Name: polysome profiling without gradient makers or fractionation systems
Uploaded: 2021-06-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems at JoVE.com

המחברים מודים לד"ר פרסי טומבלה ולד"ר מליסה וולס על קריאתם הביקורתית של כתב יד זה. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי של ארה"ב לבריאות תוכנית מחקר תוך-מוחית; המכון הלאומי של ארה"ב למדעי בריאות הסביבה (NIEHS; ZIA ES103247 ל- R.E.S).

1. הכנת שיפועים של 7% - 47% סוכרוז
הערה: ניתן לשנות את הטווח הליניארי של מעבר הצבע סוכרוז כדי להשיג הפרדה טובה יותר בהתאם לסוג התא שבו נעשה שימוש. פרוטוקול זה מותאם לפרופילי פוליזום עבור S. cerevisiae.
<ol><li>הכן פתרונות מלאי של 7% ו-47% סוכרוז במאגר הדרגתי של סוכרוז (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 60 mM KCl,...

<ol>
	<li>Choi, A., Barrientos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sucrose+gradient+sedimentation+analysis+of+mitochondrial+ribosomes.">Sucrose gradient sedimentation analysis of mitochondrial ribosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 2192, 211-226 (2021).</li><li>Dos Santos, R. F., Barria, C., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+analysis+of+bacterial+ribosomes+through+sucrose+gradient+ultracentrifugation.">Isolation and analysis of bacterial ribosomes through sucrose gradient ultracentrifugation.</a> Methods in Molecular Biology. 2106, 299-310 (2020).</li><li>Pringle, E. S., McCormick, C., Cheng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+profiling+analysis+of+mRNA+and+associated+proteins+engaged+in+translation.">Polysome profiling analysis of mRNA and associated proteins engaged in translation.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 125 (1), 79 (2019).</li><li>Liang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome-profiling+in+small+tissue+samples.">Polysome-profiling in small tissue samples.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 3 (2018).</li><li>Karamysheva, Z. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+profiling+in+leishmania,+human+cells+and+mouse+testis.">Polysome profiling in leishmania, human cells and mouse testis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e57600 (2018).</li><li>Jin, H. Y., Xiao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Integrated+polysome+profiling+and+ribosome+profiling+method+to+investigate+in+vivo+translatome.">An Integrated polysome profiling and ribosome profiling method to investigate in vivo translatome.</a> Methods in Molecular Biology. 1712, 1-18 (2018).</li><li>Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+translation+using+polysome+profiling.">Analysis of translation using polysome profiling.</a> Nucleic Acids Research. 45 (3), 15 (2017).</li><li>Aboulhouda, S., Di Santo, R., Therizols, G., Weinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate,+streamlined+analysis+of+mrna+translation+by+sucrose+gradient+fractionation.">Accurate, streamlined analysis of mrna translation by sucrose gradient fractionation.</a> Bio-protocol. 7 (19), 2573 (2017).</li><li>Kudla, M., Karginov, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mRNA+translation+by+polysome+profiling.">Measuring mRNA translation by polysome profiling.</a> Methods in Molecular Biology. 1421, 127-135 (2016).</li><li>Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+selective+mRNA+translation+in+mammalian+cells+by+polysome+profiling.">Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e52295 (2014).</li><li>Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+translation+initiation+during+stress+conditions+by+polysome+profiling.">Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51164 (2014).</li><li>Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+fractionation+to+analyze+mRNA+distribution+profiles.">Polysome fractionation to analyze mRNA distribution profiles.</a> Bio-protocol. 7 (3), 2126 (2017).</li><li>Chikashige, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gcn2+eIF2alpha+kinase+mediates+combinatorial+translational+regulation+through+nucleotide+motifs+and+uORFs+in+target+mRNAs.">Gcn2 eIF2alpha kinase mediates combinatorial translational regulation through nucleotide motifs and uORFs in target mRNAs.</a> Nucleic Acids Research. 48 (16), 8977-8992 (2020).</li><li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+footprint+profiling+of+translation+throughout+the+genome.">Ribosome footprint profiling of translation throughout the genome.</a> Cell. 165 (1), 22-33 (2016).</li><li>Ripmaster, T. L., Vaughn, G. P., Woolford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DRS1+to+DRS7,+novel+genes+required+for+ribosome+assembly+and+function+in+Saccharomyces+cerevisiae.">DRS1 to DRS7, novel genes required for ribosome assembly and function in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7901-7912 (1993).</li><li>Lo, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+essential+ribosome+assembly+AAA-ATPase+Rix7.">Cryo-EM structure of the essential ribosome assembly AAA-ATPase Rix7.</a> Nature Communications. 10 (1), 513 (2019).</li><li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grc3+programs+the+essential+endoribonuclease+Las1+for+specific+RNA+cleavage.">Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 5530-5538 (2017).</li><li>Woolford, J. L., Baserga, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+biogenesis+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).</li><li>Klinge, S., Woolford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+assembly+coming+into+focus.">Ribosome assembly coming into focus.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (2), 116-131 (2018).</li><li>Bassler, J., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+ribosome+assembly.">Eukaryotic ribosome assembly.</a> Annual Review of Biochemistry. 88, 281-306 (2019).</li><li>Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+puzzle+of+life:+Crafting+ribosomal+subunits.">A puzzle of life: Crafting ribosomal subunits.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 640-654 (2017).</li><li>Prattes, M., Lo, Y. H., Bergler, H., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+the+nascent+ribosome:+AAA-ATPases+in+eukaryotic+ribosome+biogenesis.">Shaping the nascent ribosome: AAA-ATPases in eukaryotic ribosome biogenesis.</a> Biomolecules. 9 (11), 715 (2019).</li><li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+molecular+crosstalk+within+the+essential+Grc3/Las1+pre-rRNA+processing+complex.">Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex.</a> RNA. 24 (5), 721-738 (2018).</li><li>Hu, W., Coller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+analysis+for+determining+mRNA+and+ribosome+association+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Polysome analysis for determining mRNA and ribosome association in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 530, 193-206 (2013).</li><li>He, S. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+analysis+of+mammalian+cells.">Polysome analysis of mammalian cells.</a> Methods in Enzymolog. 530, 183-192 (2013).</li><li>Anand, M., Chakraburtty, K., Marton, M. J., Hinnebusch, A. G., Kinzy, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+interactions+between+yeast+translation+eukaryotic+elongation+factor+(eEF)+1A+and+eEF3.">Functional interactions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6985-6991 (2003).</li><li>Serikawa, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptome+and+its+translation+during+recovery+from+cell+cycle+arrest+in+Saccharomyces+cerevisiae.">The transcriptome and its translation during recovery from cell cycle arrest in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cell Proteomics: MCP. 2 (3), 191-204 (2003).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li></ol>

