Name: growth, purification, and titration of oncolytic herpes simplex virus
Uploaded: 2021-05-13T14:30:00
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La investigación en el laboratorio Saha fue apoyada en parte por fondos del DOD (W81XWH-20-1-0702) y la Fundación Dodge Jones-Abilene. Samuel D. Rabkin y Melissa R.M. Humphrey fueron parcialmente apoyados por los NIH (R01 CA160762).

1) crecimiento del oHSV
NOTA: Asegurar la aprobación del comité institucional de bioseguridad antes de trabajar con oHSV. Este estudio se realizó bajo el Protocolo IBC aprobado nº 18007. Mantenga las precauciones de BSL2: blanquee todas las pipetas, puntas, tubos y otros materiales que entren en contacto con el virus. Rocíe guantes con alcohol isopropílico al 70% antes de que las manos salgan de la campana de cultivo celular BSL2. Siempre lávese bien las manos con agua jabonosa después d...

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	<li>Harrington, K., Freeman, D. J., Kelly, B., Harper, J., Soria, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+oncolytic+virotherapy+in+cancer+treatment.">Optimizing oncolytic virotherapy in cancer treatment.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (9), 689-706 (2019).</li><li>Zhang, S., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discovery+and+development+of+oncolytic+viruses:+are+they+the+future+of+cancer+immunotherapy.">The discovery and development of oncolytic viruses: are they the future of cancer immunotherapy.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (4), 391-410 (2021).</li><li>Bommareddy, P. K., Peters, C., Saha, D., Rabkin, S. D., Kaufman, H. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+herpes+simplex+virus+engineering+and+preparation.">Oncolytic herpes simplex virus engineering and preparation.</a> Methods in Molecular Biology. 797, 1-19 (2012).</li><li>Grosche, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+propagation,+titration+and+single-step+growth+curves.">Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves.</a> Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).</li><li>Sutter, S. O., Marconi, P., Meier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+growth,+preparation,+and+assay.">Herpes simplex virus growth, preparation, and assay.</a> Methods in Molecular Biology. 2060, 57-72 (2020).</li><li>Froechlich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrity+of+the+antiviral+STING-mediated+DNA+sensing+in+tumor+cells+is+required+to+sustain+the+immunotherapeutic+efficacy+of+herpes+simplex+oncolytic+virus.">Integrity of the antiviral STING-mediated DNA sensing in tumor cells is required to sustain the immunotherapeutic efficacy of herpes simplex oncolytic virus.</a> Cancers. 12 (11), 3407 (2020).</li><li>Froechlich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+novel+mesothelin-targeted+oncolytic+herpes+virus+and+implemented+strategies+for+manufacturing.">Generation of a novel mesothelin-targeted oncolytic herpes virus and implemented strategies for manufacturing.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 477 (2021).</li><li>Mosca, J. D., Pitha, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+and+posttranscriptional+regulation+of+exogenous+human+beta+interferon+gene+in+simian+cells+defective+in+interferon+synthesis.">Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis.</a> Molecular and Cellular Biology. 6 (6), 2279-2283 (1986).</li><li>Gousseinoz, E., Kools, W., Pattnaik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+impurity+reduction+in+viral+vaccine+manufacturing.">Nucleic acid impurity reduction in viral vaccine manufacturing.</a> BioProcess International. 12 (2), 59-68 (2014).</li><li>Diefenbach, R. J., Fraefel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus:+methods+and+protocols.">Herpes simplex virus: methods and protocols.</a> Methods in Molecular Biology. , (2014).</li><li>Hadi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+trial+to+prepared+&#947;1+34.5+herpes+simplex+virus+1+immunogene+by+cloning+technique.">An experimental trial to prepared &#947;1 34.5 herpes simplex virus 1 immunogene by cloning technique.</a> Systematic Review Pharmacy. 11 (5), 140-149 (2020).</li><li>Kuroda, T., Martuza, R. L., Todo, T., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flip-Flop+HSV-BAC:+bacterial+artificial+chromosome+based+system+for+rapid+generation+of+recombinant+herpes+simplex+virus+vectors+using+two+independent+site-specific+recombinases.">Flip-Flop HSV-BAC: bacterial artificial chromosome based system for rapid generation of recombinant herpes simplex virus vectors using two independent site-specific recombinases.