Name: polysome profiling without gradient makers or fractionation systems
Uploaded: 2021-06-01T14:00:00
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저자들은 이 원고를 비판적으로 읽어준 Percy Tumbale 박사와 Melissa Wells 박사에게 감사를 표합니다. 이 연구는 미국 국립 보건원 교내 연구 프로그램의 지원을 받았습니다. 미국 국립 환경 보건 과학 연구소 (NIEHS; ZIA ES103247에서 R.E.S)로).

1. 7% - 47% 자당 구배의 제조
참고: 자당 구배의 선형 범위는 사용된 세포 유형에 따라 더 나은 분리를 달성하도록 수정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 S. cerevisiae의 폴리솜 프로파일에 최적화되어 있습니다.
<ol><li>슈크로스 구배 완충액 (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 60 mM KCl, 10 mMMgCl2 및 1 mM DTT) 중에서 7% 및 47% 슈크로스의 스톡 용액을 준비한다. 필터는 0.22 μm 필터를 통해 슈?...

<ol>
	<li>Choi, A., Barrientos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sucrose+gradient+sedimentation+analysis+of+mitochondrial+ribosomes.">Sucrose gradient sedimentation analysis of mitochondrial ribosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 2192, 211-226 (2021).</li><li>Dos Santos, R. F., Barria, C., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+analysis+of+bacterial+ribosomes+through+sucrose+gradient+ultracentrifugation.">Isolation and analysis of bacterial ribosomes through sucrose gradient ultracentrifugation.</a> Methods in Molecular Biology. 2106, 299-310 (2020).</li><li>Pringle, E. S., McCormick, C., Cheng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+profiling+analysis+of+mRNA+and+associated+proteins+engaged+in+translation.">Polysome profiling analysis of mRNA and associated proteins engaged in translation.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 125 (1), 79 (2019).</li><li>Liang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome-profiling+in+small+tissue+samples.">Polysome-profiling in small tissue samples.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 3 (2018).</li><li>Karamysheva, Z. 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Y., Xiao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Integrated+polysome+profiling+and+ribosome+profiling+method+to+investigate+in+vivo+translatome.">An Integrated polysome profiling and ribosome profiling method to investigate in vivo translatome.</a> Methods in Molecular Biology. 1712, 1-18 (2018).</li><li>Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+translation+using+polysome+profiling.">Analysis of translation using polysome profiling.</a> Nucleic Acids Research. 45 (3), 15 (2017).</li><li>Aboulhouda, S., Di Santo, R., Therizols, G., Weinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate,+streamlined+analysis+of+mrna+translation+by+sucrose+gradient+fractionation.">Accurate, streamlined analysis of mrna translation by sucrose gradient fractionation.</a> Bio-protocol. 7 (19), 2573 (2017).</li><li>Kudla, M., Karginov, F. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+essential+ribosome+assembly+AAA-ATPase+Rix7.">Cryo-EM structure of the essential ribosome assembly AAA-ATPase Rix7.</a> Nature Communications. 10 (1), 513 (2019).</li><li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grc3+programs+the+essential+endoribonuclease+Las1+for+specific+RNA+cleavage.">Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 5530-5538 (2017).</li><li>Woolford, J. L., Baserga, S. 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Molecular Cell Biology. 20 (2), 116-131 (2018).</li><li>Bassler, J., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+ribosome+assembly.">Eukaryotic ribosome assembly.</a> Annual Review of Biochemistry. 88, 281-306 (2019).</li><li>Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+puzzle+of+life:+Crafting+ribosomal+subunits.">A puzzle of life: Crafting ribosomal subunits.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 640-654 (2017).</li><li>Prattes, M., Lo, Y. H., Bergler, H., Stanley, R. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+molecular+crosstalk+within+the+essential+Grc3/Las1+pre-rRNA+processing+complex.">Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex.</a> RNA. 24 (5), 721-738 (2018).</li><li>Hu, W., Coller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+analysis+for+determining+mRNA+and+ribosome+association+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Polysome analysis for determining mRNA and ribosome association in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 530, 193-206 (2013).</li><li>He, S. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+analysis+of+mammalian+cells.">Polysome analysis of mammalian cells.</a> Methods in Enzymolog. 530, 183-192 (2013).</li><li>Anand, M., Chakraburtty, K., Marton, M. J., Hinnebusch, A. G., Kinzy, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+interactions+between+yeast+translation+eukaryotic+elongation+factor+(eEF)+1A+and+eEF3.">Functional interactions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6985-6991 (2003).</li><li>Serikawa, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptome+and+its+translation+during+recovery+from+cell+cycle+arrest+in+Saccharomyces+cerevisiae.">The transcriptome and its translation during recovery from cell cycle arrest in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cell Proteomics: MCP. 2 (3), 191-204 (2003).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li></ol>

