Name: polysome profiling without gradient makers or fractionation systems
Uploaded: 2021-06-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems at JoVE.com

Forfatterne takker Dr. Percy Tumbale og Dr. Melissa Wells for deres kritiske lesning av dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av US National Institute of Health Intramural Research Program; Us National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS; ZIA ES103247 til R.E.S).

1. Fremstilling av 7% - 47% sukrosegradienter
MERK: Det lineære området for sukrosegradienten kan modifiseres for å oppnå bedre separasjon avhengig av celletypen som brukes. Denne protokollen er optimalisert for polysomprofiler for S. cerevisiae.
<ol><li>Forbered stamløsninger på 7 % og 47 % sukrose i sukrosegradientbuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2 og 1 mM DTT). Filter steriliser sukrosepulverløsningene gjennom et 0,22 μm filter og oppbevar ve...

<ol>
	<li>Choi, A., Barrientos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sucrose+gradient+sedimentation+analysis+of+mitochondrial+ribosomes.">Sucrose gradient sedimentation analysis of mitochondrial ribosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 2192, 211-226 (2021).</li><li>Dos Santos, R. F., Barria, C., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+analysis+of+bacterial+ribosomes+through+sucrose+gradient+ultracentrifugation.">Isolation and analysis of bacterial ribosomes through sucrose gradient ultracentrifugation.</a> Methods in Molecular Biology. 2106, 299-310 (2020).</li><li>Pringle, E. S., McCormick, C., Cheng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+profiling+analysis+of+mRNA+and+associated+proteins+engaged+in+translation.">Polysome profiling analysis of mRNA and associated proteins engaged in translation.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 125 (1), 79 (2019).</li><li>Liang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome-profiling+in+small+tissue+samples.">Polysome-profiling in small tissue samples.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 3 (2018).</li><li>Karamysheva, Z. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+profiling+in+leishmania,+human+cells+and+mouse+testis.">Polysome profiling in leishmania, human cells and mouse testis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e57600 (2018).</li><li>Jin, H. Y., Xiao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Integrated+polysome+profiling+and+ribosome+profiling+method+to+investigate+in+vivo+translatome.">An Integrated polysome profiling and ribosome profiling method to investigate in vivo translatome.</a> Methods in Molecular Biology. 1712, 1-18 (2018).</li><li>Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+translation+using+polysome+profiling.">Analysis of translation using polysome profiling.</a> Nucleic Acids Research. 45 (3), 15 (2017).</li><li>Aboulhouda, S., Di Santo, R., Therizols, G., Weinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate,+streamlined+analysis+of+mrna+translation+by+sucrose+gradient+fractionation.">Accurate, streamlined analysis of mrna translation by sucrose gradient fractionation.</a> Bio-protocol. 7 (19), 2573 (2017).</li><li>Kudla, M., Karginov, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mRNA+translation+by+polysome+profiling.">Measuring mRNA translation by polysome profiling.</a> Methods in Molecular Biology. 1421, 127-135 (2016).</li><li>Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+selective+mRNA+translation+in+mammalian+cells+by+polysome+profiling.">Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e52295 (2014).</li><li>Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+translation+initiation+during+stress+conditions+by+polysome+profiling.">Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51164 (2014).</li><li>Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+fractionation+to+analyze+mRNA+distribution+profiles.">Polysome fractionation to analyze mRNA distribution profiles.