Name: growth, purification, and titration of oncolytic herpes simplex virus
Uploaded: 2021-05-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus at JoVE.com

Forskning i Saha-laboratoriet ble delvis støttet av midler fra DOD (W81XWH-20-1-0702) og Dodge Jones Foundation-Abilene. Samuel D. Rabkin og Melissa R.M. Humphrey ble delvis støttet av NIH (R01 CA160762).

1) oHSV vekst
MERK: Sørg for godkjenning av institusjonell biosikkerhetskomité før du arbeider med oHSV. Denne studien ble utført under godkjent IBC-protokoll nr. Vedlikehold BSL2 forholdsregler: bleke alle pipetter, spisser, rør og andre materialer som kommer i kontakt med viruset. Spray hansker med 70% isopropylalkohol før hendene forlater BSL2 cellekulturhetten. Vask alltid hendene grundig med såpevann etter å ha jobbet med et virus.
<ol><li>På dag -1, frø lavpassasje Vero celle...

<ol>
	<li>Harrington, K., Freeman, D. J., Kelly, B., Harper, J., Soria, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+oncolytic+virotherapy+in+cancer+treatment.">Optimizing oncolytic virotherapy in cancer treatment.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (9), 689-706 (2019).</li><li>Zhang, S., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discovery+and+development+of+oncolytic+viruses:+are+they+the+future+of+cancer+immunotherapy.">The discovery and development of oncolytic viruses: are they the future of cancer immunotherapy.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (4), 391-410 (2021).</li><li>Bommareddy, P. K., Peters, C., Saha, D., Rabkin, S. D., Kaufman, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+herpes+simplex+viruses+as+a+paradigm+for+the+treatment+of+cancer.">Oncolytic herpes simplex viruses as a paradigm for the treatment of cancer.</a> Annual Review of Cancer Biology. 2 (1), 155-173 (2018).</li><li>Peters, C., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+herpes+viruses+as+oncolytics.">Designing herpes viruses as oncolytics.</a> Molecular Therapy-Oncolytics. 2, 15010 (2015).</li><li>Nguyen, H. -. M., Saha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+current+state+of+oncolytic+herpes+simplex+virus+for+glioblastoma+treatment.">The current state of oncolytic herpes simplex virus for glioblastoma treatment.</a> Oncolytic Virotherapy. 10, 1-27 (2021).</li><li>Koch, M. S., Lawler, S. E., Chiocca, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSV-1+oncolytic+viruses+from+bench+to+bedside:+an+overview+of+current+clinical+trials.">HSV-1 oncolytic viruses from bench to bedside: an overview of current clinical trials.</a> Cancers. 12 (12), 3514 (2020).</li><li>Menotti, L., Avitabile, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+oncolytic+immunovirotherapy:+the+blossoming+branch+of+multimodal+therapy.">Herpes simplex virus oncolytic immunovirotherapy: the blossoming branch of multimodal therapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8310 (2020).</li><li>Nguyen, H. M., Guz-Montgomery, K., Saha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+virus+encoding+a+master+pro-inflammatory+cytokine+interleukin+12+in+cancer+immunotherapy.">Oncolytic virus encoding a master pro-inflammatory cytokine interleukin 12 in cancer immunotherapy.</a> Cells. 9 (2), 400 (2020).</li><li>Agarwalla, P. K., Aghi, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+herpes+simplex+virus+engineering+and+preparation.">Oncolytic herpes simplex virus engineering and preparation.</a> Methods in Molecular Biology. 797, 1-19 (2012).</li><li>Grosche, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+propagation,+titration+and+single-step+growth+curves.">Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves.</a> Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).</li><li>Sutter, S. O., Marconi, P., Meier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+growth,+preparation,+and+assay.">Herpes simplex virus growth, preparation, and assay.</a> Methods in Molecular Biology. 2060, 57-72 (2020).</li><li>Froechlich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrity+of+the+antiviral+STING-mediated+DNA+sensing+in+tumor+cells+is+required+to+sustain+the+immunotherapeutic+efficacy+of+herpes+simplex+oncolytic+virus.">Integrity of the antiviral STING-mediated DNA sensing in tumor cells is required to sustain the immunotherapeutic efficacy of herpes simplex oncolytic virus.</a> Cancers. 12 (11), 3407 (2020).</li><li>Froechlich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+novel+mesothelin-targeted+oncolytic+herpes+virus+and+implemented+strategies+for+manufacturing.">Generation of a novel mesothelin-targeted oncolytic herpes virus and implemented strategies for manufacturing.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 477 (2021).</li><li>Mosca, J. D., Pitha, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+and+posttranscriptional+regulation+of+exogenous+human+beta+interferon+gene+in+simian+cells+defective+in+interferon+synthesis.">Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis.</a> Molecular and Cellular Biology. 6 (6), 2279-2283 (1986).