Name: polysome profiling without gradient makers or fractionation systems
Uploaded: 2021-06-01T14:00:00
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लेखक इस पांडुलिपि के आलोचनात्मक पठन के लिए डॉ पर्सी टुम्बले और डॉ मेलिसा वेल्स को धन्यवाद देते हैं। इस काम को यूएस नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया था; यूएस नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ एनवायरनमेंटल हेल्थ साइंसेज (एनआईईएचएस; ज़िया ईएस 103247 से आर.ई.एस.

1. 7% - 47% सुक्रोज ग्रेडिएंट की तैयारी
नोट: सुक्रोज ढाल की रैखिक सीमा को उपयोग किए गए सेल प्रकार के आधार पर बेहतर पृथक्करण प्राप्त करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल S. Cerevisiae के लिए प?...

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	<li>Choi, A., Barrientos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sucrose+gradient+sedimentation+analysis+of+mitochondrial+ribosomes.">Sucrose gradient sedimentation analysis of mitochondrial ribosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 2192, 211-226 (2021).</li><li>Dos Santos, R. F., Barria, C., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+analysis+of+bacterial+ribosomes+through+sucrose+gradient+ultracentrifugation.">Isolation and analysis of bacterial ribosomes through sucrose gradient ultracentrifugation.</a> Methods in Molecular Biology. 2106, 299-310 (2020).</li><li>Pringle, E. S., McCormick, C., Cheng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+profiling+analysis+of+mRNA+and+associated+proteins+engaged+in+translation.">Polysome profiling analysis of mRNA and associated proteins engaged in translation.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 125 (1), 79 (2019).</li><li>Liang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome-profiling+in+small+tissue+samples.">Polysome-profiling in small tissue samples.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 3 (2018).</li><li>Karamysheva, Z. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+profiling+in+leishmania,+human+cells+and+mouse+testis.">Polysome profiling in leishmania, human cells and mouse testis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e57600 (2018).</li><li>Jin, H. Y., Xiao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Integrated+polysome+profiling+and+ribosome+profiling+method+to+investigate+in+vivo+translatome.">An Integrated polysome profiling and ribosome profiling method to investigate in vivo translatome.</a> Methods in Molecular Biology. 1712, 1-18 (2018).</li><li>Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+translation+using+polysome+profiling.">Analysis of translation using polysome profiling.</a> Nucleic Acids Research. 45 (3), 15 (2017).</li><li>Aboulhouda, S., Di Santo, R., Therizols, G., Weinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate,+streamlined+analysis+of+mrna+translation+by+sucrose+gradient+fractionation.">Accurate, streamlined analysis of mrna translation by sucrose gradient fractionation.</a> Bio-protocol. 7 (19), 2573 (2017).</li><li>Kudla, M., Karginov, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mRNA+translation+by+polysome+profiling.">Measuring mRNA translation by polysome profiling.</a> Methods in Molecular Biology. 1421, 127-135 (2016).</li><li>Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+selective+mRNA+translation+in+mammalian+cells+by+polysome+profiling.">Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e52295 (2014).</li><li>Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+translation+initiation+during+stress+conditions+by+polysome+profiling.">Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51164 (2014).</li><li>Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+fractionation+to+analyze+mRNA+distribution+profiles.">Polysome fractionation to analyze mRNA distribution profiles.</a> Bio-protocol. 7 (3), 2126 (2017).</li><li>Chikashige, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gcn2+eIF2alpha+kinase+mediates+combinatorial+translational+regulation+through+nucleotide+motifs+and+uORFs+in+target+mRNAs.">Gcn2 eIF2alpha kinase mediates combinatorial translational regulation through nucleotide motifs and uORFs in target mRNAs.</a> Nucleic Acids Research. 48 (16), 8977-8992 (2020).</li><li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+footprint+profiling+of+translation+throughout+the+genome.">Ribosome footprint profiling of translation throughout the genome.</a> Cell. 165 (1), 22-33 (2016).</li><li>Ripmaster, T. L., Vaughn, G. P., Woolford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DRS1+to+DRS7,+novel+genes+required+for+ribosome+assembly+and+function+in+Saccharomyces+cerevisiae.">DRS1 to DRS7, novel genes required for ribosome assembly and function in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7901-7912 (1993).</li><li>Lo, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+essential+ribosome+assembly+AAA-ATPase+Rix7.">Cryo-EM structure of the essential ribosome assembly AAA-ATPase Rix7.</a> Nature Communications. 10 (1), 513 (2019).</li><li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grc3+programs+the+essential+endoribonuclease+Las1+for+specific+RNA+cleavage.">Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 5530-5538 (2017).</li><li>Woolford, J. L., Baserga, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+biogenesis+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).</li><li>Klinge, S., Woolford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+assembly+coming+into+focus.">Ribosome assembly coming into focus.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (2), 116-131 (2018).</li><li>Bassler, J., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+ribosome+assembly.">Eukaryotic ribosome assembly.</a> Annual Review of Biochemistry. 88, 281-306 (2019).</li><li>Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+puzzle+of+life:+Crafting+ribosomal+subunits.">A puzzle of life: Crafting ribosomal subunits.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 640-654 (2017).</li><li>Prattes, M., Lo, Y. H., Bergler, H., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+the+nascent+ribosome:+AAA-ATPases+in+eukaryotic+ribosome+biogenesis.">Shaping the nascent ribosome: AAA-ATPases in eukaryotic ribosome biogenesis.</a> Biomolecules. 9 (11), 715 (2019).</li><li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+molecular+crosstalk+within+the+essential+Grc3/Las1+pre-rRNA+processing+complex.">Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex.</a> RNA. 24 (5), 721-738 (2018).</li><li>Hu, W., Coller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+analysis+for+determining+mRNA+and+ribosome+association+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Polysome analysis for determining mRNA and ribosome association in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 530, 193-206 (2013).</li><li>He, S. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+analysis+of+mammalian+cells.">Polysome analysis of mammalian cells.</a> Methods in Enzymolog. 530, 183-192 (2013).</li><li>Anand, M., Chakraburtty, K., Marton, M. J., Hinnebusch, A. G., Kinzy, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+interactions+between+yeast+translation+eukaryotic+elongation+factor+(eEF)+1A+and+eEF3.">Functional interactions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6985-6991 (2003).</li><li>Serikawa, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptome+and+its+translation+during+recovery+from+cell+cycle+arrest+in+Saccharomyces+cerevisiae.">The transcriptome and its translation during recovery from cell cycle arrest in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cell Proteomics: MCP. 2 (3), 191-204 (2003).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li></ol>