</a> Bio-protocol. 7 (3), 2126 (2017).</li><li>Chikashige, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gcn2+eIF2alpha+kinase+mediates+combinatorial+translational+regulation+through+nucleotide+motifs+and+uORFs+in+target+mRNAs.">Gcn2 eIF2alpha kinase mediates combinatorial translational regulation through nucleotide motifs and uORFs in target mRNAs.</a> Nucleic Acids Research. 48 (16), 8977-8992 (2020).</li><li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+footprint+profiling+of+translation+throughout+the+genome.">Ribosome footprint profiling of translation throughout the genome.</a> Cell. 165 (1), 22-33 (2016).</li><li>Ripmaster, T. L., Vaughn, G. P., Woolford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DRS1+to+DRS7,+novel+genes+required+for+ribosome+assembly+and+function+in+Saccharomyces+cerevisiae.">DRS1 to DRS7, novel genes required for ribosome assembly and function in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7901-7912 (1993).</li><li>Lo, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+essential+ribosome+assembly+AAA-ATPase+Rix7.">Cryo-EM structure of the essential ribosome assembly AAA-ATPase Rix7.</a> Nature Communications. 10 (1), 513 (2019).</li><li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grc3+programs+the+essential+endoribonuclease+Las1+for+specific+RNA+cleavage.">Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 5530-5538 (2017).</li><li>Woolford, J. L., Baserga, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+biogenesis+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).</li><li>Klinge, S., Woolford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+assembly+coming+into+focus.">Ribosome assembly coming into focus.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (2), 116-131 (2018).</li><li>Bassler, J., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+ribosome+assembly.">Eukaryotic ribosome assembly.</a> Annual Review of Biochemistry. 88, 281-306 (2019).</li><li>Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+puzzle+of+life:+Crafting+ribosomal+subunits.">A puzzle of life: Crafting ribosomal subunits.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 640-654 (2017).</li><li>Prattes, M., Lo, Y. H., Bergler, H., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+the+nascent+ribosome:+AAA-ATPases+in+eukaryotic+ribosome+biogenesis.">Shaping the nascent ribosome: AAA-ATPases in eukaryotic ribosome biogenesis.</a> Biomolecules. 9 (11), 715 (2019).</li><li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+molecular+crosstalk+within+the+essential+Grc3/Las1+pre-rRNA+processing+complex.">Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex.</a> RNA. 24 (5), 721-738 (2018).</li><li>Hu, W., Coller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+analysis+for+determining+mRNA+and+ribosome+association+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Polysome analysis for determining mRNA and ribosome association in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 530, 193-206 (2013).</li><li>He, S. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+analysis+of+mammalian+cells.">Polysome analysis of mammalian cells.</a> Methods in Enzymolog. 530, 183-192 (2013).</li><li>Anand, M., Chakraburtty, K., Marton, M. J., Hinnebusch, A. G., Kinzy, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+interactions+between+yeast+translation+eukaryotic+elongation+factor+(eEF)+1A+and+eEF3.">Functional interactions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6985-6991 (2003).</li><li>Serikawa, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptome+and+its+translation+during+recovery+from+cell+cycle+arrest+in+Saccharomyces+cerevisiae.">The transcriptome and its translation during recovery from cell cycle arrest in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cell Proteomics: MCP. 2 (3), 191-204 (2003).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li></ol>

