Name: growth, purification, and titration of oncolytic herpes simplex virus
Uploaded: 2021-05-13T14:30:00
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사하 연구소의 연구는 법무부 (W81XWH-20-1-0702)와 닷지 존스 재단 - 애빌렌의 자금에 의해 부분적으로 지원되었다. 새뮤얼 D. 랍킨과 멜리사 R.M 험프리는 NIH(R01 CA160762)의 지원을 부분적으로 받았습니다.

1) oHSV 성장
참고: oHSV와 함께 일하기 전에 기관 생물 안전 위원회의 승인을 보장하십시오. 이 연구는 승인 된 IBC 프로토콜 번호 18007에서 수행되었다. BSL2 예방 조치를 유지하십시오: 바이러스와 접촉하는 모든 파이프, 팁, 튜브 및 기타 물질을 표백합니다. 손 전에 70 % 이소 프로필 알코올스프레이 장갑은 BSL2 세포 배양 후드를 떠난다. 바이러스로 작업 한 후 항상 철저하게 비누 ?...

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	<li>Harrington, K., Freeman, D. J., Kelly, B., Harper, J., Soria, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+oncolytic+virotherapy+in+cancer+treatment.">Optimizing oncolytic virotherapy in cancer treatment.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (9), 689-706 (2019).</li><li>Zhang, S., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discovery+and+development+of+oncolytic+viruses:+are+they+the+future+of+cancer+immunotherapy.">The discovery and development of oncolytic viruses: are they the future of cancer immunotherapy.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (4), 391-410 (2021).</li><li>Bommareddy, P. K., Peters, C., Saha, D., Rabkin, S. D., Kaufman, H. 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D., Pitha, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+and+posttranscriptional+regulation+of+exogenous+human+beta+interferon+gene+in+simian+cells+defective+in+interferon+synthesis.">Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis.</a> Molecular and Cellular Biology. 6 (6), 2279-2283 (1986).</li><li>Gousseinoz, E., Kools, W., Pattnaik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+impurity+reduction+in+viral+vaccine+manufacturing.">Nucleic acid impurity reduction in viral vaccine manufacturing.</a> BioProcess International. 12 (2), 59-68 (2014).</li><li>Diefenbach, R. 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G., Blomberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+herpes+simplex+virus.">Purification of herpes simplex virus.</a> Journal of General Virology. 22 (2), 297-302 (1974).</li><li>Sathananthan, B., Rodahl, E., Flatmark, T., Langeland, N., Haarr, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+herpes+simplex+virus+type+1+by+density+gradient+centrifugation+and+estimation+of+the+sedimentation+coefficient+of+the+virion.">Purification of herpes simplex virus type 1 by density gradient centrifugation and estimation of the sedimentation coefficient of the virion.</a> APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 105 (3), 238-246 (1997).</li><li>Mundle, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-purity+preparation+of+HSV-2+vaccine+candidate+ACAM529+is+immunogenic+and+efficacious+in+vivo.">High-purity preparation of HSV-2 vaccine candidate ACAM529 is immunogenic and efficacious in vivo.</a> PLoS One. 8 (2), 57224 (2013).</li><li>Jiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+cobalt+affinity+chromatography+provides+a+novel,+efficient+method+for+herpes+simplex+virus+type+1+gene+vector+purification.">Immobilized cobalt affinity chromatography provides a novel, efficient method for herpes simplex virus type 1 gene vector purification.</a> Journal of Virology. 78 (17), 8994-9006 (2004).</li><li>Grosche, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+propagation,+titration+and+single-step+growth+curves.">Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves.</a> Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).</li><li>Svennerholm, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+herpes+simplex+virus+virions+and+nucleocapsids+on+Percoll+gradients.">Separation of herpes simplex virus virions and nucleocapsids on Percoll gradients.</a> Journal of Virological Methods. 1 (6), 303-309 (1980).</li><li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+concentration+determination+through+plaque+assays:+using+traditional+and+novel+overlay+systems.">Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).</li><li>Miyatake, S., Iyer, A., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+targeting+of+herpes+simplex+virus+for+cell-specific+replication.">Transcriptional targeting of herpes simplex virus for cell-specific replication.</a> Journal of Virology. 71 (7), 5124-5132 (1997).</li><li>Fabiani, M., Limongi, D., Palamara, A. T., De Chiara, G., Marcocci, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+titrate+herpes+simplex+virus-1+(HSV-1)+using+laser-based+scanning+of+near-infrared+fluorophores+conjugated+antibodies.">A novel method to titrate herpes simplex virus-1 (HSV-1) using laser-based scanning of near-infrared fluorophores conjugated antibodies.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1085 (2017).</li></ol>

프로토콜은 낮은 통로 베로 세포에서 oHSV의 성장으로 시작합니다. 베로 세포 단층의 합류는 자란 세포가 베로세포(20)로oHSV 입력을 감소시킬 수 있는 단단한 섬유구조를 개발할 수 있기 때문에 바이러스 접종 시에 ~80%여야 한다. 일단 90-100% CPE가 관찰되면, 배양 상체가 제거되고, 세포가 수확되고, VB/수퍼나탄트에서 재장매되고(단계 1.4.6 참조), 스냅 냉동, 및 나중에 정화를 위해 -8...