यहां महंगे स्वचालित फ्रैक्शनेशन सिस्टम के उपयोग के बिना पॉलीसोम प्रोफाइल बनाने की एक विधि का वर्णन किया गया है। इस विधि का लाभ यह है कि यह पॉलीसोम प्रोफाइलिंग को उन प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ बनाता है ज?...

राइबोसोम मेगा-डाल्टन राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स हैं जो एमआरएनए को प्रोटीन में अनुवाद करने की मौलिक प्रक्रिया करते हैं। राइबोसोम एक कोशिका के भीतर सभी प्रोटीनों के संश्लेषण को पूरा करने के लिए जिम्मेदार हैं। यूकेरियोटिक राइबोसोम में उनके अवसादन गुणांक के अनुसार छोटे राइबोसोमल सबयूनिट (40 एस) और बड़े राइबोसोमल सबयूनिट (60 एस) के रूप में नामित दो सबयूनिट शामिल हैं। पूरी तरह से इकट्ठे राइबोसोम को 80 एस मोनोसोम के रूप में नामित किया गया है। पॉलीसोम राइबोसोम के समूह हैं जो एक एमआरएनए अणु का अनुवाद करने में लगे हुए हैं। सुक्रोज घनत्व प्रवणता सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा पॉलीसोम फ्रैक्शनेशन राइबोसोम प्रोफाइल बनाने, राइबोसोम का अनुवाद करने से जुड़े विशिष्ट एमआरएनए की पहचान करने और पॉलीसोम से जुड़े कारकों का विश्लेषण करने के लिए उपयोग की जाने वाली एक शक्तिशाली विधि है , 13. इस तकनीक का उपयोग अक्सर एकल राइबोसोम, राइबोसोमल सबयूनिट्स और मैसेंजर राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन कणों से पॉलीसोम को अलग करने के लिए किया जाता है। फ्रैक्शनेशन से प्राप्त प्रोफाइल पॉलीसोम 14 की अनुवाद गतिविधि और राइबोसोम 15,16,17 की असेंबली स्थिति के बारे में मूल्यवान जानकारी प्रदान कर सकते हैं।
राइबोसोम असेंबली प्रोटीन के एक समूह द्वारा सुगम एक बहुत ही जटिल प्रक्रिया है जिसे राइबोसोम असेंबली फैक्टर18,19,20,21 के रूप में जाना जाता है। ये कारक एटीपीस, एंडो- और एक्सो-न्यूक्लियस, जीटीपेस, आरएनए हेलिकेस और आरएनए बाइंडिंग प्रोटीन22 सहित कई अन्य प्रोटीनों के साथ बातचीत के माध्यम से राइबोसोम बायोजेनेसिस के दौरान कार्यों की एक विस्तृत श्रृंखला करते हैं। पॉलीसोम फ्रैक्शनेशन राइबोसोम असेंबली में इन कारकों की भूमिका की जांच करने के लिए उपयोग किया जाने वाला एक शक्तिशाली उपकरण रहा है। उदाहरण के लिए, इस विधि का उपयोग यह प्रदर्शित करने के लिए किया गया है कि पॉलीन्यूक्लियोटाइड किनेज जीआरसी 3, एक पूर्व-आरआरएनए प्रसंस्करण कारक में उत्परिवर्तन राइबोसोम असेंबली प्रक्रिया17,23 को नकारात्मक रूप से कैसे प्रभावित कर सकता है। पॉलीसोम प्रोफाइलिंग ने भी प्रकाश डाला है और दिखाया है कि एटीपीस रिक्स 7 के भीतर संरक्षित रूपांकन राइबोसोम उत्पादन16 के लिए आवश्यक हैं।
पॉलीसोम फ्रैक्शनेशन की प्रक्रिया रुचि की कोशिकाओं से घुलनशील सेल लाइसेट बनाने के साथ शुरू होती है। लाइसेट में आरएनए, राइबोसोमल सबयूनिट्स और पॉलीसोम, साथ ही अन्य घुलनशील सेलुलर घटक होते हैं। एक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब के भीतर एक निरंतर, रैखिक सुक्रोज ढाल बनाया जाता है। सेल लाइसेट के घुलनशील अंश को धीरे से सुक्रोज ग्रेडिएंट ट्यूब के शीर्ष पर लोड किया जाता है। लोडेड ग्रेडिएंट ट्यूब को तब सेंट्रीफ्यूजेशन के अधीन किया जाता है, जो गुरुत्वाकर्षण बल द्वारा सुक्रोज ढाल के भीतर आकार द्वारा सेलुलर घटकों को अलग करता है। बड़े घटक छोटे घटकों की तुलना में ढाल में आगे यात्रा करते हैं। ढाल के शीर्ष पर छोटे, धीमी गति से यात्रा करने वाले सेलुलर घटक होते हैं, जबकि बड़े, तेज यात्रा करने वाले सेलुलर घटक नीचे पाए जाते हैं। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, ट्यूब की सामग्री को अंशों के रूप में एकत्र किया जाता है। यह विधि प्रभावी रूप से राइबोसोमल सबयूनिट्स, मोनोसोम और पॉलीसोम को अलग करती है। प्रत्येक अंश का ऑप्टिकल घनत्व तब 254 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर वर्णक्रमीय अवशोषण को मापकर निर्धारित किया जाता है। अवशोषण बनाम अंश संख्या को प्लॉट करने से एक पॉलीसोम प्रोफ़ाइल उत्पन्न होती है।
रैखिक सुक्रोज घनत्व ग्रेडिएंट को ग्रेडिएंट निर्माता का उपयोग करके उत्पन्न किया जा सकता है। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, ग्रेडिएंट ्स को अक्सर अंशित किया जाता है, और एक स्वचालित घनत्व फ्रैक्शनेशन सिस्टम 3,7,13,24,25 का उपयोग करके अवशोषण मापा जाता है। जबकि ये सिस्टम पॉलीसोम प्रोफाइल का उत्पादन करने के लिए बहुत अच्छी तरह से काम करते हैं, वे महंगे हैं और कुछ प्रयोगशालाओं के लिए लागत-निषेधात्मक हो सकते हैं। यहां इन उपकरणों के उपयोग के बिना पॉलीसोम प्रोफाइल उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। इसके बजाय, यह प्रोटोकॉल आमतौर पर अधिकांश आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में उपलब्ध उपकरणों का उपयोग करता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automatic Fractionator</td>
			<td>Brandel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clariostar Multimode Plate Reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15508-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads, acid washed</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td>425&#8211;600 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, 1 M</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>CAC-5290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 22 G, Metal Hub</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>7748-08</td>
			<td>custom length 9 inches, point style 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XL-100K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Centrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Test Tube Peg Rack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-810-54A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q33228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit RNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Inhibitor</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N8080119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 3 mL</td>
			<td>Coviden</td>
			<td>888151394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, 1 M,&#160; pH 7.4</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Star Microplate, 96 wells</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655801</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polysome profiling without gradient makers or fractionation systems

