Wachstum und Plaque-Assay. Nach der Vermehrung werden oHSV-infizierte Zellen geerntet, lysiert und einer Reinigung unterzogen, wobei lysierte Zellen zuerst mit Benzonase-Nuklease behandelt werden, um die DNA der Wirtszelle abzubauen, die Nukleinsäure-Protein-Aggregation zu verhindern und die Viskosität des Zelllysats zu reduzieren. Da die ordnungsgemäße Aktivierung der Benzonase oft Mg2+erfordert, werden in diesem Protokoll15 1-2mM MgCl2 verwendet. Die Wirtszellreste aus dem mit Benzonase behandelten Zelllysat werden durch serielle Filtration vor der Hochgeschwindigkeits-Saccharose-Gradientenzentrifugation weiter eliminiert. Ein viskoses 25%iges Saccharoselösungskissen trägt dazu bei, eine langsamere Virusmigration durch die Saccharoseschicht zu gewährleisten, wobei wirtszellbezogene Komponenten im Überstand belassen werden, wodurch die Reinigung verbessert und der Virusverlust im Pelletbegrenzt wird 16. Das gereinigte oHSV wird dann auf Vero-Zellen titriert, und virale Plaques werden durch Giemsa-Färbung17 oder X-Gal-Färbung (für LacZ-kodierende oHSVs)18visualisiert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.7 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polypropylene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E8263-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>179693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3007003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-262-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-21-021-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Glucose Dulbecco&#8217;s Phosphate-buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human immune globulin</td>
			<td>Gamastan</td>
			<td>NDC 13533-335-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Sterilization filter, 250 mL</td>
			<td>Nalgene, Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-25E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Sterilization filter, 500 mL</td>
			<td>Nalgene, Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-25C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Red solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N4638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>&#160;15710S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate rocker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>88861043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferricyanide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferrocyanide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 16R Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75004381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 21R Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75002446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 0.45 PVDF</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLHV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 0.8 MCE</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLAA033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, 5 &#181;m PVDF</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLSV025LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T150 culture flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>355001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>MP Biomedicals LLC</td>
			<td>816116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic water bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX-952-116R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-101-RF</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

growth, purification, and titration of oncolytic herpes simplex virus

Onkolytische Viren (OVs), wie das onkolytische Herpes-simplex-Virus (oHSV), sind eine schnell wachsende Behandlungsstrategie im Bereich der Krebsimmuntherapie. OVs, einschließlich oHSV, replizieren sich selektiv in Krebszellen und töten sie ab (schonen gesunde / normale Zellen), während sie eine Anti-Tumor-Immunität induzieren. Aufgrund dieser einzigartigen Eigenschaften werden oHSV-basierte Behandlungsstrategien zunehmend präklinisch und klinisch zur Behandlung von Krebs eingesetzt, einschließlich des von der FDA zugelassenen Talimogens Laherparevec (T-Vec). Wachstum, Reinigung und Titration sind drei wesentliche Labortechniken für alle OVs, einschließlich oHSVs, bevor sie für experimentelle Studien verwendet werden können. Dieses Papier beschreibt eine einfache Schritt-für-Schritt-Methode zur Verstärkung von oHSV in Vero-Zellen. Wenn sich oHSVs vermehren, erzeugen sie einen zytopathischen Effekt (CPE) in Vero-Zellen. Sobald 90-100% der infizierten Zellen eine CPE aufweisen, werden sie schonend geerntet, mit Benzonase und Magnesiumchlorid(MgCl2)behandelt, filtriert und mit der Saccharose-Gradienten-Methode gereinigt. Nach der Reinigung wird die Anzahl der infektiösen oHSV (als Plaque-bildende Einheiten oder PFUs bezeichnet) durch einen "Plaque-Assay" in Vero-Zellen bestimmt. Das hier beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um hochtitere oHSV-Bestände für In-vitro-Studien in Zellkultur und in vivo Tierversuchen vorzubereiten.

Ein kurzer Überblick über das gesamte Protokoll ist in Abbildung 1dargestellt, die die kritischen Schritte beim Wachstum, der Reinigung und der Titration von oHSV darstellt. CPE in Vero-Zellen kann bereits 4 Stunden nach HSV-Infektion nachgewiesen werden19. Abbildung 2 zeigt CPE in Vero-Zellen zu drei verschiedenen Zeitpunkten nach einer oHSV-Infektion. Das Niveau des CPE wird im Laufe der Zeit erhöht. In diesem Protokoll wird 90-100% ...

