Name: polysome profiling without gradient makers or fractionation systems
Uploaded: 2021-06-01T14:00:00
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Les auteurs remercient le Dr Percy Tumbale et la Dre Melissa Wells pour leur lecture critique de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par le National Institute of Health Intramural Research Program des États-Unis; Institut national des sciences de la santé environnementale des États-Unis (NIEHS; ZIA ES103247 à R.E.S).

1. Préparation de gradients de saccharose de 7% à 47%
REMARQUE: La plage linéaire du gradient de saccharose peut être modifiée pour obtenir une meilleure séparation en fonction du type de cellule utilisé. Ce protocole est optimisé pour les profils polysomiques de S. cerevisiae.
<ol><li>Préparer des solutions mères de saccharose à 7 % et 47 % dans un tampon gradient de saccharose (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2 et 1 mM DTT). Filtrer stériliser le...

<ol>
	<li>Choi, A., Barrientos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sucrose+gradient+sedimentation+analysis+of+mitochondrial+ribosomes.">Sucrose gradient sedimentation analysis of mitochondrial ribosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 2192, 211-226 (2021).</li><li>Dos Santos, R. F., Barria, C., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+analysis+of+bacterial+ribosomes+through+sucrose+gradient+ultracentrifugation.">Isolation and analysis of bacterial ribosomes through sucrose gradient ultracentrifugation.</a> Methods in Molecular Biology. 2106, 299-310 (2020).</li><li>Pringle, E. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+profiling+in+leishmania,+human+cells+and+mouse+testis.">Polysome profiling in leishmania, human cells and mouse testis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e57600 (2018).</li><li>Jin, H. Y., Xiao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Integrated+polysome+profiling+and+ribosome+profiling+method+to+investigate+in+vivo+translatome.">An Integrated polysome profiling and ribosome profiling method to investigate in vivo translatome.</a> Methods in Molecular Biology. 1712, 1-18 (2018).</li><li>Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+translation+using+polysome+profiling.">Analysis of translation using polysome profiling.</a> Nucleic Acids Research. 45 (3), 15 (2017).</li><li>Aboulhouda, S., Di Santo, R., Therizols, G., Weinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate,+streamlined+analysis+of+mrna+translation+by+sucrose+gradient+fractionation.">Accurate, streamlined analysis of mrna translation by sucrose gradient fractionation.</a> Bio-protocol. 7 (19), 2573 (2017).</li><li>Kudla, M., Karginov, F. 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(92), e52295 (2014).</li><li>Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+translation+initiation+during+stress+conditions+by+polysome+profiling.">Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51164 (2014).</li><li>Panda, A. C., Martindale, J. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+footprint+profiling+of+translation+throughout+the+genome.">Ribosome footprint profiling of translation throughout the genome.</a> Cell. 165 (1), 22-33 (2016).</li><li>Ripmaster, T. L., Vaughn, G. P., Woolford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DRS1+to+DRS7,+novel+genes+required+for+ribosome+assembly+and+function+in+Saccharomyces+cerevisiae.">DRS1 to DRS7, novel genes required for ribosome assembly and function in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7901-7912 (1993).</li><li>Lo, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+essential+ribosome+assembly+AAA-ATPase+Rix7.">Cryo-EM structure of the essential ribosome assembly AAA-ATPase Rix7.</a> Nature Communications. 10 (1), 513 (2019).</li><li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grc3+programs+the+essential+endoribonuclease+Las1+for+specific+RNA+cleavage.">Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 5530-5538 (2017).</li><li>Woolford, J. L., Baserga, S. 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Molecular Cell Biology. 20 (2), 116-131 (2018).</li><li>Bassler, J., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+ribosome+assembly.">Eukaryotic ribosome assembly.</a> Annual Review of Biochemistry. 88, 281-306 (2019).</li><li>Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+puzzle+of+life:+Crafting+ribosomal+subunits.">A puzzle of life: Crafting ribosomal subunits.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 640-654 (2017).</li><li>Prattes, M., Lo, Y. H., Bergler, H., Stanley, R. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+molecular+crosstalk+within+the+essential+Grc3/Las1+pre-rRNA+processing+complex.">Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex.</a> RNA. 24 (5), 721-738 (2018).</li><li>Hu, W., Coller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+analysis+for+determining+mRNA+and+ribosome+association+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Polysome analysis for determining mRNA and ribosome association in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 530, 193-206 (2013).</li><li>He, S. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+analysis+of+mammalian+cells.">Polysome analysis of mammalian cells.</a> Methods in Enzymolog. 530, 183-192 (2013).</li><li>Anand, M., Chakraburtty, K., Marton, M. J., Hinnebusch, A. G., Kinzy, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+interactions+between+yeast+translation+eukaryotic+elongation+factor+(eEF)+1A+and+eEF3.">Functional interactions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6985-6991 (2003).</li><li>Serikawa, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptome+and+its+translation+during+recovery+from+cell+cycle+arrest+in+Saccharomyces+cerevisiae.">The transcriptome and its translation during recovery from cell cycle arrest in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cell Proteomics: MCP. 2 (3), 191-204 (2003).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li></ol>

