Name: polysome profiling without gradient makers or fractionation systems
Uploaded: 2021-06-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems at JoVE.com

Forfatterne takker Dr. Percy Tumbale og Dr. Melissa Wells for deres kritiske læsning af dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af US National Institute of Health Intramural Research Program; US National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS; ZIA ES103247 til R.E.S).

1. Fremstilling af 7% - 47% saccharosegradienter
BEMÆRK: Det lineære område af saccharosegradienten kan ændres for at opnå bedre adskillelse afhængigt af den anvendte celletype. Denne protokol er optimeret til polysomprofiler til S. cerevisiae.
<ol><li>Stamopløsninger af 7% og 47% saccharose i saccharosegradientbuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2 og 1 mM DTT). Steriliserer saccharosestamopløsningerne filtreres gennem et filter på 0,22 μm, og de...

<ol>
	<li>Choi, A., Barrientos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sucrose+gradient+sedimentation+analysis+of+mitochondrial+ribosomes.">Sucrose gradient sedimentation analysis of mitochondrial ribosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 2192, 211-226 (2021).</li><li>Dos Santos, R. F., Barria, C., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+analysis+of+bacterial+ribosomes+through+sucrose+gradient+ultracentrifugation.">Isolation and analysis of bacterial ribosomes through sucrose gradient ultracentrifugation.</a> Methods in Molecular Biology. 2106, 299-310 (2020).</li><li>Pringle, E. S., McCormick, C., Cheng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+profiling+analysis+of+mRNA+and+associated+proteins+engaged+in+translation.">Polysome profiling analysis of mRNA and associated proteins engaged in translation.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 125 (1), 79 (2019).</li><li>Liang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome-profiling+in+small+tissue+samples.">Polysome-profiling in small tissue samples.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 3 (2018).</li><li>Karamysheva, Z. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+profiling+in+leishmania,+human+cells+and+mouse+testis.">Polysome profiling in leishmania, human cells and mouse testis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e57600 (2018).</li><li>Jin, H. Y., Xiao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Integrated+polysome+profiling+and+ribosome+profiling+method+to+investigate+in+vivo+translatome.">An Integrated polysome profiling and ribosome profiling method to investigate in vivo translatome.</a> Methods in Molecular Biology. 1712, 1-18 (2018).</li><li>Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+translation+using+polysome+profiling.">Analysis of translation using polysome profiling.</a> Nucleic Acids Research. 45 (3), 15 (2017).</li><li>Aboulhouda, S., Di Santo, R., Therizols, G., Weinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate,+streamlined+analysis+of+mrna+translation+by+sucrose+gradient+fractionation.">Accurate, streamlined analysis of mrna translation by sucrose gradient fractionation.</a> Bio-protocol. 7 (19), 2573 (2017).</li><li>Kudla, M., Karginov, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mRNA+translation+by+polysome+profiling.">Measuring mRNA translation by polysome profiling.</a> Methods in Molecular Biology. 1421, 127-135 (2016).</li><li>Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+selective+mRNA+translation+in+mammalian+cells+by+polysome+profiling.">Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e52295 (2014).</li><li>Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+translation+initiation+during+stress+conditions+by+polysome+profiling.">Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51164 (2014).</li><li>Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+fractionation+to+analyze+mRNA+distribution+profiles.">Polysome fractionation to analyze mRNA distribution profiles.