Name: growth, purification, and titration of oncolytic herpes simplex virus
Uploaded: 2021-05-13T14:30:00
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A pesquisa no laboratório Saha foi apoiada em parte por fundos do DOD (W81XWH-20-1-0702) e da Fundação Dodge Jones-Abilene. Samuel D. Rabkin e Melissa R.M. Humphrey foram parcialmente apoiados pelo NIH (R01 CA160762).

1) crescimento do OHSV
NOTA: Garantir a aprovação do comitê de biossegurança institucional antes de trabalhar com o OHSV. Este estudo foi realizado sob o Protocolo IBC aprovado nº 18007. Mantenha as precauções BSL2: alvejante todas as tubulações, pontas, tubos e outros materiais que entram em contato com o vírus. Luvas de spray com 70% de álcool isopropílico antes que as mãos deixem o capô de cultura celular BSL2. Lave sempre as mãos com água com sabão depois de trabalhar com um...

<ol>
	<li>Harrington, K., Freeman, D. J., Kelly, B., Harper, J., Soria, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+oncolytic+virotherapy+in+cancer+treatment.">Optimizing oncolytic virotherapy in cancer treatment.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (9), 689-706 (2019).</li><li>Zhang, S., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discovery+and+development+of+oncolytic+viruses:+are+they+the+future+of+cancer+immunotherapy.">The discovery and development of oncolytic viruses: are they the future of cancer immunotherapy.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (4), 391-410 (2021).</li><li>Bommareddy, P. K., Peters, C., Saha, D., Rabkin, S. D., Kaufman, H. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+herpes+simplex+virus+engineering+and+preparation.">Oncolytic herpes simplex virus engineering and preparation.</a> Methods in Molecular Biology. 797, 1-19 (2012).</li><li>Grosche, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+propagation,+titration+and+single-step+growth+curves.">Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves.</a> Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).</li><li>Sutter, S. O., Marconi, P., Meier, A. 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D., Pitha, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+and+posttranscriptional+regulation+of+exogenous+human+beta+interferon+gene+in+simian+cells+defective+in+interferon+synthesis.">Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis.</a> Molecular and Cellular Biology. 6 (6), 2279-2283 (1986).</li><li>Gousseinoz, E., Kools, W., Pattnaik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+impurity+reduction+in+viral+vaccine+manufacturing.">Nucleic acid impurity reduction in viral vaccine manufacturing.</a> BioProcess International. 12 (2), 59-68 (2014).</li><li>Diefenbach, R. J., Fraefel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus:+methods+and+protocols.">Herpes simplex virus: methods and protocols.</a> Methods in Molecular Biology. , (2014).</li><li>Hadi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+trial+to+prepared+&#947;1+34.5+herpes+simplex+virus+1+immunogene+by+cloning+technique.">An experimental trial to prepared &#947;1 34.5 herpes simplex virus 1 immunogene by cloning technique.</a> Systematic Review Pharmacy. 11 (5), 140-149 (2020).</li><li>Kuroda, T., Martuza, R. L., Todo, T., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flip-Flop+HSV-BAC:+bacterial+artificial+chromosome+based+system+for+rapid+generation+of+recombinant+herpes+simplex+virus+vectors+using+two+independent+site-specific+recombinases.">Flip-Flop HSV-BAC: bacterial artificial chromosome based system for rapid generation of recombinant herpes simplex virus vectors using two independent site-specific recombinases.</a> BMC Biotechnology. 6, 40 (2006).