Ici, une méthode pour créer des profils polysomiques sans utiliser de systèmes de fractionnement automatisés coûteux a été décrite. L’avantage de cette méthode est qu’elle rend le profilage des polysomes accessible aux laboratoires qui ne disposent pas de systèmes de fractionnement automatisés. Les principaux inconvénients de ce protocole sont le fractionnement manuel fastidieux et la sensibilité réduite par rapport au système de fractionnement de densité dédié.
Ce protoc...

Les ribosomes sont des complexes de ribonucléoprotéines méga-Dalton qui effectuent le processus fondamental de traduction de l’ARNm en protéines. Les ribosomes sont responsables de la synthèse de toutes les protéines d’une cellule. Les ribosomes eucaryotes comprennent deux sous-unités désignées comme la petite sous-unité ribosomique (40S) et la grande sous-unité ribosomique (60S) en fonction de leurs coefficients de sédimentation. Le ribosome entièrement assemblé est désigné comme le monosome 80S. Les polysomes sont des groupes de ribosomes engagés dans la traduction d’une seule molécule d’ARNm. Le fractionnement des polysomes par centrifugation par gradient de densité saccharose est une méthode puissante utilisée pour créer des profils de ribosomes, identifier des ARNm spécifiques associés à la traduction des ribosomes et analyser les facteurs associés aux polysomes 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ,13. Cette technique est souvent utilisée pour séparer les polysomes des ribosomes simples, des sous-unités ribosomales et des particules de ribonucléoprotéine messagère. Les profils obtenus par fractionnement peuvent fournir des informations précieuses concernant l’activité de traduction des polysomes14 et l’état d’assemblage des ribosomes15,16,17.
L’assemblage des ribosomes est un processus très complexe facilité par un groupe de protéines connues sous le nom de facteurs d’assemblage des ribosomes 18,19,20,21. Ces facteurs remplissent un large éventail de fonctions au cours de la biogenèse des ribosomes grâce à des interactions avec de nombreuses autres protéines, notamment les ATPases, les endonucléases et exonucléases, les GTPases, les hélicases d’ARN et les protéines de liaison à l’ARN22. Le fractionnement des polysomes a été un outil puissant utilisé pour étudier le rôle de ces facteurs dans l’assemblage des ribosomes. Par exemple, cette méthode a été utilisée pour démontrer comment des mutations dans la kinase polynucléotidique Grc3, un facteur de traitement pré-ARNr, peuvent affecter négativement le processus d’assemblage des ribosomes17,23. Le profilage des polysomes a également mis en évidence et montré comment les motifs conservés dans l’ATPase Rix7 sont essentiels à la production de ribosomes16.
La procédure de fractionnement des polysomes commence par la fabrication de lysats cellulaires solubles à partir de cellules d’intérêt. Le lysat contient de l’ARN, des sous-unités ribosomales et des polysomes, ainsi que d’autres composants cellulaires solubles. Un gradient de saccharose continu et linéaire est réalisé dans un tube à ultracentrifugation. La fraction soluble du lysat cellulaire est délicatement chargée sur le dessus du tube de gradient de saccharose. Le tube de gradient chargé est ensuite soumis à une centrifugation, qui sépare les composants cellulaires par taille dans le gradient de saccharose par la force de gravité. Les composants les plus grands se déplacent plus loin dans le gradient que les composants plus petits. Le haut du gradient abrite les composants cellulaires plus petits et plus lents, tandis que les composants cellulaires plus grands et plus rapides se trouvent en bas. Après centrifugation, le contenu du tube est recueilli sous forme de fractions. Cette méthode sépare efficacement les sous-unités ribosomiques, les monosomes et les polysomes. La densité optique de chaque fraction est ensuite déterminée en mesurant l’absorbance spectrale à une longueur d’onde de 254 nm. Le tracé de l’absorbance par rapport au nombre de fractions donne un profil polysomique.
Des gradients linéaires de densité de saccharose peuvent être générés à l’aide d’un générateur de gradient. Après centrifugation, les gradients sont souvent fractionnés et les absorbances mesurées à l’aide d’un système automatisé de fractionnement de densité 3,7,13,24,25. Bien que ces systèmes fonctionnent très bien pour produire des profils de polysomes, ils sont coûteux et peuvent être prohibitifs pour certains laboratoires. Ici, un protocole pour générer des profils polysomiques sans l’utilisation de ces instruments est présenté. Au lieu de cela, ce protocole utilise l’équipement généralement disponible dans la plupart des laboratoires de biologie moléculaire.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automatic Fractionator</td>
			<td>Brandel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clariostar Multimode Plate Reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15508-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads, acid washed</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td>425&#8211;600 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, 1 M</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>CAC-5290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 22 G, Metal Hub</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>7748-08</td>
			<td>custom length 9 inches, point style 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XL-100K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Centrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Test Tube Peg Rack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-810-54A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q33228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit RNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Inhibitor</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N8080119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 3 mL</td>
			<td>Coviden</td>
			<td>888151394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, 1 M,&#160; pH 7.4</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Star Microplate, 96 wells</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655801</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polysome profiling without gradient makers or fractionation systems