</li><li>Gousseinoz, E., Kools, W., Pattnaik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+impurity+reduction+in+viral+vaccine+manufacturing.">Nucleic acid impurity reduction in viral vaccine manufacturing.</a> BioProcess International. 12 (2), 59-68 (2014).</li><li>Diefenbach, R. J., Fraefel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus:+methods+and+protocols.">Herpes simplex virus: methods and protocols.</a> Methods in Molecular Biology. , (2014).</li><li>Hadi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+trial+to+prepared+&#947;1+34.5+herpes+simplex+virus+1+immunogene+by+cloning+technique.">An experimental trial to prepared &#947;1 34.5 herpes simplex virus 1 immunogene by cloning technique.</a> Systematic Review Pharmacy. 11 (5), 140-149 (2020).</li><li>Kuroda, T., Martuza, R. L., Todo, T., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flip-Flop+HSV-BAC:+bacterial+artificial+chromosome+based+system+for+rapid+generation+of+recombinant+herpes+simplex+virus+vectors+using+two+independent+site-specific+recombinases.">Flip-Flop HSV-BAC: bacterial artificial chromosome based system for rapid generation of recombinant herpes simplex virus vectors using two independent site-specific recombinases.</a> BMC Biotechnology. 6, 40 (2006).</li><li>Motamedifar, M., Noorafshan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytopathic+effect+of+the+herpes+simplex+virus+type+1+appears+stereologically+as+early+as+4+h+after+infection+of+Vero+cells.">Cytopathic effect of the herpes simplex virus type 1 appears stereologically as early as 4 h after infection of Vero cells.</a> Micron. 39 (8), 1331-1334 (2008).</li><li>Blaho, J. A., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus:+propagation,+quantification,+and+storage.">Herpes simplex virus: propagation, quantification, and storage.</a> Current Protocols in Microbiology. , 1 (2005).</li><li>Malenovska, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+stabilizers+and+rates+of+freezing+on+preserving+of+structurally+different+animal+viruses+during+lyophilization+and+subsequent+storage.">The influence of stabilizers and rates of freezing on preserving of structurally different animal viruses during lyophilization and subsequent storage.</a> Journal of Applied Microbiology. 117 (6), 1810-1819 (2014).</li><li>Vahlne, A. G., Blomberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+herpes+simplex+virus.">Purification of herpes simplex virus.</a> Journal of General Virology. 22 (2), 297-302 (1974).</li><li>Sathananthan, B., Rodahl, E., Flatmark, T., Langeland, N., Haarr, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+herpes+simplex+virus+type+1+by+density+gradient+centrifugation+and+estimation+of+the+sedimentation+coefficient+of+the+virion.">Purification of herpes simplex virus type 1 by density gradient centrifugation and estimation of the sedimentation coefficient of the virion.</a> APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 105 (3), 238-246 (1997).</li><li>Mundle, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-purity+preparation+of+HSV-2+vaccine+candidate+ACAM529+is+immunogenic+and+efficacious+in+vivo.">High-purity preparation of HSV-2 vaccine candidate ACAM529 is immunogenic and efficacious in vivo.</a> PLoS One. 8 (2), 57224 (2013).</li><li>Jiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+cobalt+affinity+chromatography+provides+a+novel,+efficient+method+for+herpes+simplex+virus+type+1+gene+vector+purification.">Immobilized cobalt affinity chromatography provides a novel, efficient method for herpes simplex virus type 1 gene vector purification.</a> Journal of Virology. 78 (17), 8994-9006 (2004).</li><li>Grosche, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+propagation,+titration+and+single-step+growth+curves.">Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves.</a> Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).</li><li>Svennerholm, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+herpes+simplex+virus+virions+and+nucleocapsids+on+Percoll+gradients.">Separation of herpes simplex virus virions and nucleocapsids on Percoll gradients.</a> Journal of Virological Methods. 1 (6), 303-309 (1980).</li><li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+concentration+determination+through+plaque+assays:+using+traditional+and+novel+overlay+systems.">Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).</li><li>Miyatake, S., Iyer, A., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+targeting+of+herpes+simplex+virus+for+cell-specific+replication.">Transcriptional targeting of herpes simplex virus for cell-specific replication.</a> Journal of Virology. 71 (7), 5124-5132 (1997).</li><li>Fabiani, M., Limongi, D., Palamara, A. T., De Chiara, G., Marcocci, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+titrate+herpes+simplex+virus-1+(HSV-1)+using+laser-based+scanning+of+near-infrared+fluorophores+conjugated+antibodies.">A novel method to titrate herpes simplex virus-1 (HSV-1) using laser-based scanning of near-infrared fluorophores conjugated antibodies.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1085 (2017).</li></ol>

