Name: growth, purification, and titration of oncolytic herpes simplex virus
Uploaded: 2021-05-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus at JoVE.com

Forskningen i Saha-labbet stöddes delvis av medel från DOD (W81XWH-20-1-0702) och Dodge Jones Foundation-Abilene. Samuel D. Rabkin och Melissa R.M. Humphrey stöddes delvis av NIH (R01 CA160762).

1) oHSV-tillväxt
OBS: Säkerställ godkännande av institutionella biosäkerhetskommittéer innan du arbetar med oHSV. Denna studie utfördes enligt godkänt IBC-protokoll nr 18007. Underhåll BSL2 försiktighetsåtgärder: bleka alla rör, spetsar, rör och andra material som kommer i kontakt med viruset. Sprayhandskar med 70% isopropylalkohol innan händerna lämnar BSL2 cellkulturhuven. Tvätta alltid händerna noggrant med tvålvatten efter att ha arbetat med ett virus.
<ol><li>På dag ...

<ol>
	<li>Harrington, K., Freeman, D. J., Kelly, B., Harper, J., Soria, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+oncolytic+virotherapy+in+cancer+treatment.">Optimizing oncolytic virotherapy in cancer treatment.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (9), 689-706 (2019).</li><li>Zhang, S., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discovery+and+development+of+oncolytic+viruses:+are+they+the+future+of+cancer+immunotherapy.">The discovery and development of oncolytic viruses: are they the future of cancer immunotherapy.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (4), 391-410 (2021).</li><li>Bommareddy, P. K., Peters, C., Saha, D., Rabkin, S. D., Kaufman, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+herpes+simplex+viruses+as+a+paradigm+for+the+treatment+of+cancer.">Oncolytic herpes simplex viruses as a paradigm for the treatment of cancer.</a> Annual Review of Cancer Biology. 2 (1), 155-173 (2018).</li><li>Peters, C., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+herpes+viruses+as+oncolytics.">Designing herpes viruses as oncolytics.</a> Molecular Therapy-Oncolytics. 2, 15010 (2015).</li><li>Nguyen, H. -. M., Saha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+current+state+of+oncolytic+herpes+simplex+virus+for+glioblastoma+treatment.">The current state of oncolytic herpes simplex virus for glioblastoma treatment.</a> Oncolytic Virotherapy. 10, 1-27 (2021).</li><li>Koch, M. S., Lawler, S. E., Chiocca, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSV-1+oncolytic+viruses+from+bench+to+bedside:+an+overview+of+current+clinical+trials.">HSV-1 oncolytic viruses from bench to bedside: an overview of current clinical trials.</a> Cancers. 12 (12), 3514 (2020).</li><li>Menotti, L., Avitabile, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+oncolytic+immunovirotherapy:+the+blossoming+branch+of+multimodal+therapy.">Herpes simplex virus oncolytic immunovirotherapy: the blossoming branch of multimodal therapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8310 (2020).</li><li>Nguyen, H. M., Guz-Montgomery, K., Saha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+virus+encoding+a+master+pro-inflammatory+cytokine+interleukin+12+in+cancer+immunotherapy.">Oncolytic virus encoding a master pro-inflammatory cytokine interleukin 12 in cancer immunotherapy.</a> Cells. 9 (2), 400 (2020).</li><li>Agarwalla, P. K., Aghi, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+herpes+simplex+virus+engineering+and+preparation.">Oncolytic herpes simplex virus engineering and preparation.</a> Methods in Molecular Biology. 797, 1-19 (2012).</li><li>Grosche, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+propagation,+titration+and+single-step+growth+curves.">Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves.</a> Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).</li><li>Sutter, S. O., Marconi, P., Meier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+growth,+preparation,+and+assay.">Herpes simplex virus growth, preparation, and assay.</a> Methods in Molecular Biology. 2060, 57-72 (2020).</li><li>Froechlich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrity+of+the+antiviral+STING-mediated+DNA+sensing+in+tumor+cells+is+required+to+sustain+the+immunotherapeutic+efficacy+of+herpes+simplex+oncolytic+virus.">Integrity of the antiviral STING-mediated DNA sensing in tumor cells is required to sustain the immunotherapeutic efficacy of herpes simplex oncolytic virus.</a> Cancers. 12 (11), 3407 (2020).</li><li>Froechlich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+novel+mesothelin-targeted+oncolytic+herpes+virus+and+implemented+strategies+for+manufacturing.">Generation of a novel mesothelin-targeted oncolytic herpes virus and implemented strategies for manufacturing.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 477 (2021).</li><li>Mosca, J. D., Pitha, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+and+posttranscriptional+regulation+of+exogenous+human+beta+interferon+gene+in+simian+cells+defective+in+interferon+synthesis.">Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis.</a> Molecular and Cellular Biology. 6 (6), 2279-2283 (1986).