여기에서는 값비싼 자동 분별 시스템을 사용하지 않고 폴리솜 프로파일을 생성하는 방법이 설명되었습니다. 이 방법의 장점은 자동화된 분획 시스템이 없는 실험실에서 폴리솜 프로파일링에 액세스할 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜의 주요 단점은 지루한 손 분획과 전용 밀도 분별 시스템에 비해 감도가 감소한다는 것입니다.
이 프로토콜은 리보솜 서브 유닛, 모노 솜 및 ?...

리보솜은 mRNA를 단백질로 번역하는 기본 과정을 수행하는 메가 달튼 리보 핵 단백질 복합체입니다. 리보솜은 세포 내의 모든 단백질 합성을 수행하는 역할을합니다. 진핵 생물 리보솜은 침강 계수에 따라 작은 리보솜 소단위 (40S)와 큰 리보솜 소단위 (60S)로 지정된 두 개의 하위 단위로 구성됩니다. 완전히 조립 된 리보솜은 80S 모노 솜으로 지정됩니다. 폴리솜은 단일 mRNA 분자를 번역하는 데 관여하는 리보솜 그룹입니다. 자당 밀도 구배 원심분리에 의한 폴리솜 분획은 리보솜 프로파일을 생성하고, 리보솜 번역과 관련된 특정 mRNA를 식별하고, 폴리솜 관련 인자 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12를 분석하는 데 사용되는 강력한 방법입니다. ,13. 이 기술은 종종 단일 리보솜, 리보솜 서브 유닛 및 메신저 리보 핵 단백질 입자에서 폴리 솜을 분리하는 데 사용됩니다. 분획으로부터 수득된 프로파일은 폴리솜(14)의 번역 활성 및 리보솜(15,16,17)의 조립 상태에 관한 귀중한 정보를 제공할 수 있다.
리보솜 조립은 리보솜 조립 인자18,19,20,21로 알려진 단백질 그룹에 의해 촉진되는 매우 복잡한 과정입니다. 이들 인자는 ATPases, endo- 및 exo-뉴클레아제, GTPases, RNA 헬리카제 및 RNA 결합 단백질(22)을 포함하는 많은 다른 단백질과의 상호작용을 통해 리보솜 생물발생 동안 광범위한 기능을 수행한다. 폴리솜 분획은 리보솜 조립에서 이러한 요인의 역할을 조사하는 데 사용되는 강력한 도구였습니다. 예를 들어, 이 방법은 프리-rRNA 프로세싱 인자인 폴리뉴클레오티드 키나아제 Grc3에서의 돌연변이가 리보솜 조립 공정(17,23)에 어떻게 부정적인 영향을 미칠 수 있는지를 입증하기 위해 활용되었다. 폴리솜 프로파일링은 또한 ATPase Rix7 내의 보존된 모티프가 리보솜 생산에 어떻게 필수적인지를 강조하고 보여주었다(16).
폴리솜 분획 절차는 관심 세포로부터 용해성 세포 용해물을 만드는 것으로 시작됩니다. 용해물은 RNA, 리보솜 서브 유닛 및 폴리 솜뿐만 아니라 다른 가용성 세포 성분을 포함합니다. 연속적인 선형 자당 구배는 초원심분리기 튜브 내에서 만들어집니다. 세포 용해물의 가용성 분획은 자당 구배 튜브의 상부에 부드럽게 적재된다. 그런 다음 로드된 그래디언트 튜브는 원심분리를 거쳐 중력에 의해 자당 그래디언트 내에서 크기에 따라 세포 구성 요소를 분리합니다. 큰 구성 요소는 작은 구성 요소보다 기울기로 더 멀리 이동합니다. 그라디언트의 상단에는 더 작고 느리게 이동하는 셀룰러 구성 요소가 있는 반면, 더 크고 빠르게 이동하는 셀룰러 구성 요소는 하단에 있습니다. 원심 분리 후, 튜브의 내용물은 분획으로 수집된다. 이 방법은 리보솜 서브 유닛, 모노 솜 및 폴리 솜을 효과적으로 분리합니다. 각 분획의 광학 밀도는 254 nm의 파장에서 스펙트럼 흡광도를 측정하여 결정됩니다. 흡광도 대 분수 수를 플로팅하면 폴리솜 프로파일이 생성됩니다.
선형 자당 밀도 구배는 그래디언트 메이커를 사용하여 생성할 수 있습니다. 원심분리 후, 구배는 종종 분획되고, 흡광도는 자동 밀도 분별 시스템 3,7,13,24,25를 사용하여 측정된다. 이러한 시스템은 폴리솜 프로파일을 생성하는 데 매우 잘 작동하지만 비용이 많이 들고 일부 실험실에서는 비용이 많이 들 수 있습니다. 여기에서는 이러한 기기를 사용하지 않고 폴리솜 프로파일을 생성하는 프로토콜이 제시됩니다. 대신, 이 프로토콜은 대부분의 분자 생물학 실험실에서 일반적으로 사용할 수 있는 장비를 활용합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automatic Fractionator</td>