Protokollen starter med veksten av oHSV i veroceller med lav passasje. Sammenløpet av Vero-cellemonolayeren bør være ~ 80% på tidspunktet for virusinokulering, da overgrodde celler kan utvikle tette fibrøse strukturer som kan redusere oHSV-oppføring i Vero-celler20. Når 90-100% CPE er observert, fjernes kulturen supernatant, celler høstes, resuspenderes i VB / supernatant (se trinn 1.4.6), snap-frossen og lagres ved -80 °C for senere rensing. Blaho og kollegene brukte en litt annen metode...

Onkolytiske virus (OVer) er en fremvoksende og unik form for kreftimmunoterapi. OVer replikerer selektivt i og lyse tumorceller (sparer normale / sunne celler)1 mens de induserer anti-tumorimmunitet2. Onkolytisk herpes simplex virus (oHSV) er en av de mest omfattende studerte virus blant alle OVer. Det er lengst med i klinikken, med Talimogene laherparepvec (T-VEC) som den første og eneste OV som mottar FDA-godkjenning i USA for behandling av avansert melanom3. I tillegg til T-VEC blir mange andre genmodifiserte oHSVer testet preklinisk og klinisk i forskjellige krefttyper3,4,5,6,7,8. Den nåværende avanserte rekombinante DNA bioteknologi har ytterligere økt muligheten for å konstruere nye oHSVs koding for terapeutiske transgene (er)3,5. Et effektivt system for oHSV-forplantning, rensing og titerbestemmelse er avgjørende før noen (nyutviklet) oHSV kan testes for in vitro- og in vivo-studier. Dette dokumentet beskriver en enkel trinnvis metode for oHSV-vekst (i Vero-celler), rensing (ved sukrosegradientmetoden) og titrering (ved en oHSV-plakkanalyse i Vero-celler) (Figur 1). Det kan enkelt tas i bruk i alle Biosafety Level 2 (BSL2) laboratorieinnstillinger for å oppnå en høy kvalitet viral lager for prekliniske studier.
Vero, en afrikansk grønn ape nyrecellelinje, er den mest brukte cellelinjen for oHSV-forplantning9,10,11,12,13 da Vero-celler har en defekt antiviral interferonsignaleringsvei14. Andre cellelinjer med inaktivert stimulator av interferongener (STING) signalering kan også brukes til oHSV vekst12,13. Denne protokollen benytter Vero-celler for oHSV-vekst og plakkanalyse. Etter forplantning høstes, lyser og utsettes oHSV-infiserte celler for rensing, hvor lysede celler først behandles med benzonasekjernen for å forringe vertscelle-DNA, forhindre nukleinsyreproteinaggregering og redusere viskositeten til cellelysatet. Som riktig aktivering av benzonase krever ofte Mg2 +, 1-2 mM MgCl2 brukes i denne protokollen15. Vertscellerester fra benzonasebehandlet cellelysat elimineres ytterligere ved seriell filtrering før høyhastighets sukrosegradient sentrifugering. En viskøs 25% sukrose løsning pute bidrar til å sikre en langsommere grad av virusmigrering gjennom sukroselaget, slik at vertscellerelaterte komponenter blir igjen i supernatanten, og dermed forbedrer rensing og begrenser virustap ipellets 16. Den rensede oHSV titreres deretter på Vero-celler, og virale plakk visualiseres av Giemsa-flekker17 eller X-gal farging (for LacZ-koding av oHSVer)18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.7 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polypropylene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E8263-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>179693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3007003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-262-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-21-021-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Glucose Dulbecco&#8217;s Phosphate-buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human immune globulin</td>
			<td>Gamastan</td>
			<td>NDC 13533-335-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Sterilization filter, 250 mL</td>
			<td>Nalgene, Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-25E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Sterilization filter, 500 mL</td>
			<td>Nalgene, Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-25C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Red solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N4638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>&#160;15710S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate rocker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>88861043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferricyanide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferrocyanide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 16R Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75004381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 21R Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75002446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 0.45 PVDF</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLHV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 0.8 MCE</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLAA033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, 5 &#181;m PVDF</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLSV025LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T150 culture flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>355001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>MP Biomedicals LLC</td>
			<td>816116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic water bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX-952-116R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-101-RF</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