</li><li>Gousseinoz, E., Kools, W., Pattnaik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+impurity+reduction+in+viral+vaccine+manufacturing.">Nucleic acid impurity reduction in viral vaccine manufacturing.</a> BioProcess International. 12 (2), 59-68 (2014).</li><li>Diefenbach, R. J., Fraefel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus:+methods+and+protocols.">Herpes simplex virus: methods and protocols.</a> Methods in Molecular Biology. , (2014).</li><li>Hadi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+trial+to+prepared+&#947;1+34.5+herpes+simplex+virus+1+immunogene+by+cloning+technique.">An experimental trial to prepared &#947;1 34.5 herpes simplex virus 1 immunogene by cloning technique.</a> Systematic Review Pharmacy. 11 (5), 140-149 (2020).</li><li>Kuroda, T., Martuza, R. L., Todo, T., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flip-Flop+HSV-BAC:+bacterial+artificial+chromosome+based+system+for+rapid+generation+of+recombinant+herpes+simplex+virus+vectors+using+two+independent+site-specific+recombinases.">Flip-Flop HSV-BAC: bacterial artificial chromosome based system for rapid generation of recombinant herpes simplex virus vectors using two independent site-specific recombinases.</a> BMC Biotechnology. 6, 40 (2006).</li><li>Motamedifar, M., Noorafshan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytopathic+effect+of+the+herpes+simplex+virus+type+1+appears+stereologically+as+early+as+4+h+after+infection+of+Vero+cells.">Cytopathic effect of the herpes simplex virus type 1 appears stereologically as early as 4 h after infection of Vero cells.</a> Micron. 39 (8), 1331-1334 (2008).</li><li>Blaho, J. A., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus:+propagation,+quantification,+and+storage.">Herpes simplex virus: propagation, quantification, and storage.</a> Current Protocols in Microbiology. , 1 (2005).</li><li>Malenovska, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+stabilizers+and+rates+of+freezing+on+preserving+of+structurally+different+animal+viruses+during+lyophilization+and+subsequent+storage.">The influence of stabilizers and rates of freezing on preserving of structurally different animal viruses during lyophilization and subsequent storage.</a> Journal of Applied Microbiology. 117 (6), 1810-1819 (2014).</li><li>Vahlne, A. G., Blomberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+herpes+simplex+virus.">Purification of herpes simplex virus.</a> Journal of General Virology. 22 (2), 297-302 (1974).</li><li>Sathananthan, B., Rodahl, E., Flatmark, T., Langeland, N., Haarr, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+herpes+simplex+virus+type+1+by+density+gradient+centrifugation+and+estimation+of+the+sedimentation+coefficient+of+the+virion.">Purification of herpes simplex virus type 1 by density gradient centrifugation and estimation of the sedimentation coefficient of the virion.</a> APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 105 (3), 238-246 (1997).</li><li>Mundle, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-purity+preparation+of+HSV-2+vaccine+candidate+ACAM529+is+immunogenic+and+efficacious+in+vivo.">High-purity preparation of HSV-2 vaccine candidate ACAM529 is immunogenic and efficacious in vivo.</a> PLoS One. 8 (2), 57224 (2013).</li><li>Jiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+cobalt+affinity+chromatography+provides+a+novel,+efficient+method+for+herpes+simplex+virus+type+1+gene+vector+purification.">Immobilized cobalt affinity chromatography provides a novel, efficient method for herpes simplex virus type 1 gene vector purification.</a> Journal of Virology. 78 (17), 8994-9006 (2004).</li><li>Grosche, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+propagation,+titration+and+single-step+growth+curves.">Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves.</a> Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).</li><li>Svennerholm, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+herpes+simplex+virus+virions+and+nucleocapsids+on+Percoll+gradients.">Separation of herpes simplex virus virions and nucleocapsids on Percoll gradients.</a> Journal of Virological Methods. 1 (6), 303-309 (1980).</li><li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+concentration+determination+through+plaque+assays:+using+traditional+and+novel+overlay+systems.">Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).</li><li>Miyatake, S., Iyer, A., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+targeting+of+herpes+simplex+virus+for+cell-specific+replication.">Transcriptional targeting of herpes simplex virus for cell-specific replication.</a> Journal of Virology. 71 (7), 5124-5132 (1997).</li><li>Fabiani, M., Limongi, D., Palamara, A. T., De Chiara, G., Marcocci, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+titrate+herpes+simplex+virus-1+(HSV-1)+using+laser-based+scanning+of+near-infrared+fluorophores+conjugated+antibodies.">A novel method to titrate herpes simplex virus-1 (HSV-1) using laser-based scanning of near-infrared fluorophores conjugated antibodies.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1085 (2017).</li></ol>