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Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus

In diesem Manuskript beschreiben wir eine einfache Methode des Wachstums, der Reinigung und der Titration des onkolytischen Herpes-simplex-Virus für die präklinische Anwendung.

Wachstum, Reinigung und Titration des onkolytischen Herpes-Simplex-Virus

Oncolytic viruses (OVs), such as&#160;the&#160;oncolytic herpes simplex virus (oHSV), are a rapidly growing treatment strategy in the field of cancer ...

Das onkolytische Herpes-simplex-Virus ist eine emergente Form der Krebsimmuntherapie. Ein effizientes System der Virusvermehrung, -reinigung und -bestimmung ist entscheidend für den Einsatz in experimentellen Studien. Diese Methode ist sehr einfach und kann leicht in jedem Labor der Biosicherheitsstufe zwei eingesetzt werden, um einen qualitativ hochwertigen Virusbestand für präklinische Studien zu erhalten.Die Produktion eines hochwertigen, reinen Virusbestands ist von entscheidender Bedeutung, da er zur Untersuchung der Immunantwort gegen Krebs und zur Entwicklung einer neuartigen Form der virusbasierten Krebsimmuntherapie verwendet wird. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um jedes Wildtyp- oder gentechnisch veränderte Herpes-simplex-Virus zu reinigen. Dieses Protokoll sollte für eine Person, die diese Technik noch nie zuvor durchgeführt hat, leicht zu lesen und leicht zu befolgen sein.Die aufgeführten Materialien und Reagenzien sollten vorhanden sein, bevor Sie diese Technik zum ersten Mal ausprobieren. Beginnen Sie mit dem Waschen der T-150 Quadratzentimeterkolben mit zweifach hohen Glukose-DPBS, ergänzt mit 1% IFCS. Saugen Sie das DPBS an und fügen Sie sieben Milliliter Virusinokum pro Kolben hinzu.Die Kolben fünf Minuten lang vorsichtig schaukeln und bei 37 Grad Celsius 1,5 bis 2 Stunden inkubieren. Entfernen Sie dann das Inokum und fügen Sie jedem Kolben 25 Milliliter DMEM hinzu, ergänzt mit 1% IFCS. Nach der Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für zwei bis vier Tage 20 Milliliter des Kulturüberstandes aus jedem Kolben in 50 Milliliter Zentrifugenröhrchen sammeln.Kratzen Sie die Zellen mit einem Zellschaber vom Boden der Kolben ab. Geben Sie etwa 15 Milliliter des zuvor gesammelten Kulturüberstands in jeden Kolben, um das Volumen auf 20 Milliliter zu erhöhen, und verwenden Sie dann eine sterile serologische Pipette von 10 Millilitern, um den Boden der Kolben einige Male vorsichtig zu waschen. Sammeln Sie die Zellen mit Medium in 50 Milliliter konische Zentrifugenröhrchen, die auf Eis gelegt werden.Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 300 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Resuspendieren Sie jedes Pellet gründlich in 1,25 Milliliter Viruspuffer oder VB und 1,25 Milliliter zuvor gesammelter Kulturüberstand. Mischen Sie alle resuspendierten Pellets in einem 50 Milliliter konischen Zentrifugenröhrchen.Schnappen Sie die resuspendierten Zellen mit Trockeneis und 100% Ethanol ein und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. Die zuvor geschnappten gefrorenen Zellen in einem warmen Wasserbad bei 37 Grad Celsius auftauen und eine Minute lang für drei Zyklen in einem Wasserbad beschallen. Fügen Sie 175 Einheiten Benzonase-Nuklease und zwei Mikroliter von zwei millimolarem Magnesiumchlorid pro Milliliter Zelllysat und Wirbel hinzu.Nach einer Inkubation von 30 Minuten und einem warmen Wasserbad bei 37 Grad Celsius den Schlauch auf Eis legen. Drehen Sie das Zelllysat bei 300 mal G für 10 Minuten. Sammeln Sie den Überstand in einem neuen 50 Milliliter konischen Zentrifugenröhrchen und resuspendieren Sie das Zellpellet in 500 Mikrolitern VB. Bezeichnen Sie es als Pellet eins.Drehen Sie den gesammelten Überstand erneut bei 500 mal G für 10 Minuten und lagern Sie den Überstand separat in einem frischen 50 Milliliter konischen Zentrifugenröhrchen, um es später zu verwenden. Resuspend das Zellpellet in 500 Mikroliter VB und bezeichnen Sie es als Pellet zwei. Kombinieren Sie das resuspendierte Pellet eins und Pellet zwei in einem neuen 1,75 Milliliter Zentrifugenrohr und Wirbel und beschallen Sie zweimal in einem Wasserbad, bevor Sie die Röhrchen bei 400 mal G für 10 Minuten drehen.Sammeln Sie den Überstand aus dem 1,7-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und kombinieren Sie ihn mit dem zuvor gesammelten 50-Milliliter-Kegelzentrifugenröhrchen. Filtern Sie den Überstand durch einen sterilen fünf Mikrometer großen PVDF-Membranfilter in ein neues 50-Milliliter-Zentrifugenrohr namens Tube One. Fügen Sie einen Milliliter VB in das 50-Milliliter-Zentrifugenrohr hinzu, das nach dem Filtern des Überstands aus dem vorherigen Schritt, Dem Wirbel, entleert wurde, und führen Sie es durch den gleichen PVDF-Membranfilter, der auf Rohr eins platziert ist.Leiten Sie das Filtrat von Rohr eins durch einen sterilen 0,8 Mikrometer MCE-Membranfilter, der auf einem neuen 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen namens Rohr zwei platziert ist. Fügen Sie einen Milliliter VB in das entleerte Rohr eins, Wirbel, hinzu und führen Sie es durch den gleichen MCE-Filter, der auf Rohr zwei platziert ist. Leiten Sie das Filtrat von Rohr zwei durch einen sterilen 0,45-Mikrometer-PVDF-Filter, der auf einem neuen 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit der Bezeichnung Rohr drei platziert ist.Wie bereits beschrieben, wiederholen Sie das Waschen von Rohr zwei mit einem Milliliter VB, um Filtrat zu Rohr drei hinzuzufügen. In dieser repräsentativen Analyse konnte der zytopathische Effekt in Vero-Zellen 36, 48 und 72 Stunden nach der oHSV-Infektion mit der Rundung der betroffenen Zellen beobachtet werden. Das im Laufe der Zeit zunehmende CPE-Niveau ist offensichtlich, wie durch den mCherry-Ausdruck visualisiert.72 Stunden nach der Infektion wurden virale Plaques mit X-gal gefärbt, um oHSVs mit lacZ-Expression zu visualisieren. Das sanfte Abwaschen von virusinfizierten Zellen und das sanfte Waschen des Bodens auf dem Kolben ist entscheidend, um alle HSV-infizierten Zellen intakt zu halten, damit ein virusreicher Bestand mit hohem Titergehalt erhalten werden kann.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