Her er det beskrevet en metode for å lage polysomprofiler uten bruk av dyre automatiserte fraksjoneringssystemer. Fordelen med denne metoden er at den gjør polysomprofilering tilgjengelig for laboratorier som ikke har automatiserte fraksjoneringssystemer. De største ulempene med denne protokollen er kjedelig håndfraksjonering og redusert følsomhet sammenlignet med det dedikerte tetthetsfraksjoneringssystemet.
Denne protokollen innebærer nøye fremstilling av sukrosegradienter med oppløs...

Ribosomer er mega-Dalton ribonukleoproteinkomplekser som utfører den grunnleggende prosessen med å oversette mRNA til proteiner. Ribosomer er ansvarlige for å utføre syntesen av alle proteiner i en celle. Eukaryote ribosomer består av to underenheter betegnet som den lille ribosomale underenheten (40S) og den store ribosomale underenheten (60S) i henhold til deres sedimenteringskoeffisienter. Det fullt monterte ribosomet er betegnet som 80S-monosomet. Polysomer er grupper av ribosomer engasjert i å oversette et enkelt mRNA-molekyl. Polysomfraksjonering ved sukrosetetthetsgradientsentrifugering er en kraftig metode som brukes til å lage ribosomprofiler, identifisere spesifikke mRNA assosiert med å oversette ribosomer og analysere polysomassosierte faktorer 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ,13. Denne teknikken brukes ofte til å skille polysomer fra enkle ribosomer, ribosomale underenheter og messenger ribonukleoproteinpartikler. Profilene hentet fra fraksjonering kan gi verdifull informasjon om oversettelsesaktiviteten til polysomer14 og monteringsstatusen til ribosomene15,16,17.
Ribosommontering er en svært kompleks prosess tilrettelagt av en gruppe proteiner kjent som ribosommonteringsfaktorer 18,19,20,21. Disse faktorene utfører et bredt spekter av funksjoner under ribosombiogenese gjennom interaksjoner med mange andre proteiner, inkludert ATPaser, endo- og ekso-nukleaser, GTPaser, RNA-helikaser og RNA-bindende proteiner22. Polysomfraksjonering har vært et kraftig verktøy som brukes til å undersøke rollen til disse faktorene i ribosommontering. For eksempel har denne metoden blitt brukt til å demonstrere hvordan mutasjoner i polynukleotidkinasen Grc3, en pre-rRNA-prosesseringsfaktor, kan påvirke ribosommonteringsprosessen negativt 17,23. Polysomprofilering har også fremhevet og vist hvordan de konserverte motivene i ATPase Rix7 er essensielle for ribosomproduksjon16.
Prosedyren for polysomfraksjonering begynner med å lage oppløselige cellelysater fra celler av interesse. Lysatet inneholder RNA, ribosomale underenheter og polysomer, samt andre oppløselige cellulære komponenter. En kontinuerlig, lineær sukrosegradient er laget i et ultracentrifugerør. Den løselige fraksjonen av cellelysat lastes forsiktig på toppen av sukrosegradientrøret. Det belastede gradientrøret blir deretter utsatt for sentrifugering, som skiller de cellulære komponentene etter størrelse i sukrosegradienten med tyngdekraften. De større komponentene beveger seg lenger inn i gradienten enn de mindre komponentene. Toppen av gradienten huser de mindre, langsommere reisende cellulære komponentene, mens de større, raskere reisende cellulære komponentene finnes nederst. Etter sentrifugering oppsamles innholdet i røret som fraksjoner. Denne metoden separerer effektivt ribosomale underenheter, monosomer og polysomer. Den optiske tettheten til hver fraksjon bestemmes deretter ved å måle spektralabsorbansen ved en bølgelengde på 254 nm. Plotting av absorbans vs. brøktall gir en polysomprofil.
Lineære sukrose tetthet gradienter kan genereres ved hjelp av en gradient maker. Etter sentrifugering blir gradienter ofte fraksjonert, og absorbanser målt ved hjelp av et automatisert tetthetsfraksjoneringssystem 3,7,13,24,25. Selv om disse systemene fungerer veldig bra for å produsere polysomprofiler, er de dyre og kan være kostnadsoverkommelige for noen laboratorier. Her presenteres en protokoll for å generere polysomprofiler uten bruk av disse instrumentene. I stedet bruker denne protokollen utstyr som vanligvis er tilgjengelig i de fleste molekylærbiologiske laboratorier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automatic Fractionator</td>
			<td>Brandel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clariostar Multimode Plate Reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15508-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads, acid washed</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td>425&#8211;600 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, 1 M</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>CAC-5290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 22 G, Metal Hub</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>7748-08</td>
			<td>custom length 9 inches, point style 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XL-100K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Centrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Test Tube Peg Rack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-810-54A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q33228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit RNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Inhibitor</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N8080119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 3 mL</td>
			<td>Coviden</td>
			<td>888151394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, 1 M,&#160; pH 7.4</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Star Microplate, 96 wells</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655801</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polysome profiling without gradient makers or fractionation systems