growth, purification, and titration of oncolytic herpes simplex virus

Onkolytiske virus (OVs), som onkolytisk herpes simplex virus (oHSV), er en raskt voksende behandlingsstrategi innen kreftimmunoterapi. OVer, inkludert oHSV, replikerer selektivt i og dreper kreftceller (sparer sunne / normale celler) mens de induserer anti-tumorimmunitet. På grunn av disse unike egenskapene blir oHSV-baserte behandlingsstrategier i økende grad brukt til behandling av kreft, preklinisk og klinisk, inkludert FDA-godkjent talimogene laherparevec (T-Vec). Vekst, rensing og titrering er tre viktige laboratorieteknikker for alle OVer, inkludert oHSVer, før de kan brukes til eksperimentelle studier. Dette dokumentet beskriver en enkel trinnvis metode for å forsterke oHSV i Vero-celler. Etter hvert som oHSVer multipliserer, produserer de en cytopatisk effekt (CPE) i Vero-celler. Når 90-100% av de infiserte cellene viser en CPE, blir de forsiktig høstet, behandlet med benzonase og magnesiumklorid (MgCl2), filtrert og utsatt for rensing ved hjelp av sukrosegradientsmetoden. Etter rensing bestemmes antall smittsomme oHSV (betegnet som plakkdannende enheter eller PFUer) av en "plakkanalyse" i Vero-celler. Protokollen som er beskrevet her, kan brukes til å forberede høytitrener oHSV-lager for in vitro-studier i cellekultur og in vivo dyreforsøk.

En kort oversikt over hele protokollen er avbildet i figur 1, som representerer de kritiske trinnene som er involvert i vekst, rensing og titrering av oHSV. CPE i Vero celler kan påvises så tidlig som 4 h post-HSV infeksjon19. Figur 2 viser CPE i Vero-celler ved tre ulike tidspunkter etter oHSV-infeksjon. Nivået på CPE økes over tid. I denne protokollen observeres vanligvis 90-100% CPE innen 48 timer lav-MOI oHSV-inokulering (som er ...

Watch this Scientific Journal Video about Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus at JoVE.com

Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus

I dette manuskriptet beskriver vi en enkel metode for vekst, rensing og titrering av det onkolytiske herpes simplex-viruset for preklinisk bruk.

Vekst, rensing og titrering av onkolytisk herpes Simplex Virus

Oncolytic viruses (OVs), such as&#160;the&#160;oncolytic herpes simplex virus (oHSV), are a rapidly growing treatment strategy in the field of cancer ...