			<td>Brandel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clariostar Multimode Plate Reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15508-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads, acid washed</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td>425&#8211;600 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, 1 M</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>CAC-5290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 22 G, Metal Hub</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>7748-08</td>
			<td>custom length 9 inches, point style 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XL-100K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Centrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Test Tube Peg Rack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-810-54A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q33228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit RNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Inhibitor</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N8080119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 3 mL</td>
			<td>Coviden</td>
			<td>888151394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, 1 M,&#160; pH 7.4</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Star Microplate, 96 wells</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655801</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polysome profiling without gradient makers or fractionation systems

자당 밀도 구배 원심분리에 의한 폴리솜 분획은 리보솜 프로파일을 생성하고, 리보솜에 의해 번역되는 특정 mRNA를 식별하고, 폴리솜 관련 인자를 분석하는 데 사용할 수 있는 강력한 도구입니다. 자동화된 그래디언트 메이커와 그래디언트 분획 시스템이 일반적으로 이 기술과 함께 사용되지만 이러한 시스템은 일반적으로 비용이 많이 들고 자원이 제한되어 있거나 연구를 위해 이 방법을 드물게 또는 가끔 수행해야 하기 때문에 비용을 정당화할 수 없는 실험실의 경우 비용이 많이 들 수 있습니다. 여기에서는 특수 분획 기기 없이 대부분의 분자 생물학 실험실에서 사용할 수 있는 표준 장비를 사용하여 폴리솜 프로파일을 재현 가능하게 생성하는 프로토콜이 제시됩니다. 더욱이, 그래디언트 분별 시스템의 유무에 관계없이 생성된 폴리솜 프로파일의 비교가 제공된다. 재현 가능한 폴리솜 프로파일을 최적화하고 생산하기 위한 전략이 논의됩니다. 사카로미세스 세레비시아는 이 프로토콜에서 모델 유기체로 활용됩니다. 그러나 이 프로토콜은 다양한 유기체 및 세포 유형에 대한 리보솜 프로파일을 생성하도록 쉽게 수정 및 조정할 수 있습니다.