종양 분석 바이러스 (EV)는 암 면역 요법의 신흥 독특한 형태입니다. OV는 항종양면역2를유도하면서 종양 세포(정상/건강한 세포를 아끼는)1에서 선택적으로 복제및 용해된다. 온코일리틱 포진 심플렉스 바이러스(oHSV)는 모든 TV 중에서 가장 광범위하게 연구된 바이러스 중 하나입니다. 탈리모진 래에르파렙벡(T-VEC)이 미국에서 고급 흑색종3의치료를 위한 FDA 승인을 받은 최초의 유일한 OV인 것으로, 클리닉에서 가장 멀리 있다. T-VEC 이외에, 다른 많은 유전자 조작 된 oHSV는 다른 암유형3,4,5,6,7,8에서전임상 및 임상적으로 테스트되고 있다. 현재 진행된 재조합 DNA 생명공학은 치료형 트랜스진3,5에대한 새로운 oHSV코딩 엔지니어링의 타당성을 더욱 높이고있다. oHSV 전파, 정화 및 티터 결정의 효율적인 시스템은 시험관 내 및 생체 내 연구를 위해 테스트할 수 있는 (새로 개발된) oHSV전에 매우 중요합니다. 본 논문은 oHSV 성장(베로 세포), 정제(자당-그라데이션 방법에 의한), 적정(베로 세포의 oHSV 플라크 분석)의 간단한 단계별 방법을 설명합니다(도1). 그것은 쉽게 전임상 연구를위한 고품질의 바이러스 성 주식을 달성하기 위해 모든 생물 안전 수준 2 (BSL2) 실험실 설정에서 채택 될 수있다.
베로, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포주, oHSV전파에가장 일반적으로 사용되는 세포주9,10,11,12,13 베로 세포는 결함이 있는 항 바이러스 인터페론 신호경로(14)이다. 인터페론 유전자(STING) 신호의 불활성화 된 자극기와 다른 세포주또한 oHSV 성장(12,13)에사용될 수있다. 이 프로토콜은 oHSV 성장 및 플라크 분석에 대한 베로 세포를 활용합니다. 전파후, oHSV-감염된 세포는 수확, 용해 및 정화를 실시하며, 이에 따라 용액 세포는 먼저 벤조나제 뉴클레아아제로 처리되어 숙주 세포 DNA를 저하시키고, 핵산 단백질 응집을 방지하며, 세포 용액의 점도를 감소시한다. 벤조나아제의 적절한 활성화는 종종 Mg2 +필요하므로, 1-2 mM MgCl2이 프로토콜에 사용된다15. 벤조나제 처리된 세포 용액의 숙주 세포 파편은 고속 자당 그라데이션 원심분리 전에 직렬 여과에 의해 더 제거된다. 점성 25% 자당 용액 쿠션은 자당층을 통한 바이러스 이동 속도가 느려지도록 하여 주전자 세포 관련 성분을 상복부에 남겨두어 펠릿16에서바이러스 손실을 정화및 제한하는 데 도움이 된다. 정제 된 oHSV는 다음 베로 세포에 titrated, 바이러스 플라크는 Giemsa 염색에 의해 시각화17 또는 X-갈 염색 (락즈 인코딩 oHSV에 대한)18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.7 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polypropylene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E8263-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>179693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3007003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-262-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-21-021-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Glucose Dulbecco&#8217;s Phosphate-buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human immune globulin</td>
			<td>Gamastan</td>
			<td>NDC 13533-335-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Sterilization filter, 250 mL</td>
			<td>Nalgene, Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-25E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Sterilization filter, 500 mL</td>
			<td>Nalgene, Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-25C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Red solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N4638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>&#160;15710S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate rocker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>88861043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferricyanide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferrocyanide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 16R Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75004381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 21R Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75002446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 0.45 PVDF</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLHV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 0.8 MCE</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLAA033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, 5 &#181;m PVDF</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLSV025LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T150 culture flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>355001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>MP Biomedicals LLC</td>
			<td>816116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic water bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX-952-116R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-101-RF</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

