Name: growth, purification, and titration of oncolytic herpes simplex virus
Uploaded: 2021-05-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus at JoVE.com

המחקר במעבדת סאהא נתמך בחלקו על ידי קרנות ממשרד המשפטים (W81XWH-20-1-0702) וקרן דודג' ג'ונס-אבילין. סמואל ד. רבקין ומליסה ר.M האמפרי נתמכו חלקית על ידי NIH (R01 CA160762).

1) צמיחת oHSV
הערה: יש להבטיח את אישור הוועדה המוסדית לתמיכה ביולוגית לפני העבודה עם oHSV. מחקר זה נערך במסגרת פרוטוקול IBC מס' 18007 שאושר. שמור על אמצעי זהירות BSL2: להלבין את כל pipets, טיפים, צינורות, וחומרים אחרים שבאים במגע עם הנגיף. ריסוס כפפות עם 70% אלכוהול איזופרופיל לפני הידיים לעזוב...

<ol>
	<li>Harrington, K., Freeman, D. J., Kelly, B., Harper, J., Soria, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+oncolytic+virotherapy+in+cancer+treatment.">Optimizing oncolytic virotherapy in cancer treatment.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (9), 689-706 (2019).</li><li>Zhang, S., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discovery+and+development+of+oncolytic+viruses:+are+they+the+future+of+cancer+immunotherapy.">The discovery and development of oncolytic viruses: are they the future of cancer immunotherapy.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (4), 391-410 (2021).</li><li>Bommareddy, P. K., Peters, C., Saha, D., Rabkin, S. D., Kaufman, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+herpes+simplex+viruses+as+a+paradigm+for+the+treatment+of+cancer.">Oncolytic herpes simplex viruses as a paradigm for the treatment of cancer.</a> Annual Review of Cancer Biology. 2 (1), 155-173 (2018).</li><li>Peters, C., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+herpes+viruses+as+oncolytics.">Designing herpes viruses as oncolytics.</a> Molecular Therapy-Oncolytics. 2, 15010 (2015).</li><li>Nguyen, H. -. M., Saha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+current+state+of+oncolytic+herpes+simplex+virus+for+glioblastoma+treatment.">The current state of oncolytic herpes simplex virus for glioblastoma treatment.</a> Oncolytic Virotherapy. 10, 1-27 (2021).</li><li>Koch, M. S., Lawler, S. E., Chiocca, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSV-1+oncolytic+viruses+from+bench+to+bedside:+an+overview+of+current+clinical+trials.">HSV-1 oncolytic viruses from bench to bedside: an overview of current clinical trials.</a> Cancers. 12 (12), 3514 (2020).</li><li>Menotti, L., Avitabile, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+oncolytic+immunovirotherapy:+the+blossoming+branch+of+multimodal+therapy.">Herpes simplex virus oncolytic immunovirotherapy: the blossoming branch of multimodal therapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8310 (2020).</li><li>Nguyen, H. M., Guz-Montgomery, K., Saha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+virus+encoding+a+master+pro-inflammatory+cytokine+interleukin+12+in+cancer+immunotherapy.">Oncolytic virus encoding a master pro-inflammatory cytokine interleukin 12 in cancer immunotherapy.</a> Cells. 9 (2), 400 (2020).</li><li>Agarwalla, P. K., Aghi, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+herpes+simplex+virus+engineering+and+preparation.">Oncolytic herpes simplex virus engineering and preparation.</a> Methods in Molecular Biology. 797, 1-19 (2012).</li><li>Grosche, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+propagation,+titration+and+single-step+growth+curves.">Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves.</a> Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).</li><li>Sutter, S. O., Marconi, P., Meier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+growth,+preparation,+and+assay.">Herpes simplex virus growth, preparation, and assay.</a> Methods in Molecular Biology. 2060, 57-72 (2020).</li><li>Froechlich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrity+of+the+antiviral+STING-mediated+DNA+sensing+in+tumor+cells+is+required+to+sustain+the+immunotherapeutic+efficacy+of+herpes+simplex+oncolytic+virus.">Integrity of the antiviral STING-mediated DNA sensing in tumor cells is required to sustain the immunotherapeutic efficacy of herpes simplex oncolytic virus.</a> Cancers. 12 (11), 3407 (2020).</li><li>Froechlich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+novel+mesothelin-targeted+oncolytic+herpes+virus+and+implemented+strategies+for+manufacturing.">Generation of a novel mesothelin-targeted oncolytic herpes virus and implemented strategies for manufacturing.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 477 (2021).</li><li>Mosca, J. D., Pitha, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+and+posttranscriptional+regulation+of+exogenous+human+beta+interferon+gene+in+simian+cells+defective+in+interferon+synthesis.">Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis.</a> Molecular and Cellular Biology. 6 (6), 2279-2283 (1986).</li><li>Gousseinoz, E., Kools, W., Pattnaik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+impurity+reduction+in+viral+vaccine+manufacturing.">Nucleic acid impurity reduction in viral vaccine manufacturing.