सुक्रोज घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा पॉलीसोम फ्रैक्शनेशन एक शक्तिशाली उपकरण है जिसका उपयोग राइबोसोम प्रोफाइल बनाने, राइबोसोम द्वारा अनुवादित विशिष्ट एमआरएनए की पहचान करने और पॉलीसोम से जुड़े कारकों का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है। जबकि स्वचालित ढाल निर्माताओं और ढाल विभाजन प्रणालियों का उपयोग आमतौर पर इस तकनीक के साथ किया जाता है, ये सिस्टम आम तौर पर महंगे होते हैं और उन प्रयोगशालाओं के लिए लागत-निषेधात्मक हो सकते हैं जिनके पास सीमित संसाधन हैं या अपने शोध के लिए इस पद्धति को करने की उनकी असंगत या सामयिक आवश्यकता के कारण खर्च को सही नहीं ठहरा सकते हैं। यहां, विशेष विभाजन उपकरणों के बिना अधिकांश आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में उपलब्ध मानक उपकरणों का उपयोग करके पॉलीसोम प्रोफाइल उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। इसके अलावा, ग्रेडिएंट फ्रैक्शनेशन सिस्टम के साथ और बिना उत्पन्न पॉलीसोम प्रोफाइल की तुलना प्रदान की जाती है। प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पॉलीसोम प्रोफाइल को अनुकूलित करने और उत्पादन करने की रणनीतियों पर चर्चा की जाती है। इस प्रोटोकॉल में एक मॉडल जीव के रूप में सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया का उपयोग किया जाता है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल को कई अलग-अलग जीवों और सेल प्रकारों के लिए राइबोसोम प्रोफाइल उत्पन्न करने के लिए आसानी से संशोधित और अनुकूलित किया जा सकता है।

तीन प्रतिनिधि पॉलीसोम प्रोफाइल चित्रा 3 में दिखाए गए हैं। सभी प्रोफाइल एक ही खमीर तनाव से हैं। एक विशिष्ट पॉलीसोम प्रोफाइल में 40 एस, 60 एस और 80 एस राइबोसोमल सबयूनिट्स के साथ-साथ पॉलीसोम के लिए अ...