</a> Bio-protocol. 7 (3), 2126 (2017).</li><li>Chikashige, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gcn2+eIF2alpha+kinase+mediates+combinatorial+translational+regulation+through+nucleotide+motifs+and+uORFs+in+target+mRNAs.">Gcn2 eIF2alpha kinase mediates combinatorial translational regulation through nucleotide motifs and uORFs in target mRNAs.</a> Nucleic Acids Research. 48 (16), 8977-8992 (2020).</li><li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+footprint+profiling+of+translation+throughout+the+genome.">Ribosome footprint profiling of translation throughout the genome.</a> Cell. 165 (1), 22-33 (2016).</li><li>Ripmaster, T. L., Vaughn, G. P., Woolford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DRS1+to+DRS7,+novel+genes+required+for+ribosome+assembly+and+function+in+Saccharomyces+cerevisiae.">DRS1 to DRS7, novel genes required for ribosome assembly and function in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7901-7912 (1993).</li><li>Lo, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+essential+ribosome+assembly+AAA-ATPase+Rix7.">Cryo-EM structure of the essential ribosome assembly AAA-ATPase Rix7.</a> Nature Communications. 10 (1), 513 (2019).</li><li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grc3+programs+the+essential+endoribonuclease+Las1+for+specific+RNA+cleavage.">Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 5530-5538 (2017).</li><li>Woolford, J. L., Baserga, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+biogenesis+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).</li><li>Klinge, S., Woolford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+assembly+coming+into+focus.">Ribosome assembly coming into focus.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (2), 116-131 (2018).</li><li>Bassler, J., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+ribosome+assembly.">Eukaryotic ribosome assembly.</a> Annual Review of Biochemistry. 88, 281-306 (2019).</li><li>Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+puzzle+of+life:+Crafting+ribosomal+subunits.">A puzzle of life: Crafting ribosomal subunits.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 640-654 (2017).</li><li>Prattes, M., Lo, Y. H., Bergler, H., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+the+nascent+ribosome:+AAA-ATPases+in+eukaryotic+ribosome+biogenesis.">Shaping the nascent ribosome: AAA-ATPases in eukaryotic ribosome biogenesis.</a> Biomolecules. 9 (11), 715 (2019).</li><li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+molecular+crosstalk+within+the+essential+Grc3/Las1+pre-rRNA+processing+complex.">Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex.</a> RNA. 24 (5), 721-738 (2018).</li><li>Hu, W., Coller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+analysis+for+determining+mRNA+and+ribosome+association+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Polysome analysis for determining mRNA and ribosome association in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 530, 193-206 (2013).</li><li>He, S. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+analysis+of+mammalian+cells.">Polysome analysis of mammalian cells.</a> Methods in Enzymolog. 530, 183-192 (2013).</li><li>Anand, M., Chakraburtty, K., Marton, M. J., Hinnebusch, A. G., Kinzy, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+interactions+between+yeast+translation+eukaryotic+elongation+factor+(eEF)+1A+and+eEF3.">Functional interactions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6985-6991 (2003).</li><li>Serikawa, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptome+and+its+translation+during+recovery+from+cell+cycle+arrest+in+Saccharomyces+cerevisiae.">The transcriptome and its translation during recovery from cell cycle arrest in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cell Proteomics: MCP. 2 (3), 191-204 (2003).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li></ol>