</a> BioProcess International. 12 (2), 59-68 (2014).</li><li>Diefenbach, R. J., Fraefel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus:+methods+and+protocols.">Herpes simplex virus: methods and protocols.</a> Methods in Molecular Biology. , (2014).</li><li>Hadi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+trial+to+prepared+&#947;1+34.5+herpes+simplex+virus+1+immunogene+by+cloning+technique.">An experimental trial to prepared &#947;1 34.5 herpes simplex virus 1 immunogene by cloning technique.</a> Systematic Review Pharmacy. 11 (5), 140-149 (2020).</li><li>Kuroda, T., Martuza, R. L., Todo, T., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flip-Flop+HSV-BAC:+bacterial+artificial+chromosome+based+system+for+rapid+generation+of+recombinant+herpes+simplex+virus+vectors+using+two+independent+site-specific+recombinases.">Flip-Flop HSV-BAC: bacterial artificial chromosome based system for rapid generation of recombinant herpes simplex virus vectors using two independent site-specific recombinases.</a> BMC Biotechnology. 6, 40 (2006).</li><li>Motamedifar, M., Noorafshan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytopathic+effect+of+the+herpes+simplex+virus+type+1+appears+stereologically+as+early+as+4+h+after+infection+of+Vero+cells.">Cytopathic effect of the herpes simplex virus type 1 appears stereologically as early as 4 h after infection of Vero cells.</a> Micron. 39 (8), 1331-1334 (2008).</li><li>Blaho, J. A., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus:+propagation,+quantification,+and+storage.">Herpes simplex virus: propagation, quantification, and storage.</a> Current Protocols in Microbiology. , 1 (2005).</li><li>Malenovska, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+stabilizers+and+rates+of+freezing+on+preserving+of+structurally+different+animal+viruses+during+lyophilization+and+subsequent+storage.">The influence of stabilizers and rates of freezing on preserving of structurally different animal viruses during lyophilization and subsequent storage.</a> Journal of Applied Microbiology. 117 (6), 1810-1819 (2014).</li><li>Vahlne, A. G., Blomberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+herpes+simplex+virus.">Purification of herpes simplex virus.</a> Journal of General Virology. 22 (2), 297-302 (1974).</li><li>Sathananthan, B., Rodahl, E., Flatmark, T., Langeland, N., Haarr, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+herpes+simplex+virus+type+1+by+density+gradient+centrifugation+and+estimation+of+the+sedimentation+coefficient+of+the+virion.">Purification of herpes simplex virus type 1 by density gradient centrifugation and estimation of the sedimentation coefficient of the virion.</a> APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 105 (3), 238-246 (1997).</li><li>Mundle, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-purity+preparation+of+HSV-2+vaccine+candidate+ACAM529+is+immunogenic+and+efficacious+in+vivo.">High-purity preparation of HSV-2 vaccine candidate ACAM529 is immunogenic and efficacious in vivo.</a> PLoS One. 8 (2), 57224 (2013).</li><li>Jiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+cobalt+affinity+chromatography+provides+a+novel,+efficient+method+for+herpes+simplex+virus+type+1+gene+vector+purification.">Immobilized cobalt affinity chromatography provides a novel, efficient method for herpes simplex virus type 1 gene vector purification.</a> Journal of Virology. 78 (17), 8994-9006 (2004).</li><li>Grosche, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+propagation,+titration+and+single-step+growth+curves.">Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves.</a> Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).</li><li>Svennerholm, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+herpes+simplex+virus+virions+and+nucleocapsids+on+Percoll+gradients.">Separation of herpes simplex virus virions and nucleocapsids on Percoll gradients.</a> Journal of Virological Methods. 1 (6), 303-309 (1980).</li><li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+concentration+determination+through+plaque+assays:+using+traditional+and+novel+overlay+systems.">Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).</li><li>Miyatake, S., Iyer, A., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+targeting+of+herpes+simplex+virus+for+cell-specific+replication.">Transcriptional targeting of herpes simplex virus for cell-specific replication.</a> Journal of Virology. 71 (7), 5124-5132 (1997).</li><li>Fabiani, M., Limongi, D., Palamara, A. T., De Chiara, G., Marcocci, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+titrate+herpes+simplex+virus-1+(HSV-1)+using+laser-based+scanning+of+near-infrared+fluorophores+conjugated+antibodies.">A novel method to titrate herpes simplex virus-1 (HSV-1) using laser-based scanning of near-infrared fluorophores conjugated antibodies.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1085 (2017).</li></ol>