growth, purification, and titration of oncolytic herpes simplex virus

종양용성 포진 심플렉스 바이러스(oHSV)와 같은 종양용액 바이러스(OV)는 암 면역요법 분야에서 빠르게 성장하는 치료 전략이다. oHSV를 포함한 OV는 항종양 면역을 유도하면서 암세포(건강/정상 세포를 아끼는)를 선택적으로 복제하고 죽입니다. 이러한 독특한 특성 때문에, oHSV 기반 치료 전략은 점점 더 암의 치료에 사용되고있다, 전임상 및 임상적으로, FDA 승인 탈리모진 laherparevec을 포함 (T-Vec). 성장, 정제 및 적정은 실험 연구에 활용되기 전에 oHSV를 포함한 모든 TV에 필수적인 실험실 기술입니다. 이 백서는 베로 세포에서 oHSV를 증폭시키는 간단한 단계별 방법을 설명합니다. oHSV가 증식함에 따라 베로 세포에서 세포 병증 효과 (CPE)를 생성합니다. 감염된 세포의 90-100%가 CPE를 나타내면, 부드럽게 수확되고, 벤조나제와 염화마그네슘(MgCl2)으로처리되고, 여과하고, 자당그라데이션 방법을 사용하여 정제를 실시한다. 정제 후, 전염성 oHSV(플라크 형성 유닛 또는 PfUs로 지정)의 수는 베로 세포의 "플라크 분석"에 의해 결정된다. 본 명세서에 기재된 프로토콜은 세포 배양 및 생체 내 동물 실험에서 체외 연구를 위해 고-티터 oHSV 스톡을 준비하는 데 사용될 수 있다.

전체 프로토콜에 대한 간략한 개요는 oHSV의 성장, 정화 및 적정과 관련된 중요한 단계를 나타내는 그림 1에묘사됩니다. 베로 세포에서 CPE는 HSV 감염 후 4시간 감염19로일찍 검출될 수 있다. 도 2는 oHSV 감염 다음 세 가지 다른 시점에서 베로 세포에서 CPE를 시연한다. 시간이 지남에 따라 CPE 수준이 증가합니다. 이 프로토콜에서, 90-100% CPE?...

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Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus

이 원고에서는, 우리는 전임상 사용을 위한 온연성 포진 심플렉스 바이러스의 성장, 정제 및 적정의 간단한 방법을 설명합니다.

온코연성 포진 심플렉스 바이러스의 성장, 정화 및 적정

Oncolytic viruses (OVs), such as&#160;the&#160;oncolytic herpes simplex virus (oHSV), are a rapidly growing treatment strategy in the field of cancer ...