Her er en metode til at skabe polysomprofiler uden brug af dyre automatiserede fraktioneringssystemer blevet beskrevet. Fordelen ved denne metode er, at den gør polysomprofilering tilgængelig for laboratorier, der ikke har automatiserede fraktioneringssystemer. De største ulemper ved denne protokol er kedelig håndfraktionering og reduceret følsomhed sammenlignet med det dedikerede densitetsfraktioneringssystem.
Denne protokol indebærer omhyggelig forberedelse af saccharosegradienter med ...

Ribosomer er mega-Dalton ribonukleoproteinkomplekser, der udfører den grundlæggende proces med at oversætte mRNA til proteiner. Ribosomer er ansvarlige for at udføre syntesen af alle proteiner i en celle. Eukaryote ribosomer omfatter to underenheder udpeget som den lille ribosomale underenhed (40S) og den store ribosomale underenhed (60S) i henhold til deres sedimentationskoefficienter. Det fuldt samlede ribosom betegnes som 80'ernes monosom. Polysomer er grupper af ribosomer, der beskæftiger sig med at oversætte et enkelt mRNA-molekyle. Polysomfraktionering ved saccharosedensitetsgradientcentrifugering er en kraftfuld metode, der bruges til at skabe ribosomprofiler, identificere specifikke mRNA'er forbundet med oversættelse af ribosomer og analysere polysomassocierede faktorer 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ,13. Denne teknik bruges ofte til at adskille polysomer fra enkelte ribosomer, ribosomale underenheder og messenger ribonukleoproteinpartikler. Profilerne opnået ved fraktionering kan give værdifuld information om oversættelsesaktiviteten af polysomer14 og samlingsstatus for ribosomerne15,16,17.
Ribosomsamling er en meget kompleks proces lettet af en gruppe proteiner kendt som ribosomsamlingsfaktorer 18,19,20,21. Disse faktorer udfører en bred vifte af funktioner under ribosombiogenese gennem interaktioner med mange andre proteiner, herunder ATPaser, endo- og exo-nukleaser, GTPaser, RNA-helicases og RNA-bindende proteiner22. Polysomfraktionering har været et kraftfuldt værktøj, der bruges til at undersøge disse faktorers rolle i ribosomsamling. For eksempel er denne metode blevet brugt til at demonstrere, hvordan mutationer i polynukleotidkinasen Grc3, en præ-rRNA-behandlingsfaktor, kan påvirke ribosomsamlingsprocessennegativt 17,23. Polysomprofilering har også fremhævet og vist, hvordan de bevarede motiver i ATPase Rix7 er afgørende for ribosomproduktionen16.
Proceduren for polysomfraktionering begynder med at fremstille opløselige cellelysater fra celler af interesse. Lysatet indeholder RNA, ribosomale underenheder og polysomer samt andre opløselige cellulære komponenter. En kontinuerlig, lineær saccharosegradient fremstilles i et ultracentrifugerør. Den opløselige fraktion af cellelysat lægges forsigtigt på toppen af saccharosegradientrøret. Det belastede gradientrør udsættes derefter for centrifugering, som adskiller de cellulære komponenter efter størrelse inden for saccharosegradienten ved tyngdekraften. De større komponenter bevæger sig længere ind i gradienten end de mindre komponenter. Toppen af gradienten huser de mindre, langsommere rejsende cellulære komponenter, mens de større, hurtigere rejsende cellulære komponenter findes i bunden. Efter centrifugering opsamles rørets indhold som fraktioner. Denne metode adskiller effektivt ribosomale underenheder, monosomer og polysomer. Den optiske tæthed af hver fraktion bestemmes derefter ved at måle spektralabsorbansen ved en bølgelængde på 254 nm. Plotning af absorbans vs. brøktal giver en polysomprofil.
Lineære saccharosetæthedsgradienter kan genereres ved hjælp af en gradientproducent. Efter centrifugering fraktioneres gradienter ofte, og absorbanser måles ved hjælp af et automatiseret densitetsfraktioneringssystem 3,7,13,24,25. Mens disse systemer fungerer meget godt til at producere polysomprofiler, er de dyre og kan være uoverkommelige for nogle laboratorier. Her præsenteres en protokol til generering af polysomprofiler uden brug af disse instrumenter. I stedet bruger denne protokol udstyr, der typisk er tilgængeligt i de fleste molekylærbiologiske laboratorier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automatic Fractionator</td>
			<td>Brandel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clariostar Multimode Plate Reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15508-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads, acid washed</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td>425&#8211;600 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, 1 M</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>CAC-5290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 22 G, Metal Hub</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>7748-08</td>
			<td>custom length 9 inches, point style 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XL-100K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Centrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Test Tube Peg Rack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-810-54A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q33228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit RNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Inhibitor</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N8080119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 3 mL</td>
			<td>Coviden</td>
			<td>888151394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, 1 M,&#160; pH 7.4</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Star Microplate, 96 wells</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655801</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polysome profiling without gradient makers or fractionation systems