הפרוטוקול מתחיל עם הצמיחה של oHSV בתאי Vero מעבר נמוך. המפגש של monolayer תא Vero צריך להיות ~ 80% בזמן חיסון וירוס כמו תאים מגודלים יכולים לפתח מבנים סיביים הדוקים שיכולים להפחית את כניסת oHSV לתאי Vero20. לאחר 90-100% CPE נצפתה, supernatant התרבות מוסרת, תאים נקצרים, respended ב VB / supernatant (ראה שלב 1.4.6), הצמד קפו?...

וירוסים אונקוליטיים (OVs) הם צורה מתפתחת וייחודית של אימונותרפיה של סרטן. OVs לשכפל באופן סלקטיבי תאים סרטניים lyse (חוסך תאים נורמליים / בריאים)1 תוך גרימת חסינות אנטי גידול2. וירוס הרפס סימפלקס אונקוליטי (oHSV) הוא אחד הווירוסים שנחקרו בהרחבה ביותר בקרב כל OVs. זה הרחוק ביותר יחד במרפאה, עם Talimogene laherparepvec (T-VEC) להיות OV הראשון והיחיד לקבל אישור ה-FDA בארה"ב לטיפול במלנומה מתקדמת3. בנוסף ל- T-VEC, oHSVs מהונדסיםגנטיתרבים אחרים נבדקים באופן פרה-קליני וקליני בסוגי סרטן שונים 3,4,5,6,7,8. הביוטכנולוגיה הנוכחית המתקדמת של דנ"א רקומביננטי הגדילה עוד יותר את ההיתכנות של קידוד oHSVs חדש עבור transgene(s)טיפולית 3,5. מערכת יעילה של התפשטות oHSV, טיהור, וקביעת טיטר הוא קריטי לפני כל (שפותח לאחרונה) oHSV ניתן לבדוק במבחנה ובמחקרים vivo. מאמר זה מתאר שיטה פשוטה צעד אחר צעד של צמיחת oHSV (בתאי Vero), טיהור (בשיטת ההדרגתית של סוכרוז) ו titration (על ידי בדיקת לוח oHSV בתאי Vero) (איור 1). זה יכול להיות מאומץ בקלות בכל Biosafety רמה 2 (BSL2) הגדרת מעבדה כדי להשיג מלאי ויראלי באיכות גבוהה למחקרים פרה-קוליניים.
ורו, קו תאי כליה של קוף ירוק אפריקאי, הוא קו התאים הנפוץ ביותר להפצת oHSV9,10,11,12,13 כמו תאי Vero יש מסלול איתות אנטי ויראלי פגום14. קווי תאים אחרים עם גירוי מומת של גנים אינטרפרון (STING) איתות יכול לשמש גם לצמיחה oHSV12,13. פרוטוקול זה מנצל תאי Vero לצמיחה oHSV ו פלאק assay. לאחר התפשטות, תאים נגועים oHSV נקצרים, lysed, ונתון לטיהור, שבו תאים lysed מטופלים תחילה עם גרעין בנזונזה כדי להשפיל את ה-DNA של התא המארח, למנוע הצטברות חומצה גרעינית חלבון, ולהפחית את הצמיגות של ליסט התא. כמו הפעלה נכונה של בנזונאס לעתים קרובות דורש Mg2+, 1-2 mM MgCl2 משמש בפרוטוקול זה15. פסולת התא המארח מן lysate התא שטופלו בנזונז הוא בוטל עוד יותר על ידי סינון סדרתי לפני צנטריפוגה במהירות גבוהה סוכרוז שיפוע. כרית פתרון סוכרוז צמיג 25% מסייעת להבטיח קצב איטי יותר של נדידת וירוסים דרך שכבת סוכרוז, משאיר רכיבים הקשורים לתא המארח ב supernatant, ובכך לשפר את הטיהור והגבלת אובדן וירוסים גלולה16. oHSV מטוהרים לאחר מכן titrated על תאים Vero, לוחות ויראליים הם דמיינו על ידי Giemsa מכתים17 או X-gal כתמים (עבור LacZ קידוד oHSVs)18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.7 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polypropylene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E8263-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>179693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3007003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-262-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-21-021-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Glucose Dulbecco&#8217;s Phosphate-buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human immune globulin</td>
			<td>Gamastan</td>
			<td>NDC 13533-335-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Sterilization filter, 250 mL</td>
			<td>Nalgene, Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-25E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Sterilization filter, 500 mL</td>
			<td>Nalgene, Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-25C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Red solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N4638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>&#160;15710S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate rocker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>88861043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferricyanide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferrocyanide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 16R Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75004381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 21R Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75002446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 0.45 PVDF</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLHV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 0.8 MCE</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLAA033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, 5 &#181;m PVDF</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLSV025LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T150 culture flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>355001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>MP Biomedicals LLC</td>
			<td>816116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic water bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX-952-116R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-101-RF</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