Onkolytisk herpes simplex virus er en fremvoksende form for kreft immunterapi. Et effektivt system for virusforplantning, rensing og titerisk bestemmelse er avgjørende for bruken i eksperimentelle studier. Denne metoden er veldig enkel og kan enkelt vedtas i alle biosikkerhetsnivå to laboratorieinnstillinger for å motta en høy kvalitet viral lager for prekliniske studier.Produksjon av en høy kvalitet, ren viral bestand er avgjørende siden den brukes til å studere anticancer immunrespons og å utvikle en ny form for virusbasert kreftimmunoterapi. Denne protokollen kan brukes til å rense enhver villtype eller genetisk konstruert herpes simplex virus. Denne protokollen skal være lett å lese og lett å følge for en person som aldri har utført denne teknikken før.De oppførte materialene og reagensene bør være på plass før du prøver denne teknikken for første gang. Begynn med å vaske T-150 kvadratcentimeterflasker med to ganger høy glukose DPBS supplert med 1% IFCS. Aspirer DPBS og tilsett syv milliliter virusinokulum per kolbe.Gyng forsiktig kolber i fem minutter og inkuber ved 37 grader Celsius i 1,5 til 2 timer. Fjern deretter inokulumet og tilsett 25 milliliter DMEM supplert med 1% IFCS til hver kolbe. Etter inkubasjon ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i to til fire dager, samle 20 milliliter av kulturen supernatant fra hver kolbe til 50 milliliter sentrifuger rør.Skrap cellene fra bunnen av kolbeene ved hjelp av en celleskraper. Tilsett omtrent 15 milliliter av den tidligere innsamlede kulturen supernatant til hver kolbe for å bringe volumet opp til 20 milliliter, og bruk deretter en 10 milliliter steril serologisk pipette for å vaske bunnen av kolbeene forsiktig noen ganger. Samle cellene med medium i 50 milliliter koniske sentrifugerør plassert på is.Sentrifuger rørene ved 300 ganger G i 10 minutter ved fire grader Celsius. Resuspend hver pellet grundig i 1,25 milliliter virusbuffer, eller VB, og 1,25 milliliter tidligere samlet kultur supernatant. Bland alle resuspenderte pellets i ett konisk sentrifugerør på 50 milliliter.Snap fryse resuspended celler ved hjelp av tørris og 100% etanol og lagre på minus 80 grader Celsius. Tine de tidligere snappede frosne cellene i et varmt vannbad ved 37 grader Celsius og soniker i ett minutt i tre sykluser i et vannbad. Tilsett 175 enheter Benzonase Nuclease og to mikroliter med to millimolar magnesiumklorid per milliliter av cellelyset og virvelen.Etter en inkubasjon på 30 minutter og varmt vannbad ved 37 grader Celsius, plasser røret på is. Snurr cellelyset ved 300 ganger G i 10 minutter. Samle supernatanten i et nytt konisk sentrifugerør på 50 milliliter og resuspender cellepelleten i 500 mikroliter VB. Utpeke den som pellets.Snurr den oppsamlede supernatanten igjen ved 500 ganger G i 10 minutter og oppbevar supernatanten separat i et friskt konisk sentrifugerør på 50 milliliter som kan brukes senere. Resuspend cellepellet i 500 mikroliter VB, og utpeke den som pellet to. Kombiner den resuspenderte pelletsen en og pellet to i et nytt 1,75 milliliter sentrifugerrør og virvel og soniker to ganger i et vannbad før du spinner rørene på 400 ganger G i 10 minutter.Samle supernatant fra 1,7 milliliter sentrifuge rør og kombinere det med supernatant tidligere samlet 50 milliliter konisk sentrifuge rør. Filtrer supernatanten gjennom et sterilt fem mikrometer PVDF membranfilter i et nytt sentrifugerør på 50 milliliter kalt rør 1. Tilsett en milliliter VB i 50 milliliter sentrifugerøret, tømt etter filtrering av supernatanten fra forrige trinn, virvel, og før den gjennom det samme PVDF-membranfilteret plassert på rør en.Før filtratet fra rør en gjennom et sterilt MCE-membranfilter på 0,8 mikrometer plassert på et nytt 50 milliliter sentrifugerør kalt rør to. Tilsett en milliliter VB i det tømte røret en, virvel, og før den gjennom det samme MCE-filteret som er plassert på rør to. Før filtratet fra rør to gjennom et sterilt 0,45 mikrometer PVDF-filter plassert på et nytt 50 milliliter sentrifugerør merket rør tre.Som beskrevet tidligere, gjenta vaskingen av rør to med en milliliter VB for å legge filtrat til rør tre. I denne representative analysen kan den cytopatiske effekten observeres i Vero-celler ved 36, 48 og 72 timer etter oHSV-infeksjon med avrunding av de berørte cellene. Det økende nivået av CPE over tid er tydelig som visualisert av mCherry-uttrykket.Ved 72 timer etter infeksjon ble virale plakk farget med X-gal for å visualisere oHSVs med lacZ-uttrykk. Forsiktig skrubbing av virusinfiserte celler og forsiktig vasking av bunnen på kolben er avgjørende for å holde all HSV-infisert celle intakt slik at en høy titer viral lager kan oppnås.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

Etablering av Epstein-Barr Virus Vekst-forvandlet lymfoblastoid Cell Lines

Infection of B cells with Epstein-Barr virus (EBV) leads to proliferation and subsequent immortalization, resulting in establishment of lymphoblastoid ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

En primær Neuron Kultur System for studier av herpes simplex virus ventetid og reaktivering

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Affinity Rensing av influensavirus ribonucleoprotein Komplekser fra Chromatin av infiserte celler

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex vivo Infeksjon av murine Epidermis med Herpes simplex virus type 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Nøytrofile Isolering og analyse for å fastslå deres rolle i lymfom Cell Følsomhet for Terapeutiske midler

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

Oppdagelse og fjerning av Nuclease forurensning under rensing av rekombinant Prototype skummende Virus Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

Montering og rensing av Prototype skummende Virus Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Timelige analyse av kjernefysisk-til-cytoplasmatiske translokasjon av et Herpes Simplex Virus 1 Protein av Immunofluorescent AC Confocal mikroskopi

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

Identifikasjon av koding og ikke-koding RNA klasser uttrykt i svin fullblod

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

Generasjon, forsterkning og titrering rekombinant respiratorisk Syncytial virus

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...