종양용용성 포진 심플렉스 바이러스는 암 면역 요법의 출현 형태입니다. 바이러스 전파, 정화 및 적정 결정의 효율적인 시스템은 실험 연구에서 사용에 매우 중요합니다. 이 방법은 매우 간단하며 모든 생체 안전 수준 2 실험실 설정에서 쉽게 채택되어 전임상 연구를 위한 고품질 바이러스 재고를 받을 수 있습니다.높은 품질의 순수 바이러스 재고의 생산은 항암 면역 반응을 연구하고 바이러스 기반 암 면역 요법의 새로운 형태를 개발하는 데 사용되기 때문에 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 야생 형 또는 유전자 조작 된 포진 심플렉스 바이러스를 정화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 읽기 쉽고 이전에이 기술을 수행 한 적이없는 개인을 위해 따라하기 쉬워야합니다.나열된 재료와 시약은 이 기술을 처음으로 시도하기 전에 제자리에 있어야 합니다. T-150 평방 센티미터 플라스크를 2 배 높은 포도당 DPBS로 세척하여 1 %IFCS로 보충합니다. DPBS를 흡인하고 플라스크 당 바이러스 접종7 밀리리터를 추가합니다.플라스크를 5분간 부드럽게 흔들고 섭씨 37도에서 1.5~2시간 동안 배양합니다. 그런 다음, 접종을 제거하고 각 플라스크에 1 %IFCS로 보충 DMEM의 25 밀리리터를 추가합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 2~4일 동안 배양한 후, 각 플라스크에서 50밀리리터 원심분리기 튜브로 20밀리리터의 배양 슈퍼리터를 수집합니다.셀 스크레이퍼를 사용하여 플라스크 바닥에서 셀을 긁어냅니다. 이전에 수집된 배양 상수의 약 15밀리리터를 각 플라스크에 첨가하여 최대 20밀리리터의 부피를 가져온 다음 10밀리리터 멸균 서로지학적 파이펫을 사용하여 플라스크 바닥을 몇 번 부드럽게 세척합니다. 얼음 위에 놓인 50밀리리터 원심분리기 튜브로 배지를 가진 세포를 수집합니다.4°C에서 10분 동안 300배 G로 튜브를 원심분리합니다. 각 펠릿을 바이러스 완충제 또는 VB, 및 이전에 수집한 배양 상수의 1.25 밀리리터에서 철저히 재보종. 모든 재중단 된 펠릿을 50 밀리리터 원심 분리 튜브에 섞습니다.드라이 아이스와 100% 에탄올을 사용하여 재중단 된 세포를 얼리고 영하 80도에 보관하십시오. 이전에 스냅된 냉동 세포를 따뜻한 수조에서 섭씨 37도에서 해동하고 수조에서 3주기 동안 1분간 초음파 처리합니다. 벤조나제 뉴클레아제 175단위와 세포 용해및 소용돌이의 밀리리터당 염화 마그네슘 2개소2개소를 첨가한다.30분의 배양과 섭씨 37도의 따뜻한 수조후, 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 셀 용해를 300회 G에서 10분간 회전시합니다. 새로운 50 밀리리터 원심 분리기 튜브에서 상퍼를 수집하고 VB의 500 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 펠릿 하나로 지정합니다.수집된 상체를 500회 G에서 10분 동안 다시 회전시키고, 상체를 신선한 50밀리리터 원심분리기 튜브에 따로 보관하여 나중에 사용할 수 있습니다. VB의 500 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 중단하여 펠릿 2로 지정합니다. 재중단 된 펠릿 1개와 펠릿 2개를 새로운 1.75 밀리리터 원심분리기 튜브와 소용돌이에 결합하고 수조에서 두 번 초음파 처리한 후 튜브를 400회 G로 10분 간 회전시보세요.1.7 밀리리터 원심분리기 튜브에서 상퍼를 수집하고 이전에 수집된 50밀리리터 원심분리기 튜브와 결합합니다. 멸균 5 마이크로미터 PVDF 멤브레인 필터를 통해 상체를 튜브라고 하는 새로운 50 밀리리터 원심분리기 튜브로 필터링합니다. 50 밀리리터 원심분리기 튜브에 VB 1밀리리터를 넣고, 이전 단계에서 상퍼를 걸러낸 후 비워져 튜브에 배치된 동일한 PVDF 멤브레인 필터를 통과한다.튜브 2라고 불리는 새로운 50 밀리리터 원심분리기 튜브에 배치된 멸균 0.8 마이크로미터 MCE 멤브레인 필터를 통해 튜브 하나에서 여과물을 전달합니다. 비운 튜브 1개, 소용돌이에 VB 1밀리리터를 넣고 튜브 2에 배치된 동일한 MCE 필터를 통과합니다. 새로운 50 밀리리터 원심분리기 튜브 3에 배치멸균 0.45 마이크로미터 PVDF 필터를 통해 튜브 2에서 여과를 전달합니다.앞에서 설명한 바와 같이, 튜브 3에 여과를 추가하기 위해 VB의 1 밀리리터로 튜브 2의 세척을 반복합니다. 이러한 대표적인 분석에서, 세포요법 효과는 영향받은 세포의 반올림을 통해 oHSV 감염 후 36, 48 및 72시간 후 베로 세포에서 관찰될 수 있었다. 시간이 지남에 따라 CPE의 증가 수준은 mCherry 표현에 의해 시각화로 분명하다.감염 후 72시간 동안, 바이러스 플라크는 X-gal으로 염색되어 lacZ 발현으로 oHSV를 시각화했습니다. 바이러스 감염 세포를 부드럽게 스크러빙하고 플라스크에 바닥을 부드럽게 세척하는 것은 모든 HSV 감염된 세포를 그대로 유지하는 것이 매우 중요합니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

엡스타인 - 바 바이러스 성장 변화 Lymphoblastoid 전지 라인 구축

Infection of B cells with Epstein-Barr virus (EBV) leads to proliferation and subsequent immortalization, resulting in establishment of lymphoblastoid ...

연구

면역학 및 감염병학

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

헤르페스의 연구를위한 예비 신경 세포 문화 시스템은 바이러스 지연 및 재가입을 단순

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

감염된 세포의 염색질에서 인플루엔자 바이러스 Ribonucleoprotein 컴플렉스의 동질 정제

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

단순 포진 바이러스 1 형과 쥐 표피의 생체 감염

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

검색 및 재조합 프로토 타입 거품 바이러스 Integrase의 정화 동안 Nuclease 오염의 제거

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

조립 및 프로토 타입 거품 바이러스 Intasomes의 정화

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Immunofluorescent Confocal 현미경 검사 법에 의해 포진 심 플렉스 바이러스 1 단백질의 핵-세포질 전 좌의 시간적 분석

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

코딩 및 비 코딩 RNA 클래스의 식별 표시 돼지에서 전 혈

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

생성, 증폭 및 재조합 호흡 Syncytial 바이러스의 적정

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...