세 가지 대표적인 폴리솜 프로파일이 그림 3에 나와 있습니다. 모든 프로파일은 동일한 효모 균주에서 추출됩니다. 일반적인 폴리솜 프로파일은 40S, 60S 및 80S 리보솜 서브유닛과 폴리솜에 대해 잘 분해된 피크를 갖습니다. 각 리보솜 서브 유닛의 마루와 폴리솜 피크는 각 프로파일에서 분명합니다 (그림 3). 자동화된 밀도 분별 시스템으로부터의 대표적...

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Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

이 프로토콜은 자동화된 그래디언트 메이커 또는 그래디언트 분별 시스템을 사용하지 않고 폴리솜 프로파일을 생성하는 방법을 설명합니다.

그래디언트 메이커 또는 분획 시스템이 없는 폴리솜 프로파일링

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

이 프로토콜은 세포 내부의 리보솜 활동에 대한 분자 세부 사항을 나타내는 폴리솜 프로파일을 생성하는 방법을 설명합니다. 이 기술을 통해 사용자는 자동화된 그래디언트 분획 시스템에 액세스할 수 없는 폴리솜 프로파일에서 제공하는 귀중한 정보를 얻을 수 있습니다. 그래디언트를 준비하는 동안 시간을 할애하고 그래디언트가 선형 그래디언트로 정착할 때 압축기 또는 기타 기계적 작동에 의해 중단되지 않는 위치에 그래디언트를 보관하십시오.시작하려면 자당 구배 완충액에 7 및 47 % 자당의 스톡 용액을 준비하십시오. 필터는 0.22 미크론 필터를 통해 자당 스톡 용액을 살균합니다. 14 밀리리터의 17, 27 및 37 % 스톡 용액을 분주하고 혼합하여 47 밀리리터의 7 및 47 % 자당 용액을 준비하십시오.6개의 폴리프로필렌 원심분리기 튜브를 전체 보기 시험관 랙에 넣습니다. 한 튜브의 동작이 다른 튜브를 방해하지 않도록 튜브 사이에 충분한 공간이 있는지 확인하십시오. 끝이 뭉툭한 9인치, 22게이지 바늘을 3밀리리터 주사기에 부착하고 테스트 채우기 및 분배를 수행하여 주사기가 그라디언트를 설정하기 전에 물방울 없이 자당 용액을 담을 수 있는지 확인합니다.각 원심 분리기 튜브의 바닥에 7 % 자당 2 밀리리터를 추가하십시오. 그런 다음 바늘 끝을 튜브 바닥 바로 근처에 위치시켜 7% 용액 아래에 17% 자당 2밀리리터를 추가합니다. 조심스럽게 천천히 용액을 분배하십시오.27, 37 및 47 % 자당 용액 각각 2 밀리리터로 절차를 반복하여 각 층이 밀도 분리를 표시하는 선으로 서로 구별 될 수 있도록합니다. 그라디언트를 밤새 섭씨 4도에 보관하여 연속적이고 증가하는 자당 비율로 정착할 수 있도록 합니다. 효모의 성장 및 수확 후, 사카로마이세스 세레비지애 세포는 세포를 700 마이크로리터의 폴리솜 추출 완충액에 재현탁시킨다.RNAse 억제제 100 단위를 추가하십시오. 그런 다음 대략 425-600 미크론 크기의 사전 냉각 유리 비드 400 마이크로 리터를 추가하십시오. 혼합물을 유리 비드와 함께 1.5 밀리리터 원심분리 튜브로 옮기고, 비드 비터에서 5분 동안 격렬하게 교반하여 효모 세포를 파괴한다.세포를 파쇄한 후, 원심분리에 의해 용해물을 명확히 한다. 형광 기반 RNA 검출 시스템을 이용하여 260 나노미터에서 흡광도를 측정하여 정제된 용해물 내의 RNA 농도를 결정한다. RNA 농도가 마이크로리터당 0.5 내지 1마이크로그램인지 확인하십시오.RNA 농도가 너무 낮으면 세포를 재현탁하는 데 사용되는 추출 완충액의 부피를 줄입니다. 용해물을 그라디언트 상단에 조심스럽게 로드합니다. 피펫 팁을 폴리프로필렌 튜브 상단의 내벽에 대고 놓습니다.튜브의 각도를 맞추고 용해물을 그라디언트 상단에 천천히 분배하여 벽에 드리블합니다. 스윙 버킷 로터의 사전 냉각된 버킷에 튜브를 부드럽게 넣고 그라디언트를 원심분리합니다. 