</li><li>Motamedifar, M., Noorafshan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytopathic+effect+of+the+herpes+simplex+virus+type+1+appears+stereologically+as+early+as+4+h+after+infection+of+Vero+cells.">Cytopathic effect of the herpes simplex virus type 1 appears stereologically as early as 4 h after infection of Vero cells.</a> Micron. 39 (8), 1331-1334 (2008).</li><li>Blaho, J. A., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus:+propagation,+quantification,+and+storage.">Herpes simplex virus: propagation, quantification, and storage.</a> Current Protocols in Microbiology. , 1 (2005).</li><li>Malenovska, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+stabilizers+and+rates+of+freezing+on+preserving+of+structurally+different+animal+viruses+during+lyophilization+and+subsequent+storage.">The influence of stabilizers and rates of freezing on preserving of structurally different animal viruses during lyophilization and subsequent storage.</a> Journal of Applied Microbiology. 117 (6), 1810-1819 (2014).</li><li>Vahlne, A. G., Blomberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+herpes+simplex+virus.">Purification of herpes simplex virus.</a> Journal of General Virology. 22 (2), 297-302 (1974).</li><li>Sathananthan, B., Rodahl, E., Flatmark, T., Langeland, N., Haarr, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+herpes+simplex+virus+type+1+by+density+gradient+centrifugation+and+estimation+of+the+sedimentation+coefficient+of+the+virion.">Purification of herpes simplex virus type 1 by density gradient centrifugation and estimation of the sedimentation coefficient of the virion.</a> APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 105 (3), 238-246 (1997).</li><li>Mundle, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-purity+preparation+of+HSV-2+vaccine+candidate+ACAM529+is+immunogenic+and+efficacious+in+vivo.">High-purity preparation of HSV-2 vaccine candidate ACAM529 is immunogenic and efficacious in vivo.</a> PLoS One. 8 (2), 57224 (2013).</li><li>Jiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+cobalt+affinity+chromatography+provides+a+novel,+efficient+method+for+herpes+simplex+virus+type+1+gene+vector+purification.">Immobilized cobalt affinity chromatography provides a novel, efficient method for herpes simplex virus type 1 gene vector purification.</a> Journal of Virology. 78 (17), 8994-9006 (2004).</li><li>Grosche, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+propagation,+titration+and+single-step+growth+curves.">Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves.</a> Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).</li><li>Svennerholm, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+herpes+simplex+virus+virions+and+nucleocapsids+on+Percoll+gradients.">Separation of herpes simplex virus virions and nucleocapsids on Percoll gradients.</a> Journal of Virological Methods. 1 (6), 303-309 (1980).</li><li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+concentration+determination+through+plaque+assays:+using+traditional+and+novel+overlay+systems.">Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).</li><li>Miyatake, S., Iyer, A., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+targeting+of+herpes+simplex+virus+for+cell-specific+replication.">Transcriptional targeting of herpes simplex virus for cell-specific replication.</a> Journal of Virology. 71 (7), 5124-5132 (1997).</li><li>Fabiani, M., Limongi, D., Palamara, A. T., De Chiara, G., Marcocci, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+titrate+herpes+simplex+virus-1+(HSV-1)+using+laser-based+scanning+of+near-infrared+fluorophores+conjugated+antibodies.">A novel method to titrate herpes simplex virus-1 (HSV-1) using laser-based scanning of near-infrared fluorophores conjugated antibodies.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1085 (2017).</li></ol>