growth, purification, and titration of oncolytic herpes simplex virus

וירוסים אונקוליטיים (OVs), כגון וירוס הרפס סימפלקס אונקוליטי (oHSV), הם אסטרטגיית טיפול הגדלה במהירות בתחום האימונותרפיה של סרטן. OVs, כולל oHSV, לשכפל באופן סלקטיבי ולהרוג תאים סרטניים (חוסך תאים בריאים / נורמליים) תוך גרימת חסינות נגד גידולים. בשל תכונות ייחודיות אלה, אסטרטגיות טיפול מבוססות oHSV נמצאות בשימוש הולך וגובר לטיפול בסרטן, פרה-קלינית וקלינית, כולל talimogene laherparevec (T-Vec) שאושר על ידי ה-FDA. צמיחה, טיהור, טיטרציה הן שלוש טכניקות מעבדה חיוניות עבור כל OVs, כולל oHSVs, לפני שהם יכולים להיות מנוצלים למחקרים ניסיוניים. מאמר זה מתאר שיטה פשוטה שלב אחר שלב להגברת oHSV בתאי Vero. כמו oHSVs להכפיל, הם מייצרים אפקט ציטופתי (CPE) בתאי Vero. פעם 90-100% מהתאים הנגועים מראים CPE, הם נקצרים בעדינות, מטופלים עם בנזיונז ומגנזיום כלורי (MgCl2), מסוננים, ונתון לטיהור בשיטת ההדרגתית סוכרוז. לאחר הטיהור, מספר oHSV זיהומיות (המיועד כיחידות יוצרות פלאק או PFUs) נקבע על ידי "פלאק assay" בתאי Vero. הפרוטוקול המתואר בזאת יכול לשמש להכנת מלאי oHSV גבוה טיטר למחקרים במבחנה בתרבית התא בניסויים בבעלי חיים vivo.

סקירה קצרה של הפרוטוקול כולו מתוארת באיור 1, המייצג את הצעדים הקריטיים הכרוכים בצמיחה, טיהור וטייטרציה של oHSV. CPE בתאי Vero ניתן לזהות כבר 4 שעות לאחר זיהום HSV19. איור 2 מדגים CPE בתאי Vero בשלוש נקודות זמן שונות בעקבות זיהום oHSV. רמת ה- CPE גדלה עם הזמן. בפרוט...