Polysomfraksjonering ved sukrosetetthetsgradient sentrifugering er et kraftig verktøy som kan brukes til å lage ribosomprofiler, identifisere spesifikke mRNA som oversettes av ribosomer, og analysere polysomassosierte faktorer. Mens automatiserte gradientprodusenter og gradientfraksjoneringssystemer ofte brukes med denne teknikken, er disse systemene generelt dyre og kan være kostnadsoverkommelige for laboratorier som har begrensede ressurser eller ikke kan rettferdiggjøre utgiftene på grunn av deres sjeldne eller sporadiske behov for å utføre denne metoden for deres forskning. Her presenteres en protokoll for å reprodusere polysomprofiler ved hjelp av standardutstyr som er tilgjengelig i de fleste molekylærbiologiske laboratorier uten spesialiserte fraksjoneringsinstrumenter. Videre er det gitt en sammenligning av polysomprofiler generert med og uten et gradientfraksjoneringssystem. Strategier for å optimalisere og produsere reproduserbare polysomprofiler diskuteres. Saccharomyces cerevisiae brukes som en modellorganisme i denne protokollen. Imidlertid kan denne protokollen enkelt modifiseres og tilpasses for å generere ribosomprofiler for mange forskjellige organismer og celletyper.

Tre representative polysomprofiler er vist i figur 3. Alle profilene er fra samme gjærstamme. En typisk polysomprofil vil ha veloppløste topper for 40S, 60S og 80S ribosomale underenheter samt polysomer. Toppen av hver ribosomale underenhet og polysomtopp vil være tydelig på hver profil (figur 3). En representativ profil fra et automatisert tetthetsfraksjoneringssystem er vist i figur 3A. Sukrosegradientene som ble brukt til å ...

Watch this Scientific Journal Video about Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems at JoVE.com

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Denne protokollen beskriver hvordan du genererer en polysomprofil uten å bruke automatiserte gradientopprettere eller gradientfraksjoneringssystemer.