O protocolo começa com o crescimento do oHSV em células Vero de baixa passagem. A confluência da monocamada celular Vero deve ser ~80% no momento da inoculação do vírus, pois as células supercultivadas podem desenvolver estruturas fibrosas apertadas que podem reduzir a entrada de OHSV nas células Vero20. Uma vez observadas 90-100% CPE, a cultura sobrenante é removida, as células são colhidas, resuspended em VB/supernante (ver passo 1.4.6), congelado por snap e armazenado a -80 °C para ...

Os vírus oncolíticos (OVs) são uma forma emergente e única de imunoterapia contra o câncer. Os OVs replicam-se seletivamente em células tumorais e lises (poupando células normais/saudáveis)1 ao induzir imunidade anti-tumor2. O vírus herpes simplex oncolítico (oHSV) é um dos vírus mais estudados entre todos os OVs. É mais distante na clínica, com Talimogene laherparepvec (T-VEC) sendo o primeiro e único OV a receber aprovação da FDA nos EUA para o tratamento de melanoma avançado3. Além do T-VEC, muitos outros oHSVs geneticamente modificados estão sendo testados pré-clínico e clinicamente em diferentes tipos de câncer3,4,5,6,7,8. A atual biotecnologia avançada de DNA recombinante aumentou ainda mais a viabilidade da engenharia de novos oHSVs codificação para transgenes terapêuticos3,5. Um sistema eficiente de propagação, purificação e determinação de oHSV é fundamental antes que qualquer oHSV (recém-desenvolvido) possa ser testado para estudos in vitro e in vivo. Este artigo descreve um método simples passo-a-passo de crescimento oHSV (em células Vero), purificação (pelo método de gradiente de sacarose) e titulação (por um ensaio de placa oHSV em células Vero)(Figura 1). Pode ser facilmente adotado em qualquer configuração de laboratório de Nível 2 (BSL2) de Biossegurança para obter um estoque viral de alta qualidade para estudos pré-clínicos.
Vero, uma linha de células renais de macaco verde africano, é a linha celular mais usada para propagação oHSV9,10,11,12,13 como as células Vero têm uma via de sinalização antiviral defeituosa14. Outras linhas celulares com estimulador inativado de sinais de genes interferon (STING) também podem ser usadas para o crescimento oHSV12,13. Este protocolo utiliza células Vero para o crescimento e ensaio de placas oHSV. Após a propagação, as células infectadas pelo OHSV são colhidas, lised e submetidas à purificação, onde as células lised são tratadas pela primeira vez com nuclease de benzonase para degradar o DNA das células hospedeiras, prevenir a agregação nucleico ácido-proteína e reduzir a viscosidade do lisato celular. Como a ativação adequada da benzonase muitas vezes requer Mg2+, 1-2 mM MgCl2 é usado neste protocolo15. Os detritos de células hospedeiras do lysato celular tratado com benzonase são ainda mais eliminados pela filtragem serial antes da centrifugação de sáuera-gradiente de alta velocidade. Uma almofada viscosa de solução de sacarose de 25% ajuda a garantir uma taxa mais lenta de migração de vírus através da camada de sacarose, deixando componentes relacionados com células hospedeiras no sobrenante, melhorando assim a purificação e limitando a perda de vírus na pelota16. O oHSV purificado é então titulado em células Vero, e placas virais são visualizadas por giemsa manchando17 ou X-gal staining (para LacZ codificando oHSVs)18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.7 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polypropylene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E8263-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>179693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3007003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-262-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-21-021-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Glucose Dulbecco&#8217;s Phosphate-buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human immune globulin</td>
			<td>Gamastan</td>
			<td>NDC 13533-335-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Sterilization filter, 250 mL</td>
			<td>Nalgene, Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-25E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Sterilization filter, 500 mL</td>
			<td>Nalgene, Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-25C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Red solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N4638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>&#160;15710S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate rocker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>88861043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferricyanide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferrocyanide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 16R Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75004381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 21R Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75002446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 0.45 PVDF</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLHV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 0.8 MCE</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLAA033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, 5 &#181;m PVDF</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLSV025LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T150 culture flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>355001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>MP Biomedicals LLC</td>
			<td>816116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic water bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX-952-116R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-101-RF</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

growth, purification, and titration of oncolytic herpes simplex virus

Os vírus oncolíticos (OVs), como o vírus herpes simplex oncolítico (oHSV), são uma estratégia de tratamento em rápido crescimento no campo da imunoterapia contra o câncer. Os OVs, incluindo oHSV, replicam-se seletivamente e matam células cancerígenas (poupando células saudáveis/normais) ao induzir a imunidade anti-tumor. Devido a essas propriedades únicas, as estratégias de tratamento baseadas em oHSV estão sendo cada vez mais utilizadas para o tratamento do câncer, preclinicamente e clinicamente, incluindo talimogene laherparevec aprovado pela FDA (T-Vec). Crescimento, purificação e titulação são três técnicas essenciais de laboratório para quaisquer OVs, incluindo oHSVs, antes que possam ser utilizados para estudos experimentais. Este artigo descreve um método simples passo a passo para amplificar oHSV em células Vero. À medida que os OHSVs se multiplicam, eles produzem um efeito citopático (CPE) nas células Vero. Uma vez que 90-100% das células infectadas apresentam um CPE, elas são colhidas suavemente, tratadas com cloreto de benzonase e magnésio (TMN2),filtradas e submetidas à purificação usando o método de suênula-gradiente. Após a purificação, o número de oHSV infecciosos (designados como unidades formadoras de placas ou PFUs) é determinado por um "ensaio de placa" em células Vero. O protocolo aqui descrito pode ser usado para preparar estoque de oHSV de alta titulação para estudos in vitro na cultura celular e experimentos in vivo em animais.