</a> BMC Biotechnology. 6, 40 (2006).</li><li>Motamedifar, M., Noorafshan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytopathic+effect+of+the+herpes+simplex+virus+type+1+appears+stereologically+as+early+as+4+h+after+infection+of+Vero+cells.">Cytopathic effect of the herpes simplex virus type 1 appears stereologically as early as 4 h after infection of Vero cells.</a> Micron. 39 (8), 1331-1334 (2008).</li><li>Blaho, J. A., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus:+propagation,+quantification,+and+storage.">Herpes simplex virus: propagation, quantification, and storage.</a> Current Protocols in Microbiology. , 1 (2005).</li><li>Malenovska, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+stabilizers+and+rates+of+freezing+on+preserving+of+structurally+different+animal+viruses+during+lyophilization+and+subsequent+storage.">The influence of stabilizers and rates of freezing on preserving of structurally different animal viruses during lyophilization and subsequent storage.</a> Journal of Applied Microbiology. 117 (6), 1810-1819 (2014).</li><li>Vahlne, A. G., Blomberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+herpes+simplex+virus.">Purification of herpes simplex virus.</a> Journal of General Virology. 22 (2), 297-302 (1974).</li><li>Sathananthan, B., Rodahl, E., Flatmark, T., Langeland, N., Haarr, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+herpes+simplex+virus+type+1+by+density+gradient+centrifugation+and+estimation+of+the+sedimentation+coefficient+of+the+virion.">Purification of herpes simplex virus type 1 by density gradient centrifugation and estimation of the sedimentation coefficient of the virion.</a> APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 105 (3), 238-246 (1997).</li><li>Mundle, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-purity+preparation+of+HSV-2+vaccine+candidate+ACAM529+is+immunogenic+and+efficacious+in+vivo.">High-purity preparation of HSV-2 vaccine candidate ACAM529 is immunogenic and efficacious in vivo.</a> PLoS One. 8 (2), 57224 (2013).</li><li>Jiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+cobalt+affinity+chromatography+provides+a+novel,+efficient+method+for+herpes+simplex+virus+type+1+gene+vector+purification.">Immobilized cobalt affinity chromatography provides a novel, efficient method for herpes simplex virus type 1 gene vector purification.</a> Journal of Virology. 78 (17), 8994-9006 (2004).</li><li>Grosche, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+propagation,+titration+and+single-step+growth+curves.">Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves.</a> Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).</li><li>Svennerholm, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+herpes+simplex+virus+virions+and+nucleocapsids+on+Percoll+gradients.">Separation of herpes simplex virus virions and nucleocapsids on Percoll gradients.</a> Journal of Virological Methods. 1 (6), 303-309 (1980).</li><li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+concentration+determination+through+plaque+assays:+using+traditional+and+novel+overlay+systems.">Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).</li><li>Miyatake, S., Iyer, A., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+targeting+of+herpes+simplex+virus+for+cell-specific+replication.">Transcriptional targeting of herpes simplex virus for cell-specific replication.</a> Journal of Virology. 71 (7), 5124-5132 (1997).</li><li>Fabiani, M., Limongi, D., Palamara, A. T., De Chiara, G., Marcocci, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+titrate+herpes+simplex+virus-1+(HSV-1)+using+laser-based+scanning+of+near-infrared+fluorophores+conjugated+antibodies.">A novel method to titrate herpes simplex virus-1 (HSV-1) using laser-based scanning of near-infrared fluorophores conjugated antibodies.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1085 (2017).</li></ol>

El protocolo comienza con el crecimiento de oHSV en células Vero de paso bajo. La confluencia de la monocapa celular Vero debe ser de ~80% en el momento de la inoculación del virus, ya que las células cubiertas de vegetación pueden desarrollar estructuras fibrosas apretadas que pueden reducir la entrada de oHSV en las células Vero20. Una vez que se observa un 90-100% de CPE, se elimina el sobrenadante del cultivo, se cosechan las células, se resuspensan en VB/sobrenadante (véase el paso 1.4...