Protokollet börjar med tillväxten av oHSV i veroceller med låg passage. Vero-cellmonoskiktens beredskap bör vara ~ 80% vid tidpunkten för virusinympning eftersom övervuxna celler kan utveckla snäva fibrösa strukturer som kan minska oHSV-inträde i Vero-celler20. När 90-100% CPE observeras avlägsnas kulturens supernatant, celler skördas, återanvänds i VB/supernatant (se steg 1.4.6), fästfryses och lagras vid -80 °C för senare rening. Blaho och kollegor använde en något annorlunda ...

Onkolytiska virus (OVs) är en framväxande och unik form av cancer immunterapi. OVs replikerar selektivt i och lyse tumörceller (skonar normala / friska celler)1 medan inducera anti-tumör immunitet2. Onkolytiskt herpes simplexvirus (oHSV) är ett av de mest studerade virusen bland alla OVs. Det är längst fram på kliniken, med Talimogene laherparepvec (T-VEC) som den första och enda OV som får FDA-godkännande i USA för behandling av avancerat melanom3. Förutom T-VEC testas många andra genetiskt konstruerade oHSVs prekliniskt och kliniskt i olika cancertyper3,4,5,6,7,8. Den nuvarande avancerade rekombinanta DNA-biotekniken har ytterligare ökat genomförbarheten av att konstruera nya oHSVs-kodning för terapeutiska transgener3,5. Ett effektivt system för oHSV-förökning, rening och titerbestämning är avgörande innan någon (nyutvecklad) oHSV kan testas för in vitro- och in vivo-studier. Detta dokument beskriver en enkel steg-för-steg-metod för oHSV-tillväxt (i Vero-celler), rening (med sackarosgradientmetoden) och titrering (med en oHSV-plackanalys i Vero-celler) (figur 1). Det kan enkelt antas i alla Biosafety Level 2 (BSL2) laboratorieinställning för att uppnå ett högkvalitativt viruslager för prekliniska studier.
Vero, en afrikansk grön apa njure cellinje, är den vanligaste cellinjen för oHSV förökning9,10,11,12,13 som Vero celler har en defekt antivirala interferon signalering väg14. Andra cellinjer med inaktiverad stimulator av interferongener (STING) signalering kan också användas för oHSV tillväxt12,13. Detta protokoll använder Vero celler för oHSV tillväxt och plack analys. Efter förökning skördas, lysas och utsätts oHSV-infekterade celler för rening, där lysade celler först behandlas med benzonaskärna för att bryta ner värdcellens DNA, förhindra nukleinsyraproteinaggregering och minska celllystikens viskositet. Eftersom korrekt aktivering av benzonas ofta kräver Mg2 +, används 1-2 mM MgCl2 i detta protokoll15. Värdcellsskräp från benzonasbehandlade celllyat elimineras ytterligare genom seriell filtrering före höghastighets sackarosgradientcentrifugation. En trögflytande 25% sackaroslösningskudde hjälper till att säkerställa en långsammare virusmigration genom sackarosskiktet, vilket lämnar värdcellsrelaterade komponenter i supernaten, vilket förbättrar reningen och begränsar virusförlusten i pelleten16. Den renade oHSV titreras sedan på Vero-celler, och virala plack visualiseras av Giemsafärgning 17 eller X-gal färgning (för LacZ kodning oHSVs)18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.7 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polypropylene tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E8263-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>179693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3007003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-262-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-21-021-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Glucose Dulbecco&#8217;s Phosphate-buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human immune globulin</td>
			<td>Gamastan</td>
			<td>NDC 13533-335-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Sterilization filter, 250 mL</td>
			<td>Nalgene, Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-25E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Sterilization filter, 500 mL</td>
			<td>Nalgene, Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-25C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Red solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N4638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>&#160;15710S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate rocker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>88861043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferricyanide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferrocyanide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 16R Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75004381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 21R Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75002446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 0.45 PVDF</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLHV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 0.8 MCE</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLAA033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, 5 &#181;m PVDF</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLSV025LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T150 culture flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>355001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>MP Biomedicals LLC</td>
			<td>816116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic water bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX-952-116R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-101-RF</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