Uma breve visão geral de todo o protocolo é retratada na Figura 1, que representa as etapas críticas envolvidas no crescimento, purificação e titulação do oHSV. CPE em células Vero pode ser detectado tão cedo quanto 4 h infecção pós-HSV19. A Figura 2 demonstra cpe em células Vero em três pontos de tempo diferentes após a infecção por OHSV. O nível do CPE é aumentado ao longo do tempo. Neste protocolo, 90-100% CPE é ger...

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Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus

Neste manuscrito, descrevemos um método simples de crescimento, purificação e titulação do vírus herpes simplex oncolítico para uso pré-clínico.

Crescimento, Purificação e Titulação do Vírus Herpes Simplex Oncolítico

Oncolytic viruses (OVs), such as&#160;the&#160;oncolytic herpes simplex virus (oHSV), are a rapidly growing treatment strategy in the field of cancer ...

O vírus herpes simplex oncolítico é uma forma emergente de imunoterapia contra o câncer. Um sistema eficiente de propagação, purificação e determinação titeric do vírus é fundamental para o uso em estudos experimentais. Este método é muito simples e pode ser facilmente adotado em qualquer configuração de laboratório de nível dois de biossegurança para receber um estoque viral de alta qualidade para estudos pré-clínicos.A produção de um estoque viral puro e de alta qualidade é crucial, uma vez que é usada para estudar a resposta imune anticancerígena e desenvolver uma nova forma de imunoterapia contra o câncer baseada em vírus. Este protocolo pode ser usado para purificar qualquer vírus herpes simplex de tipo selvagem ou geneticamente modificado. Este protocolo deve ser fácil de ler e fácil de seguir para um indivíduo que nunca realizou essa técnica antes.Os materiais listados e reagentes devem estar no lugar antes de experimentar esta técnica pela primeira vez. Comece lavando os frascos de centímetros quadrados T-150 com duas vezes alta glicose DPBS suplementada com 1%IFCS. Aspire o DPBS e adicione sete mililitros de inóculo de vírus por frasco.Balance suavemente os frascos por cinco minutos e incubar a 37 graus Celsius por 1,5 a 2 horas. Em seguida, remova o inóculo e adicione 25 mililitros de DMEM suplementados com 1%IFCS a cada frasco. Após a incubação a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por dois a quatro dias, colete 20 mililitros da cultura sobrenasal de cada frasco em tubos de centrífuga de 50 mililitros.Usando um raspador de células, raspe as células do fundo dos frascos. Adicione aproximadamente 15 mililitros da cultura anteriormente coletada sobrenatante a cada frasco para trazer o volume até 20 mililitros, em seguida, use uma pipeta serológica estéril de 10 mililitros para lavar suavemente o fundo dos frascos algumas vezes. Colete as células com médio em tubos de centrífuga cônica de 50 mililitros colocados no gelo.Centrifugar os tubos a 300 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Resuspenda cada pelota completamente em 1,25 mililitros de tampão de vírus, ou VB, e 1,25 mililitros de supernanato de cultura previamente coletado. Misture todas as pelotas resuspended em um tubo de centrífuga cônica de 50 mililitros.Esperte as células resuspended usando gelo seco e 100% etanol e armazene a menos 80 graus Celsius. Descongele as células congeladas anteriormente quebradas em um banho de água quente a 37 graus Celsius e sonicate por um minuto por três ciclos em um banho de água. Adicione 175 unidades de Benzonase Nuclease e dois microliters de dois cloreto de magnésio mililitro por mililitro da célula lysate e vórtice.Depois de uma incubação de 30 minutos e banho de água morna a 37 graus Celsius, coloque o tubo no gelo. Gire a célula lysate a 300 vezes G por 10 minutos. Colete o supernatante em um novo tubo de centrífuga cônica de 50 mililitros e resuspense a pelota celular em 500 microliters de VB. Designe-o como