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Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

यह प्रोटोकॉल बताता है कि स्वचालित ढाल निर्माताओं या ढाल विभाजन प्रणालियों का उपयोग किए बिना पॉलीसोम प्रोफ़ाइल कैसे उत्पन्न करें।

ग्रेडिएंट मेकर्स या फ्रैक्शनेशन सिस्टम के बिना पॉलीसोम प्रोफाइलिंग

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

यह प्रोटोकॉल बताता है कि पॉलीसोम प्रोफाइल कैसे उत्पन्न किया जाए जो सेल के अंदर राइबोसोम की गतिविधि के बारे में आणविक विवरण प्रकट करता है। यह तकनीक उपयोगकर्ताओं को पॉलीसोम प्रोफ़ाइल द्वारा प्रदान की गई मूल्यवान जानकारी प्राप्त करने की अनुमति देती है, जिनके पास स्वचालित ढाल विभाजन प्रणालियों तक पहुंच नहीं है। ग्रेडिएंट तैयार करते समय अपना समय लें, और ग्रेडिएंट को एक ऐसे स्थान पर स्टोर करें जहां वे कंप्रेसर या अन्य यांत्रिक संचालन से बाधित नहीं होंगे क्योंकि वे एक रैखिक ढाल में बस जाते हैं।शुरू करने के लिए, सुक्रोज ग्रेडिएंट बफर में 7 और 47% सुक्रोज के स्टॉक समाधान तैयार करें। 0.22 माइक्रोन फ़िल्टर के माध्यम से सुक्रोज स्टॉक समाधान को फ़िल्टर करें। 7 और 47% स्टॉक समाधानों को वितरित और मिलाकर 17, 27 और 37% सुक्रोज समाधानों के 14 मिलीलीटर तैयार करें।छह पॉलीप्रोपाइलीन सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को एक पूर्ण दृश्य टेस्ट ट्यूब रैक में रखें। सुनिश्चित करें कि ट्यूबों के बीच पर्याप्त जगह है ताकि एक ट्यूब के साथ क्रियाएं दूसरों को परेशान न करें। तीन मिलीलीटर सिरिंज के साथ एक कुंद टिप के साथ नौ इंच, 22 गेज सुई संलग्न करें, और यह सुनिश्चित करने के लिए एक परीक्षण भरण और वितरण करें कि सिरिंज ग्रेडिएंट स्थापित करने से पहले बिना किसी टपकाए सुक्रोज समाधान को पकड़ सकती है।प्रत्येक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के निचले भाग में 7% सुक्रोज के दो मिलीलीटर जोड़ें। फिर, ट्यूब तल के तत्काल आसपास के क्षेत्र में सुई की नोक को रखकर, 7% समाधान के नीचे 17% सुक्रोज के दो मिलीलीटर जोड़ें। सावधानी से और धीरे-धीरे समाधान निकालें।प्रक्रिया को 27, 37 और 47% सुक्रोज समाधान में से प्रत्येक के दो मिलीलीटर के साथ दोहराएं, यह सुनिश्चित करते हुए कि प्रत्येक परत घनत्व के पृथक्करण को चिह्नित करने वाली रेखा द्वारा दूसरे से अलग है। ग्रेडिएंट्स को रात भर चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें ताकि वे सुक्रोज के निरंतर, बढ़ते प्रतिशत में बस सकें। खमीर के विकास और कटाई के बाद, सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया कोशिकाओं ने पॉलीसोम निष्कर्षण बफर के ठंडे 700 माइक्रोलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित कर दिया।आरएनएस अवरोधक की 100 इकाइयाँ जोड़ें। फिर, 425 से 600 माइक्रोन के अनुमानित आकार के साथ प्री-चिल्ड ग्लास बीड्स के 400 माइक्रोलीटर जोड़ें। मिश्रण को कांच के मोतियों के साथ 1.5 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और पांच मिनट के लिए एक मोती-बीटर में जोरदार आंदोलन द्वारा खमीर कोशिकाओं को बाधित करें।