Polysomfraktionering ved saccharosedensitetsgradientcentrifugering er et kraftfuldt værktøj, der kan bruges til at skabe ribosomprofiler, identificere specifikke mRNA'er, der oversættes af ribosomer, og analysere polysomassocierede faktorer. Mens automatiserede gradientproducenter og gradientfraktioneringssystemer ofte bruges med denne teknik, er disse systemer generelt dyre og kan være uoverkommelige for laboratorier, der har begrænsede ressourcer eller ikke kan retfærdiggøre udgiften på grund af deres sjældne eller lejlighedsvise behov for at udføre denne metode til deres forskning. Her præsenteres en protokol til reproducerbar generering af polysomprofiler ved hjælp af standardudstyr, der er tilgængeligt i de fleste molekylærbiologiske laboratorier uden specialiserede fraktioneringsinstrumenter. Desuden tilvejebringes en sammenligning af polysomprofiler genereret med og uden et gradientfraktioneringssystem. Strategier til optimering og produktion af reproducerbare polysomprofiler diskuteres. Saccharomyces cerevisiae anvendes som en modelorganisme i denne protokol. Denne protokol kan dog let ændres og tilpasses til at generere ribosomprofiler for mange forskellige organismer og celletyper.

Tre repræsentative polysomprofiler er vist i figur 3. Alle profiler er fra samme gærstamme. En typisk polysomprofil vil have velopløste toppe for 40S, 60S og 80S ribosomale underenheder samt polysomer. Kammen af hver ribosomal underenhed og polysomtop vil være tydelig på hver profil (figur 3). En repræsentativ profil fra et automatiseret densitetsfraktioneringssystem er vist i figur 3A. De saccharosegradienter, der blev anvend...

Watch this Scientific Journal Video about Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems at JoVE.com

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Denne protokol beskriver, hvordan man genererer en polysomprofil uden at bruge automatiserede gradientproducenter eller gradientfraktioneringssystemer.