כאן תוארה שיטה ליצירת פרופילים פוליזום ללא שימוש במערכות פיצול אוטומטיות יקרות. היתרון של שיטה זו הוא שהיא מנגישה פרופיל פוליזום למעבדות שאין להן מערכות פיצול אוטומטיות. החסרונות העיקריים של פרוטוקול זה הם פיצול ידיים מייגע ורגישות מופחתת בהשוואה למערכת פיצול הצפיפות הייעודית.
<p class="jo...

ריבוזומים הם קומפלקסים מגה-דלטון ריבונוקלאופרוטאין המבצעים את התהליך הבסיסי של תרגום mRNA לחלבונים. ריבוזומים אחראים על ביצוע הסינתזה של כל החלבונים בתוך התא. ריבוזומים אאוקריוטים מורכבים משתי תת-יחידות המוגדרות כתת-יחידה ריבוזומלית קטנה (40S) ותת-יחידה ריבוזומלית גדולה (60S) על פי מקדמי המשקעים שלהן. הריבוזום המורכב במלואו מוגדר כמונוזום 80S. פוליזומים הם קבוצות של ריבוזומים העוסקים בתרגום מולקולת mRNA יחידה. פיצול פוליזום על ידי צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות סוכרוז היא שיטה רבת עוצמה המשמשת ליצירת פרופילי ריבוזום, זיהוי mRNA ספציפיים הקשורים לתרגום ריבוזומים וניתוח גורמים הקשורים לפוליזום 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ,13. טכניקה זו משמשת לעתים קרובות להפרדת פוליסומים מריבוזומים בודדים, תת-יחידות ריבוזומליות וחלקיקי ריבונוקלאופרוטאין שליחים. הפרופילים המתקבלים מהפיצול יכולים לספק מידע רב ערך לגבי פעילות התרגום של פוליזומים14 ומצב ההרכבה של הריבוזומים15,16,17.
הרכבת ריבוזום היא תהליך מורכב מאוד המתאפשר על ידי קבוצה של חלבונים הידועים כגורמי הרכבה ריבוזום 18,19,20,21. גורמים אלה מבצעים מגוון רחב של פונקציות במהלך ביוגנזה של ריבוזום באמצעות אינטראקציות עם חלבונים רבים אחרים, כולל ATPases, אנדו ואקסו-נוקלזים, GTPases, RNA helicases וחלבונים קושרי RNA22. פיצול פוליזום היה כלי רב עוצמה המשמש לחקר תפקידם של גורמים אלה בהרכבת ריבוזום. לדוגמה, שיטה זו שימשה כדי להדגים כיצד מוטציות בפולינוקלאוטיד קינאז Grc3, גורם עיבוד קדם-rRNA, יכולות להשפיע לרעה על תהליך הרכבת הריבוזום17,23. פרופיל פוליזום גם הדגיש והראה כיצד המוטיבים המשומרים בתוך ATPase Rix7 חיוניים לייצור ריבוזום16.
ההליך לפיצול פוליזום מתחיל ביצירת תאים מסיסים מתאי עניין. הליזאט מכיל RNA, תת-יחידות ריבוזומליות ופוליזומים, כמו גם רכיבים תאיים מסיסים אחרים. שיפוע סוכרוז רציף וליניארי נוצר בתוך צינור אולטרה-צנטריפוגה. החלק המסיס של ליזאט התא נטען בעדינות על החלק העליון של צינור גרדיאנט סוכרוז. לאחר מכן, צינור השיפוע הטעון נתון לצנטריפוגה, המפרידה בין הרכיבים התאיים לפי גודלם בתוך שיפוע הסוכרוז בכוח הכבידה. הרכיבים הגדולים יותר נעים רחוק יותר לתוך השיפוע מאשר הרכיבים הקטנים יותר. החלק העליון של השיפוע מכיל את הרכיבים התאיים הקטנים והאיטיים יותר, ואילו הרכיבים הסלולריים הגדולים והמהירים יותר נמצאים בתחתית. לאחר צנטריפוגה, התוכן של הצינור נאספים כשברים. שיטה זו מפרידה ביעילות בין תת-יחידות ריבוזומליות, מונוזומים ופוליסומים. הצפיפות האופטית של כל שבר נקבעת לאחר מכן על ידי מדידת הבליעה הספקטרלית באורך גל של 254 ננומטר. התוויית ספיגה לעומת מספר שבר מניבה פרופיל פוליזום.
ניתן ליצור מעברי צבע ליניאריים של צפיפות סוכרוז באמצעות יצירת מעבר צבע. לאחר צנטריפוגה, שיפועים מופרדים לעתים קרובות, וסופגות נמדדות באמצעות מערכת פיצול צפיפות אוטומטית 3,7,13,24,25. בעוד שמערכות אלה פועלות היטב כדי לייצר פרופילים פוליזומיים, הן יקרות ועלולות להיות יקרות עבור מעבדות מסוימות. כאן מוצג פרוטוקול ליצירת פרופילים פוליזום ללא שימוש בכלים אלה. במקום זאת, פרוטוקול זה משתמש בציוד הזמין בדרך כלל ברוב מעבדות הביולוגיה המולקולרית.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automatic Fractionator</td>
			<td>Brandel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clariostar Multimode Plate Reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15508-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads, acid washed</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td>425&#8211;600 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, 1 M</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>CAC-5290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 22 G, Metal Hub</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>7748-08</td>
			<td>custom length 9 inches, point style 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XL-100K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Centrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Test Tube Peg Rack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-810-54A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q33228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit RNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Inhibitor</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N8080119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 3 mL</td>
			<td>Coviden</td>
			<td>888151394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, 1 M,&#160; pH 7.4</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Star Microplate, 96 wells</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655801</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polysome profiling without gradient makers or fractionation systems