growth, purification, and titration of oncolytic herpes simplex virus

Onkolytiska virus (OVs), såsom onkolytiska herpes simplex virus (oHSV), är en snabbt växande behandlingsstrategi inom området cancer immunterapi. OVs, inklusive oHSV, replikerar selektivt i och dödar cancerceller (skonar friska /normala celler) samtidigt som de inducerar antitumörimmunitet. På grund av dessa unika egenskaper används oHSV-baserade behandlingsstrategier alltmer för behandling av cancer, prekliniskt och kliniskt, inklusive FDA-godkänd talimogene laherparevec (T-Vec). Tillväxt, rening och titrering är tre viktiga laboratorietekniker för alla OVs, inklusive oHSVs, innan de kan användas för experimentella studier. Detta dokument beskriver en enkel steg-för-steg metod för att förstärka oHSV i Vero celler. När oHSVs multipliceras producerar de en cytopatisk effekt (CPE) i Vero-celler. När 90-100% av de infekterade cellerna visar en CPE skördas de försiktigt, behandlas med benzonas och magnesiumklorid (MgCl2),filtreras och utsätts för rening med hjälp av sackarosgradientmetoden. Efter rening bestäms antalet infektiösa oHSV (betecknade som plackbildande enheter eller PFC) av en "plackanalys" i Vero-celler. Protokollet som beskrivs häri kan användas för att förbereda hög titer oHSV-bestånd för in vitro-studier i cellkultur och in vivo-djurförsök.

En kort översikt över hela protokollet visas i figur 1, som representerar de kritiska stegen som är involverade i tillväxt, rening och titrering av oHSV. CPE i Vero celler kan detekteras så tidigt som 4 h post-HSV infektion19. Figur 2 visar CPE i Vero celler vid tre olika tidpunkter efter oHSV infektion. CPE-nivån höjs med tiden. I detta protokoll observeras vanligtvis 90-100% CPE inom 48 h av lågMOI oHSV-inokulering (vilket är d...

Watch this Scientific Journal Video about Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus at JoVE.com

Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus

I detta manuskript beskriver vi en enkel metod för tillväxt, rening och titrering av onkolytiska herpes simplex virus för preklinisk användning.

Tillväxt, rening och titrering av onkolytisk herpes simplex virus

Oncolytic viruses (OVs), such as&#160;the&#160;oncolytic herpes simplex virus (oHSV), are a rapidly growing treatment strategy in the field of cancer ...