कोशिकाओं को बाधित करने के बाद, सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा लाइसेट को स्पष्ट करें। फ्लोरेसेंस-आधारित आरएनए डिटेक्शन सिस्टम का उपयोग करके, 260 नैनोमीटर पर अवशोषण को मापकर स्पष्ट लाइसेट में आरएनए की एकाग्रता निर्धारित करें। सुनिश्चित करें कि आरएनए एकाग्रता 0.5 से एक माइक्रोग्राम प्रति माइक्रोलीटर है।यदि आरएनए एकाग्रता बहुत कम है, तो कोशिकाओं को पुन: निलंबित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले निष्कर्षण बफर की मात्रा को कम करें। ग्रेडिएंट के शीर्ष पर लाइसेट को सावधानीपूर्वक लोड करें। पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब के शीर्ष पर आंतरिक दीवार के खिलाफ पिपेट टिप रखें।ट्यूब को कोण दें और धीरे-धीरे ढाल के शीर्ष पर लाइसेट को वितरित करें, दीवार के खिलाफ ड्रिबलिंग करें। धीरे से ट्यूबों को झूलती बाल्टी रोटर की पूर्व-ठंडी बाल्टी में रखें, और ग्रेडिएंट को सेंट्रीफ्यूज करें। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, स्विंगिंग बाल्टी रोटर से सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को सावधानीपूर्वक हटा दिया, और उन्हें ट्यूब होल्डर में रखें।अंशों को संग्रहीत करने और बर्फ पर पूर्व-ठंड लगाने के लिए 96-वेल प्लेटों को लेबल करें। ढाल के शीर्ष से शुरू होने वाले 100 या 200 माइक्रोलीटर अंशों को इकट्ठा करें, ढाल के शीर्ष में सावधानीपूर्वक एक पिपेट टिप डालकर, और अंशों को तब तक इकट्ठा करें जब तक कि पूरे ढाल को अलग नहीं किया जाता है। रिक्त स्थान के रूप में 7 और 47% सुक्रोज समाधानों के खिलाफ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ 254 नैनोमीटर पर प्रत्येक अंश के अवशोषण को मापें।अंश संख्या बनाम अवशोषण को प्लॉट करके पॉलीसोम प्रोफ़ाइल बनाएं। खमीर एस सेरेविसिया से तीन प्रतिनिधि पॉलीसोम प्रोफाइल दिखाए गए हैं। प्रत्येक राइबोसोमल सबयूनिट और पॉलीसोम पीक की शिखा प्रत्येक प्रोफ़ाइल पर स्पष्ट है।एक स्वचालित घनत्व विभाजन प्रणाली से एक प्रतिनिधि प्रोफ़ाइल यहां दिखाया गया है। यह प्रोफ़ाइल एक निरंतर अवशोषण प्रोफ़ाइल से उत्पन्न हुई थी क्योंकि सुक्रोज ढाल को डिटेक्टर प्रवाह सेल के माध्यम से पीछा समाधान द्वारा नीचे से ऊपर विस्थापित किया गया था और अंशों में एकत्र किया गया था। 200 और 100 माइक्रोलीटर नमूनों को हाथ से विभाजित करके उत्पन्न पॉलीसोम प्रोफाइल यहां दिखाया गया है।इस प्रक्रिया के साथ याद रखने वाली सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि ग्रेडिएंट को बाधित न करें। ध्यान रखें कि हवा के बुलबुले पेश न करें या बहुत तेजी से समाधान वितरित करके ढाल को बाधित न करें। इस प्रक्रिया के बाद, सक्रिय राइबोसोम के साथ जुड़े एमआरएनए को निर्धारित करने के लिए आगे के विश्लेषण के लिए ग्रेडिएंट से आरएनए निकाला जा सकता है

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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