Gründung des Epstein-Barr Virus Growth-transformierten lymphoblastoiden Zelllinien

Infection of B cells with Epstein-Barr virus (EBV) leads to proliferation and subsequent immortalization, resulting in establishment of lymphoblastoid ...

Forschung

Immunologie und Infektion

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Eine primäre Neuron Culture System zur Erforschung des Herpes Simplex Virus Latenz und Reaktivierung

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Affinitätsreinigung des Influenza-Virus Ribonukleoproteinkomplexe aus dem Chromatin der infizierten Zellen

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex vivo Infektion von murinen Epidermis mit Herpes Simplex Virus Typ 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophilen-Isolierung und Analyse zur Bestimmung ihrer Rolle in der Lymphom-Zellempfindlichkeit therapeutische Mittel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

Erkennung und Entfernung von Nuklease Kontamination während der Reinigung von rekombinanten Prototyp schaumig Virus Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

Montage und Reinigung der Prototyp schaumig Virus Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Zeitliche Analyse der nuklearen-cytoplasmatische Translokation eines Herpes-Simplex-Virus 1-Proteins Immunofluorescent konfokalen Mikroskopie

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

Identifizierung der Codierung und nicht-kodierende RNA-Klassen ausgedrückt bei Schweinen Vollblut

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

Erzeugung, Verstärkung und Titration von rekombinanten Respiratory Syncytial Viren

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...