Los virus oncolíticos (OVs) son una forma emergente y única de inmunoterapia contra el cáncer. Los OVs se replican selectivamente en y lisean las células tumorales (ahorrando células normales/sanas)1 mientras se induce la inmunidad antitumoral2. El virus del herpes simple oncolítico (oHSV) es uno de los virus más ampliamente estudiados entre todos los OVs. Está más lejos a lo largo de la clínica, con Talimogene laherparepvec (T-VEC) siendo el primer y único OV en recibir la aprobación de la FDA en los EE.UU. para el tratamiento del melanoma avanzado3. Además de T-VEC, muchos otros oHSVs genéticamente modificados se están probando preclínica y clínicamente en diferentes tipos de cáncer3,4,5,6,7,8. La actual biotecnología avanzada del ADN recombinante ha aumentado aún más la viabilidad de la ingeniería de nuevos oHSV que codifican para transgenes terapéuticos3,5. Un sistema eficiente de propagación, purificación y determinación de títulos de oHSV es crítico antes de que cualquier oHSV (recientemente desarrollado) pueda probarse para estudios in vitro e in vivo. Este papel describe un método simple paso a paso del crecimiento del oHSV (en células de Vero), de la purificación (por el método del sacarosa-gradiente), y de la titulación (por un análisis de la placa del oHSV en células de Vero) (cuadro 1). Se puede adoptar fácilmente en cualquier entorno de laboratorio de nivel 2 de bioseguridad (BSL2) para lograr un stock viral de alta calidad para estudios preclínicos.
Vero, una línea celular de riñón de mono verde africano, es la línea celular más comúnmente utilizada para la propagación del oHSV9,10,11,12,13 ya que las células vero tienen una vía de señalización de interferón antiviral defectuosa14. Otras líneas celulares con estimulador inactivado de genes de interferón (STING) también se pueden utilizar para el crecimiento de oHSV12,13. Este protocolo utiliza las células de Vero para el crecimiento del oHSV y el análisis de la placa. Después de la propagación, las células infectadas por oHSV se cosechan, se lisan y se someten a purificación, en donde las células lisadas primero se tratan con ncleasa benzonasa para degradar el ADN de la célula huésped, prevenir la agregación ácido nucleico-proteína y reducir la viscosidad del lisato celular. Como la activación adecuada de la benzonasa a menudo requiere Mg2 +,1-2 mM MgCl2 se utiliza en este protocolo15. Los restos de la célula huésped del lisato de células tratadas con benzonasa se eliminan aún más mediante filtración en serie antes de la centrifugación de gradiente de sacarosa de alta velocidad. Un cojín viscoso de solución de sacarosa al 25% ayuda a asegurar una tasa más lenta de migración del virus a través de la capa de sacarosa, dejando los componentes relacionados con la célula huésped en el sobrenadante, mejorando así la purificación y limitando la pérdida de virus en el pellet16. El oHSV purificado se titula en las células Vero, y las placas virales se visualizan mediante la tinción de Giemsa17 o X-gal (para la codificación LacZ oHSVs)18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.7 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polypropylene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E8263-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>179693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3007003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-262-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-21-021-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Glucose Dulbecco&#8217;s Phosphate-buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human immune globulin</td>
			<td>Gamastan</td>
			<td>NDC 13533-335-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Sterilization filter, 250 mL</td>
			<td>Nalgene, Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-25E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Sterilization filter, 500 mL</td>
			<td>Nalgene, Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-25C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Red solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N4638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>&#160;15710S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate rocker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>88861043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferricyanide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferrocyanide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 16R Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75004381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 21R Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75002446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 0.45 PVDF</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLHV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 0.8 MCE</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLAA033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, 5 &#181;m PVDF</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLSV025LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T150 culture flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>355001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>MP Biomedicals LLC</td>
			<td>816116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic water bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX-952-116R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-101-RF</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