Onkolytisk herpes simplex virus är en framväxande form av cancer immunterapi. Ett effektivt system för virusförökning, rening och titerisk bestämning är avgörande för användningen i experimentella studier. Denna metod är mycket enkel och kan enkelt antas i alla biosäkerhetsnivå två laboratorieinställning för att få ett högkvalitativt viruslager för prekliniska studier.Produktion av ett högkvalitativt, rent viruslager är avgörande eftersom det används för att studera immunsvar mot cancer och för att utveckla en ny form av virusbaserad cancerimmunterapi. Detta protokoll kan användas för att rena alla vilda eller genetiskt konstruerade herpes simplex virus. Detta protokoll ska vara lättläst och lätt att följa för en individ som aldrig har utfört denna teknik tidigare.De listade materialen och reagenserna bör vara på plats innan du provar denna teknik för första gången. Börja med att tvätta T-150 kvadratcentimeterkolvarna med två gånger hög glukos DPBS kompletterad med 1%IFCS. Aspirera DPBS och tillsätt sju milliliter virusinokulat per kolv.Vagga försiktigt flaskorna i fem minuter och inkubera vid 37 grader Celsius i 1,5 till 2 timmar. Ta sedan bort inokulatet och tillsätt 25 milliliter DMEM kompletterat med 1%IFCS till varje kolv. Efter inkubation vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid i två till fyra dagar, samla 20 milliliter av kulturens supernatant från varje kolv i 50 milliliter centrifugerör.Skrapa cellerna från kolvernas botten med hjälp av en cellskrapa. Tillsätt cirka 15 milliliter av den tidigare insamlade odlingssprickan till varje kolv för att få volymen upp till 20 milliliter och använd sedan en steril serologisk pipett på 10 milliliter för att försiktigt tvätta kolvernas botten några gånger. Samla cellerna med medium i 50 milliliter koniska centrifugeringsrör placerade på is.Centrifugera rören vid 300 gånger G i 10 minuter vid fyra grader Celsius. Återanvänd varje pellet noggrant i 1,25 milliliter virusbuffert, eller VB, och 1,25 milliliter tidigare insamlad odlingsövernatant. Blanda alla återanvända pellets i ett koniskt centrifugerrör på 50 milliliter.Snap frys de återanvända cellerna med torr is och 100% etanol och lagra på minus 80 grader Celsius. Tina de tidigare knäppta frusna cellerna i ett varmt vattenbad vid 37 grader Celsius och ultraljudssyra i en minut i tre cykler i ett vattenbad. Tillsätt 175 enheter Benzonase Nuclease och två mikroliter av två millimolär magnesiumklorid per milliliter av celllysat och virvel.Efter en inkubation på 30 minuter och varmt vattenbad vid 37 grader Celsius, placera röret på is. Snurra celllyset vid 300 gånger G i 10 minuter. Samla supernatanten i ett nytt koniskt centrifugerör på 50 milliliter och sätt tillbaka cellpelleten i 500 mikroliter VB. Besn att det är pellets ett.Snurra den insamlade supernaten igen vid 500 gånger G i 10 minuter och förvara supernaten separat i ett friskt 50 milliliter koniskt centrifugerrör som ska användas senare. Återanvänd cellpelleten i 500 mikroliter VB och beskriv den som pellet två. Kombinera den återanvända pelletsen ett och pellets två i ett nytt 1,75 milliliter centrifugerör och virvel och sonicate två gånger i ett vattenbad innan du snurrar rören vid 400 gånger G i 10 minuter.Samla supernatanten från 1,7 milliliter centrifugerör och kombinera det med supernaten som tidigare samlats in 50 milliliter koniskt centrifugerrör. Filtrera supernatanten genom ett sterilt PVDF-membranfilter på fem mikrometer till ett nytt 50 milliliter centrifugerör som kallas rör ett. Tillsätt en milliliter VB till centrifugröret på 50 milliliter, tömt efter filtrering av supernaten från föregående steg, virvel, och för det genom samma PVDF-membranfilter som placerats på rör ett.Skicka filtratet från rör ett genom ett sterilt MCE-membranfilter på 0,8 mikrometer placerat på ett nytt 50 milliliter centrifugerör som kallas rör två. Tillsätt en milliliter VB till det tömda röret ett, virvel, och skicka det genom samma MCE-filter som placeras på rör två. För filtratet från rör två genom ett sterilt PVDF-filter på 0,45 mikrometer placerat på ett nytt 50 milliliter centrifugerör märkt rör tre.Som beskrivits tidigare, upprepa tvättningen av rör två med en milliliter VB för att lägga till filtrate till rör tre. I denna representativa analys kunde cytopatisk effekt observeras i Vero celler vid 36, 48 och 72 timmar efter oHSV infektion med avrundning av de drabbade cellerna. Den ökande nivån av CPE över tid är uppenbart som visualiseras av mCherry uttryck.Vid 72 timmar efter infektion, virala plack var färgas med X-gal att visualisera oHSVs med lacZ uttryck. Att försiktigt skrubba bort virusinfekterade celler och försiktigt tvätta botten på kolven är avgörande för att hålla alla HSV-infekterade celler intakta så att ett viruslager med hög titer kan erhållas.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

Upprättande av Epstein-Barr virus Tillväxt-transformerade lymfoblastoida cell-linjer

Infection of B cells with Epstein-Barr virus (EBV) leads to proliferation and subsequent immortalization, resulting in establishment of lymphoblastoid ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

En primär Neuron odlingssystem för studier av Herpes simplex virus latens och återaktivering

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Affinitetsrening av ribonukleoprotein influensavirus komplex från kromatinet hos infekterade celler

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex vivo Infektion av Murine Epidermis med herpes simplex virus typ 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering och analys för att fastställa deras roll i lymfom Cell Känslighet för terapeutiska medel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

Upptäckt och borttagning Nuclease kontamination vid rening av rekombinant prototyp skummande Virus integras

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

Montering och rening av prototyp skummande Virus Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Temporal analys av det kärn-till-Cytoplasmatisk translokationen av en Herpes Simplex Virus 1 Protein av Immunofluorescerande konfokalmikroskopi

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

Identifiering av kodning och icke-kodande RNA klasser uttryckta i svin helblod

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

Generation, amplifiering och titrering av rekombinant respiratoriska Syncytial virus

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...