원심 분리 후 스윙 버킷 로터에서 원심 분리 튜브를 조심스럽게 제거하고 튜브 홀더에 넣습니다.96웰 플레이트에 라벨을 붙여 분획을 저장하고 얼음에 미리 식힙니다. 그래디언트 상단에서 시작하여 피펫 팁을 그래디언트 상단에 조심스럽게 삽입하고 전체 그래디언트가 분획될 때까지 분수를 수집하여 그래디언트 상단에서 시작하여 100 또는 200마이크로리터 분획을 수집합니다. 분광 광도계로 254 나노 미터에서 각 분획의 흡광도를 블랭크로 7 및 47 % 자당 용액에 대해 측정합니다.분수 대 흡광도를 플로팅하여 폴리솜 프로파일을 만듭니다. 효모 S.Cerevisiae로부터의 3개의 대표적인 폴리솜 프로파일이 도시되어 있다. 각 리보솜 서브 유닛과 폴리 솜 피크의 볏은 각 프로파일에서 분명합니다.자동화된 밀도 분별 시스템의 대표적인 프로파일이 여기에 표시됩니다. 이 프로파일은 슈크로스 구배가 체이스 용액에 의해 아래에서 위로 변위되고, 검출기 유동 셀을 통해 분획으로 수집됨에 따라 연속 흡광도 프로파일로부터 생성되었다. 200 및 100 마이크로리터 샘플을 손으로 분획하여 생성된 폴리솜 프로파일이 여기에 나와 있습니다.이 절차에서 기억해야 할 가장 중요한 것은 그라디언트를 방해하지 않는 것입니다. 기포가 유입되거나 용액을 너무 빨리 분배하여 그래디언트를 방해하지 않도록 주의하십시오. 이 절차에 따라 활성 리보솜과 관련된 mRNA를 결정하기 위해 추가 분석을 위해 구배에서 RNA를 추출할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

뇌막 분획 화 :<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Subsynaptic Protein Localization 평가 방법

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

연구

생화학

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

가용성과 불용 성 Huntingtin의 해상도 대 한 분류

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Leishmania, 인간 세포 및 마우스 고환에서 프로 파일링

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

작은 GTPase Prenylation와 GTP 바인딩 사용 하 여 막 분류 및 GTPase 연결 된 Immunosorbent 분석 결과의 검색

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

인공 비 계 없이 안정적인 3D 셀룰러 어셈블리를 생성 하는 살아있는 세포를 조작

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

생물 검정 기반 분류를 사용 하 여 바다 심고 페로몬의 식별

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

고속 원심 분리의 부재에서 U937 세포의 세포 분별 법

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

안지오텐신 II에 의해 설명 니트로 펩티드 프로파일링 및 식별

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

네이티브 오토플루임션을 기반으로 sFLIM에 의한 식물 섹션의 형광 프로브와 리그닌 간의 상호 작용 측정

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

BN-MS 분석에 의한 고분해능 컴플렉스 프로파일링

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...