growth, purification, and titration of oncolytic herpes simplex virus

Los virus oncolíticos (OVs), tales como el virus oncolítico del simplex de herpes (oHSV), son una estrategia de tratamiento de rápido crecimiento en el campo de la inmunoterapia del cáncer. Los OVs, incluyendo oHSV, replican selectivamente adentro y matan a las células cancerosas (ahorrando las células sanas/normales) mientras que inducen inmunidad antitumores. Debido a estas propiedades únicas, las estrategias oHSV-basadas del tratamiento se están utilizando cada vez más para el tratamiento del cáncer, preclínico y clínico, incluyendo el laherparevec del talimogene aprobado por la FDA (T-Vec). El crecimiento, la purificación y la titulación son tres técnicas de laboratorio esenciales para cualquier OVs, incluyendo oHSVs, antes de que puedan ser utilizados para estudios experimentales. Este papel describe un método paso a paso simple para amplificar el oHSV en células de Vero. A medida que los oHSV se multiplican, producen un efecto citopático (CPE) en las células Vero. Una vez que el 90-100% de las células infectadas muestran un CPE, se cosechan suavemente, se tratan con benzonasa y cloruro de magnesio (MgCl2),se filtran y se someten a purificación utilizando el método de gradiente de sacarosa. Después de la purificación, el número de oHSV infeccioso (designado como unidades formadores de placa o PKU) se determina mediante un "ensayo de placa" en las células Vero. El protocolo descrito aquí se puede utilizar para preparar la acción del oHSV del alto-título para los estudios ines vitro en cultivo celular y experimentos animales in vivo.

Una breve descripción de todo el protocolo se representa en la Figura 1,que representa los pasos críticos involucrados en el crecimiento, purificación y titulación del oHSV. CPE en las células de Vero se puede detectar tan pronto como 4 h post-infección por el VHS19. La Figura 2 muestra el CPE en células Vero en tres puntos de tiempo diferentes después de la infección por oHSV. El nivel del CPE se aumenta en un plazo. En este pro...

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Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus

En este manuscrito, describimos un método simple de crecimiento, de purificación, y de titulación del virus oncolítico del simplex de herpes para el uso preclínico.

Crecimiento, Purificación, Y La Titulación Del Virus Del Herpes Simple Oncolítico

Oncolytic viruses (OVs), such as&#160;the&#160;oncolytic herpes simplex virus (oHSV), are a rapidly growing treatment strategy in the field of cancer ...