פיצול פוליזום על ידי צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות סוכרוז הוא כלי רב עוצמה שניתן להשתמש בו כדי ליצור פרופילים של ריבוזומים, לזהות mRNA ספציפיים המתורגמים על ידי ריבוזומים, ולנתח גורמים הקשורים לפוליזום. בעוד שיצרני שיפועים אוטומטיים ומערכות פיצול הדרגתיות משמשים בדרך כלל בטכניקה זו, מערכות אלה הן בדרך כלל יקרות ויכולות להיות יקרות עבור מעבדות שיש להן משאבים מוגבלים או שאינן יכולות להצדיק את ההוצאה בשל הצורך הנדיר או המזדמן שלהן לבצע שיטה זו עבור המחקר שלהן. כאן מוצג פרוטוקול ליצירת פרופילי פוליזום באמצעות ציוד סטנדרטי הזמין ברוב מעבדות הביולוגיה המולקולרית ללא מכשירי פיצול מיוחדים. יתר על כן, ניתנת השוואה של פרופילי פוליזום שנוצרו עם ובלי מערכת פיצול הדרגתית. נדונו אסטרטגיות למיטוב וייצור פרופילי פוליזום הניתנים לשחזור. Saccharomyces cerevisiae משמש כאורגניזם מודל בפרוטוקול זה. עם זאת, פרוטוקול זה יכול להשתנות בקלות ולהתאים ליצירת פרופילי ריבוזום עבור אורגניזמים וסוגי תאים רבים ושונים.

שלושה פרופילים פוליזום מייצגים מוצגים באיור 3. כל הפרופילים הם מאותו זן שמרים. פרופיל פוליזום טיפוסי יהיה בעל פסגות פתורות היטב עבור תת-יחידות ריבוזומליות של 40S, 60S ו-80S, כמו גם פוליזומים. הפסגה של כל תת-יחידה ריבוזומלית ופסגה פוליזומית תיראה בכל פרופיל (איור 3...

Watch this Scientific Journal Video about Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems at JoVE.com

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור פרופיל פוליזום מבלי להשתמש ביצרני שיפועים אוטומטיים או במערכות פיצול הדרגתיות.