uma pelota.Gire o supernasal coletado novamente a 500 vezes G por 10 minutos e armazene o supernasal separadamente em um tubo de centrífuga cônica fresco de 50 mililitros para usar mais tarde. Resuspend a pelota de célula em 500 microliters de VB, designando-a como pelota dois. Combine a pelota resuspended um e pelota dois em um novo tubo de centrífugo de 1,75 mililitro e vórtice e sonicato duas vezes em um banho de água antes de girar os tubos a 400 vezes G por 10 minutos.Colete o supernasal de tubo de centrífuga de 1,7 mililitro e combine-o com o supernasal previamente coletado tubo de centrífuga cônica de 50 mililitros. Filtre o supernatante através de um filtro de membrana PVDF de cinco micrômetros estéreis em um novo tubo de centrífuga de 50 mililitros chamado tubo um. Adicione um mililitro de VB ao tubo de centrífuga de 50 mililitros, esvaziado após filtrar o supernatante da etapa anterior, vórtice, e passá-lo através do mesmo filtro de membrana PVDF colocado no tubo um.Passe o filtrado do tubo um através de um filtro de membrana MCE de 0,8 micrômetros estéril colocado em um novo tubo de centrífuga de 50 mililitros chamado tubo dois. Adicione um mililitro de VB ao tubo esvaziado, vórtice, e passe-o através do mesmo filtro MCE colocado no tubo dois. Passe o filtrado do tubo dois através de um filtro PVDF de 0,45 micrômetros estéril colocado em um novo tubo de centrífuga de 50 mililitros rotulado tubo três.Como descrito anteriormente, repita a lavagem do tubo dois com um mililitro de VB para adicionar filtrado ao tubo três. Nesta análise representativa, o efeito citopático pôde ser observado nas células Vero aos 36, 48 e 72 horas após a infecção por OHSV com o arredondamento das células afetadas. O nível crescente de CPE ao longo do tempo é evidente como visualizado pela expressão mCherry.Às 72 horas após a infecção, placas virais foram manchadas com X-gal para visualizar oHSVs com expressão lacZ. Esfregar suavemente as células infectadas pelo vírus e lavar suavemente a parte inferior do frasco é fundamental para manter intactas todas as células infectadas pelo HSV para que um alto estoque viral de titer possa ser obtido.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

Estabelecimento de Epstein-Barr Virus Crescimento transformada linhagens de células linfoblastóides

Infection of B cells with Epstein-Barr virus (EBV) leads to proliferation and subsequent immortalization, resulting in establishment of lymphoblastoid ...

Imunologia e Infecção

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Um sistema de cultura primária Neuron para o Estudo da Herpes Simplex Virus latência e reativação

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Purificação por afinidade de Complexos de Influenza Virus ribonucleoproteína da cromatina de células infectadas

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infecção de Murino Epiderme com vírus herpes simplex tipo 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Isolamento de neutrófilos e análise para determinar seu papel na linfoma sensibilidade das células a agentes terapêuticos

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

Deteção e remoção de contaminação de Nuclease durante a purificação do protótipo recombinante vírus espumoso Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

Montagem e purificação do protótipo vírus espumoso Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Análise temporal de translocação Nuclear e citoplasmática de uma Herpes Simplex vírus 1 proteína pela microscopia Confocal imunofluorescência

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

Identificação de codificação e Classes de RNA não-codificante expressa em suínos, sangue total

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

Geração, amplificação e titulação do vírus sincicial respiratórios recombinantes

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...