Polysomprofilering uten gradientopprettere eller fraksjoneringssystemer

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

Denne protokollen beskriver hvordan man genererer en polysomprofil som avslører molekylære detaljer om aktiviteten til ribosomer inne i cellen. Denne teknikken lar brukerne få verdifull informasjon fra en polysomprofil, som ikke har tilgang til automatiserte gradientfraksjoneringssystemer. Ta deg god tid mens du forbereder gradienter, og lagre gradienter på et sted der de ikke vil bli forstyrret av en kompressor eller andre mekaniske operasjoner som de bosette seg i en lineær gradient.Til å begynne med, klargjør lagerløsninger på 7 og 47% sukrose i sukrosegradientbuffer. Filter steriliser sukroselagerløsningene gjennom et 0,22 mikron filter. Forbered 14 milliliter 17, 27 og 37% sukroseløsninger ved å dispensere og blande 7 og 47% lagerløsninger.Plasser seks polypropylen sentrifuge rør i en full visning reagensrør rack. Sørg for at det er nok plass mellom rørene slik at handlingene med ett rør ikke forstyrrer de andre. Fest en ni tommers, 22 gauge nål med en stump spiss til en tre milliliter sprøyte, og utfør en testfylling og dispensering for å sikre at sprøyten kan holde sukroseoppløsningen uten drypp før du setter opp gradientene.Tilsett to milliliter av 7% sukrose til bunnen av hvert sentrifugerør. Deretter legger du til to milliliter av 17% sukrose under 7%-løsningen, ved å plassere nålespissen i umiddelbar nærhet av rørbunnen. Dispenser oppløsningen forsiktig og sakte.Gjenta prosedyren med to milliliter hver av 27, 37 og 47% sukroseløsningen, slik at hvert lag kan skilles fra hverandre med en linje som markerer separasjonen av tettheter. Oppbevar gradientene ved fire grader Celsius over natten for å tillate dem å bosette seg i en kontinuerlig, økende prosentandel av sukrose. Etter vekst og høsting av gjær, Saccharomyces cerevisiae-celler, resuspenderer cellene i kjølte 700 mikroliter polysomekstraksjonsbuffer.Legg til 100 enheter RNAse Inhibitor. Deretter tilsettes 400 mikroliter forkjølte glassperler med en omtrentlig størrelse på 425 til 600 mikron. Overfør blandingen til et 1,5 milliliter sentrifugerør med glassperlene, og forstyrr gjærcellene ved kraftig omrøring i en perle-beater i fem minutter.Etter å ha forstyrret cellene, klargjør lysatet ved sentrifugering. Bestem konsentrasjonen av RNA i det klargjorte lysatet ved å måle absorbansen ved 260 nanometer, ved hjelp av et fluorescensbasert RNA-deteksjonssystem. Sørg for at RNA-konsentrasjonen er 0,5 til ett mikrogram per mikroliter.Hvis RNA-konsentrasjonen er for lav, reduser volumet av ekstraksjonsbuffer som brukes til å resuspendere cellene. Legg lysatet forsiktig på toppen av gradientene. Plasser pipettespissen mot den indre veggen på toppen av polypropylenrøret.Vinkle røret og dispenser lysatet sakte på toppen av gradienten, dribling mot veggen. Plasser rørene forsiktig i de forkjølte bøttene til en svingende bøtterotor, og sentrifuger gradientene. Etter sentrifugering, fjern forsiktig sentrifugerørene fra den svingende bøtterotoren, og legg dem i en rørholder.Merk 96-brønnsplatene for å lagre fraksjonene og forkjøle på is. Samle 100 eller 200 mikroliter fraksjoner som starter fra toppen av gradienten, ved å forsiktig sette inn en pipettespiss i toppen av gradienten, og samle fraksjonene til hele gradienten er aliquoted. Mål absorbansen til hver fraksjon ved 254 nanometer med et spektrofotometer mot 7 og 47% sukroseløsninger som emner.Opprett polysomprofilen ved å plotte brøktall versus absorbans. Tre representative polysomprofiler fra gjær S.Cerevisiae, vises. Toppen av hver ribosomale underenhet og polysomtopp er tydelig på hver profil.En representativ profil fra et automatisert tetthetsfraksjoneringssystem vises her. Denne profilen ble produsert fra en kontinuerlig absorbansprofil da sukrosegradienten ble forskjøvet nedenfra og opp av en jaktløsning, gjennom en detektorstrømningscelle og samlet i fraksjoner. Polysomprofilen generert ved håndfraksjonering av 200 og 100 mikroliterprøver er vist her.Det viktigste å huske med denne prosedyren er å ikke forstyrre gradientene. Pass på at du ikke introduserer luftbobler eller forstyrrer gradienten ved å dispensere løsningen for raskt. Etter denne prosedyren kan RNA ekstraheres fra gradientene for videre analyse for å bestemme mRNA som assosierer med aktive ribosomer.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Hjernemembran Fraksjonering: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Tilnærming til vurdering av subsynaptisk protein lokalisering

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

Fraksjoneres for løsning av løselig og uløselig Huntingtin arter

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome profilering i Leishmania, menneskelige celler og mus testikkel

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Påvisning av små GTPase Prenylation og GTP bindende ved hjelp av membran fraksjoneres og GTPase-koblede Immunosorbent analysen

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

Manipulere levende celler å konstruere stabil 3D Cellular samling uten kunstige stillas

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

Identifikasjon av havet Lamprey feromoner bruker Bioassay-guidede fraksjoneres

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

Celle fraksjoneres av U937 celler i fravær av høyhastighets sentrifugering

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptide profilering og identifisering illustrert av angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Identifisering av Inositol fosfat eller Fosfoinositid samspill proteiner av affinitet kromatografi koplet til Western Blot eller Mass massespektrometri

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Måle interaksjoner mellom fluorescerende sonder og lignin i Plant seksjoner av sFLIM basert på Native Autofluorescence

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...