פרופיל פוליזום ללא יצרני שיפועים או מערכות פיצול

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור פרופיל פוליזום החושף פרטים מולקולריים על פעילות הריבוזומים בתוך התא. טכניקה זו מאפשרת למשתמשים להשיג את המידע החשוב המסופק על ידי פרופיל פוליזום, שאין להם גישה למערכות פיצול הדרגתיות אוטומטיות. קח את הזמן שלך בעת הכנת מעברי הצבע, ואחסן את מעברי הצבע במיקום שבו הם לא יופרעו על ידי מדחס או פעולות מכניות אחרות כשהם שוקעים לשיפוע ליניארי.כדי להתחיל, הכינו פתרונות מלאי של 7 ו-47% סוכרוז במאגר הדרגתי של סוכרוז. המסנן מעקר את תמיסות מלאי הסוכרוז באמצעות מסנן של 0.22 מיקרון. הכן 14 מיליליטר של 17, 27 ו 37% סוכרוז פתרונות על ידי חלוקה וערבוב של פתרונות מלאי 7 ו -47%.הנח שש שפופרות צנטריפוגות פוליפרופילן לתוך מתלה מבחנה לצפייה מלאה. ודא שיש מספיק רווח בין הצינורות, כך שהפעולות עם צינור אחד לא יפריעו לאחרים. חברו מחט בגודל 9 אינץ', 22 מד עם קצה קהה למזרק של שלושה מיליליטר, ובצעו מילוי ופיזור בדיקה כדי להבטיח שהמזרק יכול להחזיק את תמיסת הסוכרוז ללא כל טפטוף לפני הגדרת השיפועים.הוסף שני מיליליטר של 7% סוכרוז לתחתית כל צינור צנטריפוגה. לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר של 17% סוכרוז מתחת לתמיסת 7%, על ידי מיקום קצה המחט בסביבה הקרובה של תחתית הצינור. בזהירות ובאיטיות לוותר על הפתרון.חזור על ההליך עם שני מיליליטר כל אחד מתמיסת 27, 37 ו 47% סוכרוז, להבטיח כי כל שכבה ניתנת להבחנה מהשנייה על ידי קו המסמן את הפרדת הצפיפויות. אחסנו את השיפועים בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לאפשר להם להתמקם לאחוז רציף והולך של סוכרוז. לאחר הצמיחה והקציר של שמרים, Saccharomyces cerevisiae תאים, לתלות את התאים ב 700 microliters מקורר של חיץ מיצוי פוליזום.הוסף 100 יחידות של מעכב RNAse. לאחר מכן, הוסיפו 400 מיקרוליטרים של חרוזי זכוכית מקוררים מראש בגודל משוער של 425 עד 600 מיקרון. מעבירים את התערובת לצינור צנטריפוגה בקוטר 1.5 מיליליטר עם חרוזי הזכוכית, ומשבשים את תאי השמרים על ידי תסיסה נמרצת במקציף חרוזים למשך חמש דקות.לאחר שיבוש התאים, להבהיר את lysate על ידי צנטריפוגה. קבע את ריכוז הרנ"א בליזאט המובהר על ידי מדידת הספיגה ב-260 ננומטר, באמצעות מערכת זיהוי RNA מבוססת פלואורסצנציה. ודא כי ריכוז RNA הוא 0.5 עד מיקרוגרם אחד לכל מיקרוליטר.אם ריכוז הרנ"א נמוך מדי, הפחיתו את נפח חיץ המיצוי המשמש להחייאת התאים. טען בזהירות את הליזאט על החלק העליון של מעברי הצבע. מניחים את קצה הפיפטה על הקיר הפנימי בחלק העליון של צינור הפוליפרופילן.זווית את הצינור ולאט לאט לטפטף את הליזאט על החלק העליון של שיפוע, מטפטף על הקיר. מניחים בעדינות את הצינורות לתוך הדליים המצוננים מראש של רוטור דלי מתנדנד, וצנטריפוגות את השיפועים. לאחר הצנטריפוגה, הסר בזהירות את צינורות הצנטריפוגה מרוטור הדלי המתנדנד, והנח אותם במחזיק צינורות.