Watch this Scientific Journal Video about Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus at JoVE.com

Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus

בכתב יד זה, אנו מתארים שיטה פשוטה של צמיחה, טיהור, ו titration של וירוס הרפס סימפלקס אונקוליטי לשימוש פרה-קוליני.

צמיחה, טיהור, ו Titration של וירוס הרפס סימפלקס אונקוליטי

Oncolytic viruses (OVs), such as&#160;the&#160;oncolytic herpes simplex virus (oHSV), are a rapidly growing treatment strategy in the field of cancer ...

וירוס הרפס סימפלקס oncolytic הוא צורה המתעוררים של אימונותרפיה סרטן. מערכת יעילה של התפשטות וירוסים, טיהור ונחישות טיטרית היא קריטית לשימוש במחקרים ניסיוניים. שיטה זו היא פשוטה מאוד וניתן לאמץ בקלות בכל biosafety רמה שתיים הגדרת מעבדה כדי לקבל מלאי ויראלי באיכות גבוהה למחקרים פרה-קוליניים.ייצור של איכות גבוהה, מלאי ויראלי טהור הוא חיוני שכן הוא משמש לחקר התגובה החיסונית נגד סרטן ולפתח צורה חדשה של אימונותרפיה סרטן מבוסס וירוס. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לטהר כל וירוס הרפס סימפלקס מסוג פראי או מהונדס גנטית. פרוטוקול זה צריך להיות קל לקריאה וקל לעקוב אחר אדם שמעולם לא ביצע טכניקה זו לפני.החומרים הרשומים ריאגנטים צריך להיות במקום לפני שניסה טכניקה זו בפעם הראשונה. התחילו בשטיפת צלושי T-150 ס"מ רבועים עם DPBS גלוקוז גבוה פי שניים בתוספת 1%IFCS. לשאוף את DPBS ולהוסיף שבעה מיליליטר של אינוקולום וירוס לכל בקבוק.בעדינות לנענע את הבקבוקים במשך חמש דקות דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1.5 עד 2 שעות. לאחר מכן, להסיר את inoculum ולהוסיף 25 מיליליטר של DMEM בתוספת 1%IFCS לכל בקבוק. לאחר הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך יומיים עד ארבעה ימים, לאסוף 20 מיליליטר של התרבות supernatant מכל בקבוק לתוך צינורות צנטריפוגה 50 מיליליטר.באמצעות מגרד תאים, לגרד את התאים מתחתית הבקבוקים. הוסף כ 15 מיליליטר של תרבות שנאסף בעבר supernatant לכל בקבוקון כדי להביא את הנפח עד 20 מיליליטר, ולאחר מכן להשתמש פיפטה סרולוגית סטרילית 10 מיליליטר לשטוף בעדינות את החלק התחתון של הבקבוקים כמה פעמים. לאסוף את התאים עם בינוני לתוך צינורות צנטריפוגה חרוט 50 מיליליטר להציב על קרח.צנטריפוגה הצינורות ב 300 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. Resuspend כל גלולה ביסודיות 1.25 מיליליטר של מאגר וירוסים, או VB, ו 1.25 מיליליטר של תרבות שנאספו בעבר supernatant. מערבבים את כל כדורי resuspended לתוך צינור אחד צנטריפוגה חרוט 50 מיליליטר.הצמד להקפיא את התאים בשימוש חוזר באמצעות קרח יבש ו 100% אתנול ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס. להפשיר את התאים הקפואים שנשברו בעבר באמבט מים חמים ב 37 מעלות צלזיוס sonicate במשך דקה אחת במשך שלושה מחזורים באמבט מים. הוסף 175 יחידות של נוקליאז בנזונס ושני מיקרוליטרים של שני מגנזיום כלוריד מילימולאר למיליליטר של ליסט התא ומערבולת.לאחר דגירה של 30 דקות ואמבט מים חמים ב 37 מעלות צלזיוס, מניחים את הצינור על קרח. לסובב את התא lysate ב 300 פעמים G במשך 10 דקות. לאסוף את supernatant בצינור צנטריפוגה חרוט 50 מיליליטר חדש resuspend גלולת התא ב 500 microliters של VB. לייעד אותו ככדור אחד.