El virus oncolítico del herpes simple es una forma emergente de inmunoterapia contra el cáncer. Un sistema eficiente de propagación de virus, purificación y determinación titérica es fundamental para su uso en estudios experimentales. Este método es muy simple y se puede adoptar fácilmente en cualquier entorno de laboratorio de nivel dos de bioseguridad para recibir un stock viral de alta calidad para estudios preclínicos.La producción de un stock viral puro y de alta calidad es crucial, ya que se utiliza para estudiar la respuesta inmune contra el cáncer y para desarrollar una nueva forma de inmunoterapia contra el cáncer basada en virus. Este protocolo se puede utilizar para purificar cualquier virus de herpes simple de tipo salvaje o genéticamente modificado. Este protocolo debe ser fácil de leer y fácil de seguir para un individuo que nunca ha realizado esta técnica antes.Los materiales y reactivos enumerados deben estar en su lugar antes de probar esta técnica por primera vez. Comience lavando los frascos de T-150 centímetros cuadrados con dpbs de glucosa dos veces alta complementado con 1% IFCS. Aspirar el DPBS y añadir siete mililitros de inóculo del virus por matraz.Mezcle suavemente los frascos durante cinco minutos e incube a 37 grados centígrados durante 1,5 a 2 horas. A continuación, retiramos el inóculo y añadimos 25 mililitros de DMEM suplementados con 1%IFCS a cada matraz. Después de la incubación a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante dos a cuatro días, recoger 20 mililitros del sobrenadante de cultivo de cada matraz en tubos de centrífuga de 50 mililitros.Usando un raspador de células, raspe las celdas de la parte inferior de los frascos. Agregue aproximadamente 15 mililitros del sobrenadante de cultivo previamente recogido a cada matraz para llevar el volumen hasta 20 mililitros, luego use una pipeta serológica estéril de 10 mililitros para lavar suavemente el fondo de los frascos unas cuantas veces. Recoger las células con el medio en 50 mililitros tubos de centrífuga cónica colocados en el hielo.Centrifugar los tubos a 300 veces G durante 10 minutos a cuatro grados Centígrados. Resuspend cada pelotilla a fondo en 1.25 mililitros del almacenador intermediario del virus, o VB, y 1.25 mililitros del sobrenadante previamente recogido de la cultura. Mezcle todos los pellets resuspended en un tubo de centrífuga cónica de 50 mililitros.Congele las células resuspended usando hielo seco y etanol al 100% y guárdelo a menos 80 grados Centígrados. Descongelar las células congeladas previamente rompidas en un baño de agua caliente a 37 grados Centígrados y sonicar durante un minuto durante tres ciclos en un baño de agua. Añadir 175 unidades de Benzonasa Nucleasa y dos microlitros de dos milimolares cloruro de magnesio por mililitro del lisato celular y vórtice.Después de una incubación de 30 minutos y baño de agua tibia a 37 grados centígrados, coloque el tubo sobre hielo. Gire el lysate de la célula en 300 veces G durante 10 minutos. Recoger el sobrenadante en un nuevo tubo de centrífuga cónica de 50 mililitros y resuspend el pellet celular en 500 microlitros de VB. Designarlo como pellet uno.Gire el sobrenadante recogido de nuevo a 500 veces G durante 10 minutos y guarde el sobrenadante por separado en un tubo de centrífuga cónico fresco de 50 mililitros para usarlo más tarde. Resuspend el pellet celular en 500 microlitros de VB, designándolo como pellet dos. Combine el pellet resuspended uno y el pellet dos en un nuevo tubo de centrífuga de 1.75 mililitros y vórtice y sonice dos veces en un baño de agua antes de girar los tubos a 400 veces G durante 10 minutos.Recoja el sobrenadante del tubo centrífugo de 1,7 mililitros y combínalo con el sobrenadante previamente recogido tubo de centrífuga cónica de 50 mililitros. Filtre el sobrenadante a través de un filtro estéril de membrana PVDF de cinco micrómetros en un nuevo tubo centrífuga de 50 mililitros llamado tubo uno. Agregue un mililitro de VB al tubo centrífugo de 50 mililitros, vaciado después de filtrar el sobrenadante del paso anterior, vórtice, y pásalo a través del mismo filtro de membrana PVDF colocado en el tubo uno.Pase el filtrado del tubo uno a través de un filtro de membrana MCE estéril de 0,8 micrómetros colocado en un nuevo tubo centrífuga de 50 mililitros llamado tubo dos. Agregue un mililitro de VB al tubo vaciado uno, vórtice, y páse a través del mismo filtro MCE colocado en el tubo dos. Pase el filtrado del tubo dos a través de un filtro PVDF estéril de 0,45 micrómetros colocado en un nuevo tubo centrífuga de 50 mililitros etiquetado como tubo tres.Como se describió anteriormente, repita el lavado del tubo dos con un mililitro de VB para agregar filtrado al tubo tres. En este análisis representativo, el efecto citopático se podía observar en las células de Vero en 36, 48, y 72 horas de infección del oHSV del poste con el redondeo de las células afectadas. El nivel cada vez mayor de CPE en un cierto plazo es evidente según lo visualizado por la expresión de mCherry.En 72 horas de infección del poste, las placas virales fueron manchadas con X-gal para visualizar oHSVs con la expresión del lacZ. Limpiar suavemente las células infectadas por el virus y lavar suavemente la parte inferior del matraz es fundamental para mantener intacta todas las células infectadas por el VHS para que se pueda obtener un stock viral de alto título.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

Establecimiento de Epstein-Barr transformado al crecimiento líneas celulares linfoblastoides

Infection of B cells with Epstein-Barr virus (EBV) leads to proliferation and subsequent immortalization, resulting in establishment of lymphoblastoid ...

Investigación

Inmunología e Infección

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Un sistema de neuronas cultivo primario para el estudio de la latencia del virus del herpes simple y Reactivación

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Purificación por afinidad de los complejos de ribonucleoproteína Influenza Virus de la cromatina de las células infectadas

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infección de murino Epidermis con virus herpes simplex tipo 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Aislamiento de neutrófilos y análisis para determinar su papel en el linfoma de células sensibles a los agentes terapéuticos

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

Detección y eliminación de nucleasa contaminación durante la purificación de prototipo recombinante Virus Espumoso integrasa

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

Asamblea y purificación del prototipo Virus espumoso de los Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Análisis temporal de la translocación Nuclear-a-citoplásmico de una proteína del Virus 1 del Herpes simple por inmunofluorescencia microscopia Confocal

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

Identificación de la codificación y las clases de ARN no codificante expresado en cerdos sangre entera

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

Generación, amplificación y titulación de virus sincitiales respiratorios recombinantes

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...