Le fractionnement des polysomes par centrifugation par gradient de densité saccharose est un outil puissant qui peut être utilisé pour créer des profils de ribosomes, identifier des ARNm spécifiques traduits par les ribosomes et analyser les facteurs associés aux polysomes. Bien que les fabricants de gradient automatisés et les systèmes de fractionnement de gradient soient couramment utilisés avec cette technique, ces systèmes sont généralement coûteux et peuvent être prohibitifs pour les laboratoires qui ont des ressources limitées ou qui ne peuvent pas justifier la dépense en raison de leur besoin peu fréquent ou occasionnel d’effectuer cette méthode pour leurs recherches. Ici, un protocole est présenté pour générer de manière reproductible des profils de polysomes en utilisant l’équipement standard disponible dans la plupart des laboratoires de biologie moléculaire sans instruments de fractionnement spécialisés. De plus, une comparaison des profils de polysomes générés avec et sans système de fractionnement par gradient est fournie. Les stratégies visant à optimiser et à produire des profils polysomiques reproductibles sont discutées. Saccharomyces cerevisiae est utilisé comme organisme modèle dans ce protocole. Cependant, ce protocole peut être facilement modifié et adapté pour générer des profils de ribosomes pour de nombreux organismes et types de cellules différents.

Trois profils de polysomes représentatifs sont présentés à la figure 3. Tous les profils proviennent de la même souche de levure. Un profil polysomique typique aura des pics bien résolus pour les sous-unités ribosomales 40S, 60S et 80S ainsi que pour les polysomes. La crête de chaque sous-unité ribosomique et pic de polysome sera apparente sur chaque profil (Figure 3). Un profil représentatif d’un système automatisé de fractionnement de densité es...

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Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Ce protocole décrit comment générer un profil polysomique sans utiliser de générateurs de gradient automatisés ou de systèmes de fractionnement de gradient.

Profilage des polysomes sans générateurs de gradient ni systèmes de fractionnement