סובב את supernatant שנאסף שוב ב 500 פעמים G במשך 10 דקות ולאחסן את supernatant בנפרד בצינור צנטריפוגה חרוט טרי 50 מיליליטר לשימוש מאוחר יותר. Resuspend גלולת התא ב 500 microliters של VB, ייעוד זה כמו גלולה שתיים. לשלב את גלולה resuspended אחד גלולה שתיים בצינור צנטריפוגה חדש 1.75 מיליליטר ומערבולת sonicate פעמיים באמבט מים לפני ספינינג הצינורות ב 400 פעמים G במשך 10 דקות.לאסוף את supernatant מצינור צנטריפוגה 1.7 מיליליטר ולשלב אותו עם supernatant שנאסף בעבר צינור צנטריפוגה חרוט 50 מיליליטר. לסנן את supernatant דרך מסנן קרום PVDF סטרילי חמישה מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר חדש שנקרא צינור אחד. הוסף מיליליטר אחד של VB לצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר, התרוקן לאחר סינון supernatant מהצעד הקודם, מערבולת, ולהעביר אותו דרך אותו מסנן קרום PVDF להציב על צינור אחד.להעביר את הסינון מצינור אחד דרך מסנן קרום MCE סטרילי 0.8 מיקרומטר ממוקם על צינור צנטריפוגה חדש 50 מיליליטר בשם צינור שתיים. הוסף מיליליטר אחד של VB לצינור מרוקן אחד, מערבולת, ולהעביר אותו דרך אותו מסנן MCE ממוקם על צינור 2. מעבירים את הסינון מצינור 2 דרך מסנן PVDF סטרילי של 0.45 מיקרומטר שהונח על צינור צנטריפוגה חדש של 50 מיליליטר עם תווית צינור שלוש.כפי שתואר קודם לכן, לחזור על שטיפת צינור 2 עם מיליליטר אחד של VB להוסיף סינון צינור שלוש. בניתוח מייצג זה, ניתן היה לראות את האפקט הציטופתי בתאי Vero ב 36, 48, ו 72 שעות לאחר זיהום oHSV עם עיגול של התאים המושפעים. הרמה ההולכת וגדלה של CPE לאורך זמן ניכרת כפי שהיא מוצגת על-ידי ביטוי mCherry.ב 72 שעות לאחר ההדבקה, לוחות ויראליים היו מוכתמים X-גל לדמיין oHSVs עם ביטוי lacZ. קרצוף בעדינות את התאים נגועים בווירוס בעדינות לשטוף את החלק התחתון על הבקבוק הוא קריטי כדי לשמור על כל התא הנגוע HSV שלם, כך מלאי נגיפי טיטר גבוה ניתן להשיג.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

הקמת Epstein-Barr Virus צמיחה הפך שורות תאים Lymphoblastoid

Infection of B cells with Epstein-Barr virus (EBV) leads to proliferation and subsequent immortalization, resulting in establishment of lymphoblastoid ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

תא עצב ראשי מערכת התרבות לחקר וירוס הרפס סימפלקס המתנה ו הפעלה מחדש

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

זיקה טיהור של נגיף השפעת תסביכים Ribonucleoprotein של הכרומטין של תאים נגועים

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

זיהום Ex Vivo של Murine אפידרמיס עם סוג וירוס הרפס סימפלקס 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

האיתור וההסרה של נוקלאז זיהום במהלך טיהור של אב טיפוס רקומביננטי קצפית וירוס Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

הרכבה ולטיהור Intasomes וירוס קצפית אב-טיפוס

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

ניתוח הטמפורלי של רוברטסונית גרעינית-כדי-cytoplasmic של חלבון 1 וירוס הרפס סימפלקס מאת Immunofluorescent קונפוקלית

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

זיהוי של קידוד ללא קידוד RNA מחלקות לידי ביטוי החזירים דם מלא

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

דור, הגברה, טיטור של Recombinant וירוסים Syncytial הנשימה

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...