Polysomprofilering uden gradueringsproducenter eller fraktioneringssystemer

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

Denne protokol beskriver, hvordan man genererer en polysomprofil, der afslører molekylære detaljer om aktiviteten af ribosomer inde i cellen. Denne teknik giver brugerne mulighed for at få de værdifulde oplysninger, der leveres af en polysomprofil, som ikke har adgang til automatiserede gradientfraktioneringssystemer. Tag dig god tid, mens du forbereder gradienterne, og opbevar gradienterne på et sted, hvor de ikke forstyrres af en kompressor eller andre mekaniske operationer, når de sætter sig i en lineær gradient.Til at begynde med fremstilles stamopløsninger på 7 og 47% saccharose i saccharosegradientbuffer. Filtrer steriliser saccharosestamopløsningerne gennem et filter på 0,22 mikron. Forbered 14 ml 17, 27 og 37% saccharoseopløsninger ved at dispensere og blande 7 og 47% lageropløsninger.Anbring seks polypropylencentrifugerør i et reagensglas med fuld visning. Sørg for, at der er plads nok mellem rørene, så handlingerne med et rør ikke forstyrrer de andre. Fastgør en ni tommer, 22 gauge nål med en stump spids til en tre milliliter sprøjte, og udfør en testfyldning og dispensering for at sikre, at sprøjten kan holde saccharoseopløsningen uden dryp, før gradienterne sættes op.Tilsæt to milliliter af 7% saccharose til bunden af hvert centrifugerør. Derefter tilsættes to milliliter af 17% saccharose under 7%-opløsningen ved at placere nålespidsen i umiddelbar nærhed af rørbunden. Dispenser forsigtigt og langsomt opløsningen.Gentag proceduren med to milliliter hver af 27, 37 og 47% saccharoseopløsningen, hvilket sikrer, at hvert lag kan skelnes fra det andet ved en linje, der markerer adskillelsen af tætheder. Opbevar gradienterne ved fire grader Celsius natten over for at give dem mulighed for at slå sig ned i en kontinuerlig, stigende procentdel af saccharose. Efter vækst og høst af gær, Saccharomyces cerevisiae celler, resuspend cellerne i kølet 700 mikroliter polysomekstraktionsbuffer.Tilsæt 100 enheder RNAse-hæmmer. Tilsæt derefter 400 mikroliter forkølede glasperler med en omtrentlig størrelse på 425 til 600 mikron. Overfør blandingen til et 1,5 ml centrifugerør med glasperlerne, og forstyrre gærcellerne ved kraftig omrøring i en perlepisker i fem minutter.Efter forstyrrelse af cellerne skal du afklare lysatet ved centrifugering. Koncentrationen af RNA'et i det klargjorte lysat bestemmes ved at måle absorbansen ved 260 nanometer ved hjælp af et fluorescensbaseret RNA-detektionssystem. Sørg for, at RNA-koncentrationen er 0,5 til et mikrogram pr. Mikroliter.Hvis RNA-koncentrationen er for lav, reduceres volumenet af ekstraktionsbuffer, der bruges til at resuspendere cellerne. Læg forsigtigt lysatet på toppen af gradienterne. Placer pipettespidsen mod den indre væg øverst på polypropylenrøret.Vinkel røret og dispenser langsomt lysatet på toppen af gradienten, dribler mod væggen. Anbring forsigtigt rørene i de forkølede spande på en svingende spandrotor, og centrifuger gradienterne. Efter centrifugering fjernes centrifugerørene forsigtigt fra den svingende spandrotor, og dem placeres i en rørholder.Mærk pladerne med 96 brønde for at opbevare fraktionerne og forkøle på is. Saml 100 eller 200 mikroliter fraktioner startende fra toppen af gradienten ved omhyggeligt at indsætte en pipettespids i toppen af gradienten og samle fraktionerne, indtil hele gradienten er aliciteret. Absorbansen af hver fraktion måles ved 254 nanometer med et spektrofotometer mod 7- og 47%saccharoseopløsningerne som emner.Opret polysomprofilen ved at plotte brøktallet versus absorbansen. Tre repræsentative polysomprofiler fra gær S.Cerevisiae, er vist. Kammen af hver ribosomal underenhed og polysomtop er tydelig på hver profil.En repræsentativ profil fra et automatiseret densitetsfraktioneringssystem vises her. Denne profil blev fremstillet ud fra en kontinuerlig absorbansprofil, da saccharosegradienten blev fortrængt nedefra og op af en jagtopløsning gennem en detektorstrømningscelle og opsamlet i fraktioner. Polysomprofilen genereret ved håndfraktionering af 200 og 100 mikroliter prøver er vist her.Det vigtigste at huske med denne procedure er ikke at forstyrre gradienterne. Pas på ikke at indføre luftbobler eller forstyrre gradienten ved at dispensere opløsningen for hurtigt. Efter denne procedure kan RNA ekstraheres fra gradienterne til yderligere analyse for at bestemme mRNA'er, der associerer med aktive ribosomer

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Hjernemembran Fraktionering: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Tilnærmelse til vurdering af subsynaptisk protein lokalisering

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

Fraktionering for opløsning af opløselige og uopløselige Huntingtin arter

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome profilering i Leishmania, menneskelige celler og mus Testis

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Påvisning af små GTPase Prenylation og GTP bindende ved hjælp af membran fraktionering og GTPase-forbundet Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

Manipulere levende celler til at konstruere stabil 3D cellulære forsamling uden kunstige stillads

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

Identifikation af Havlampretten feromoner ved hjælp af Bioassay-styrede fraktionering

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

Celle fraktionering af U937 celler i mangel af højhastighedstog centrifugering

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptid profilering og identifikation illustreret af angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Måling af interaktioner mellem fluorescerende sonder og lignin i plante sektioner af sFLIM baseret på naturlig Auto Luorescens

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Complexome-profilering med høj opløsning ved Cryoslicing BN-MS-analyse

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...