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

Ce protocole décrit comment générer un profil polysomique qui révèle des détails moléculaires sur l’activité des ribosomes à l’intérieur de la cellule. Cette technique permet aux utilisateurs d’obtenir les informations précieuses fournies par un profil polysomique, qui n’ont pas accès à des systèmes automatisés de fractionnement de gradient. Prenez votre temps lors de la préparation des gradients et stockez les gradients dans un endroit où ils ne seront pas perturbés par un compresseur ou d’autres opérations mécaniques lorsqu’ils s’installent dans une pente linéaire.Pour commencer, préparez des solutions mères de 7 et 47% de saccharose dans un tampon de gradient de saccharose. Filtrer stériliser les solutions de saccharose à travers un filtre de 0,22 micron. Préparer 14 millilitres de solutions de saccharose à 17, 27 et 37 % en distribuant et en mélangeant les solutions mères à 7 et 47 %.Placez six tubes centrifuges en polypropylène dans un support de tube à essai à vue intégrale. Assurez-vous qu’il y a suffisamment d’espace entre les tubes pour que les actions avec un tube ne perturbent pas les autres. Fixez une aiguille de calibre 22 de neuf pouces avec une pointe émoussée à une seringue de trois millilitres, et effectuez un remplissage et une distribution d’essai pour s’assurer que la seringue peut contenir la solution de saccharose sans goutte avant de mettre en place les gradients.Ajouter deux millilitres de saccharose à 7% au fond de chaque tube de centrifugation. Ensuite, ajoutez deux millilitres du saccharose à 17% sous la solution à 7%, en positionnant l’extrémité de l’aiguille à proximité immédiate du fond du tube. Distribuez soigneusement et lentement la solution.Répétez la procédure avec deux millilitres chacun de la solution de saccharose à 27, 37 et 47%, en veillant à ce que chaque couche se distingue de l’autre par une ligne marquant la séparation des densités. Conservez les gradients à quatre degrés Celsius pendant la nuit pour leur permettre de se déposer dans un pourcentage continu et croissant de saccharose. Après la croissance et la récolte de la levure, les cellules de Saccharomyces cerevisiae remettent les cellules en suspension dans 700 microlitres réfrigérés de tampon d’extraction de polysomes.Ajouter 100 unités d’inhibiteur de l’ARNase. Ensuite, ajoutez 400 microlitres de billes de verre pré-refroidies d’une taille approximative de 425 à 600 microns. Transférer le mélange dans un tube centrifuge de 1,5 millilitre avec les billes de verre et perturber les cellules de levure par une agitation vigoureuse dans un batteur à billes pendant cinq minutes.Après avoir perturbé les cellules, clarifier le lysat par centrifugation. Déterminer la concentration de l’ARN dans le lysat clarifié en mesurant l’absorbance à 260 nanomètres, à l’aide d’un système de détection d’ARN basé sur la fluorescence. Assurez-vous que la concentration d’ARN est de 0,5 à un microgramme par microlitre.Si la concentration d’ARN est trop faible, réduire le volume du tampon d’extraction utilisé pour remettre les cellules en suspension. Chargez soigneusement le lysat sur le dessus des dégradés. Placez l’embout de la pipette contre la paroi intérieure au sommet du tube en polypropylène.Inclinez le tube et distribuez lentement le lysat sur le dessus de la pente, en dribblant contre le mur. Placez délicatement les tubes dans les godets pré-refroidis d’un rotor de godet oscillant et centrifugez les gradients. Après la centrifugation, retirez soigneusement les tubes de centrifugation du rotor du godet oscillant et placez-les dans un support de tube.Étiqueter les plaques de 96 puits pour stocker les fractions et prérefroidir sur de la glace. Recueillir 100 ou 200 fractions de microlitres en partant du haut du gradient, en insérant soigneusement une pointe de pipette dans le haut du gradient, et en recueillant les fractions jusqu’à ce que tout le dégradé soit aliquote. Mesurer l’absorbance de chaque fraction à 254 nanomètres avec un spectrophotomètre par rapport aux solutions de saccharose à 7 et 47% sous forme d’ébauches.Créez le profil polysomique en traçant le nombre de fractions en fonction de l’absorbance. Trois profils polysomiques représentatifs de la levure S.Cerevisiae, sont présentés. La crête de chaque sous-unité ribosomique et pic polysomique est apparente sur chaque profil.Un profil représentatif d’un système automatisé de fractionnement de densité est présenté ici. Ce profil a été produit à partir d’un profil d’absorbance continue lorsque le gradient de saccharose a été déplacé de bas en haut par une solution de chasse, à travers une cellule d’écoulement du détecteur et recueilli en fractions. Le profil polysomique généré par fractionnement manuel d’échantillons de 200 et 100 microlitres est présenté ici.La chose la plus importante à retenir avec cette procédure est de ne pas perturber les gradients. Veillez à ne pas introduire de bulles d’air ou perturber le gradient en distribuant la solution trop rapidement. En suivant cette procédure, l’ARN peut être extrait des gradients pour une analyse plus approfondie afin de déterminer les ARNm qui s’associent à des ribosomes actifs.

Research

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Recherche

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Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome profilage en Leishmania, les cellules humaines et des testicules de souris

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Détection des petits GTPase prénylation et GTP Binding utilisant le fractionnement Membrane et GTPase-linked Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

Manipulation de cellules vivantes pour construire Stable Assemblée cellulaire 3D sans échafaudage artificiel

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

L’Identification des phéromones de la lamproie marine à l’aide de fractionnement Bioassay-guidé

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

Fractionnement de cellules des cellules U937 en l’Absence de Centrifugation à haute vitesse

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Profilage et identification de Nitropeptide illustrépar Angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Mesurer les interactions entre les sondes fluorescentes et la lignine dans les sections végétales par sFLIM Basé sur l'autofluorescence indigène

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Profilage du complexome haute résolution par cryoslicing BN-MS Analysis

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...