תייג את לוחות 96 הבארות כדי לאחסן את השברים ולצנן מראש על קרח. אסוף 100 או 200 שברים מיקרוליטר החל מראש השיפוע, על ידי החדרה זהירה של קצה פיפטה לחלק העליון של השיפוע, ואיסוף השברים עד שכל השיפוע הוא aliquoted. מדוד את הספיגה של כל שבר ב-254 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר כנגד תמיסות 7 ו-47% סוכרוז כריקים.צור את פרופיל הפוליזום על-ידי התוויית מספר השבר לעומת הספיגה. שלושה פרופילים פוליזום מייצגים של שמרים S.Cerevisiae, מוצגים. הפסגה של כל תת-יחידה ריבוזומלית ופסגת פוליזום ניכרת בכל פרופיל.פרופיל מייצג ממערכת חלוקת צפיפות אוטומטית מוצג כאן. פרופיל זה הופק מפרופיל ספיגה רציף כאשר שיפוע הסוכרוז נעקר מלמטה למעלה על ידי תמיסת מרדף, דרך תא זרימת גלאי ונאסף בשברים. פרופיל הפוליזום שנוצר על ידי חלוקה ידנית של 200 ו-100 דגימות מיקרוליטר מוצג כאן.הדבר החשוב ביותר שיש לזכור עם הליך זה הוא לא לשבש את שיפוע. היזהרו לא להכניס בועות אוויר או לשבש את השיפוע על ידי חלוקת פתרון מהר מדי. לאחר הליך זה, ניתן לחלץ RNA מהשיפועים לניתוח נוסף כדי לקבוע mRNA המשויכים לריבוזומים פעילים

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

קרום המוח Fractation: An<em&gt; אקס ויוו</em&gt; גישה כדי להעריך לוקליזציה חלבון subsynaptic

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

Fractionation רזולוציה של מינים Huntingtin מסיסים ובחלקם לא מסיסים

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome פרופיל לישמניה, תאים אנושיים, Testis העכבר

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

זיהוי של GTPase Prenylation קטן ו GTP איגוד באמצעות ממברנה Fractionation ו GTPase-מקושרים Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

מניפולציה מתאים חיים לבנות יציב הרכבה הסלולר 3D ללא לגרדום מלאכותי

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

הזיהוי של פרומונים ים עגולי הפה באמצעות מונחה Bioassay Fractionation

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

תא Fractionation של תאים U937, בהעדר צנטריפוגה במהירות גבוהה

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

ניטרופפטיד פרופיל וזיהוי מאויר על ידי אנגיוטנסין השני

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

מדידת אינטראקציות בין הפלורסנט לליגנין בסעיפים צמחיים על ידי sFLIM בהתבסס על מבוסס על קרינה פלואורסצנטית מקורית

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

הפרדה ברזולוציה גבוהה בפרופיל מלא-ניתוח בהקפאה בסון-MS

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...