Name: polysome profiling without gradient makers or fractionation systems
Uploaded: 2021-06-01T14:00:00
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Os autores agradecem ao Dr. Percy Tumbale e à Dra. Melissa Wells por sua leitura crítica deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Intramural do Instituto Nacional de Saúde dos EUA; Instituto Nacional de Ciências da Saúde Ambiental dos EUA (NIEHS; ZIA ES103247 a R.E.S).

1. Preparação de 7% - 47% de gradientes de sacarose
NOTA: O intervalo linear do gradiente de sacarose pode ser modificado para obter uma melhor separação, dependendo do tipo de célula utilizada. Este protocolo é otimizado para perfis polissômicos para S. cerevisiae.
<ol><li>Preparar soluções-estoque de 7% e 47% de sacarose em tampão gradiente de sacarose (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2 e 1 mM TDT). Filtrar esterilizar as soluções-mãe de sacaros...

<ol>
	<li>Choi, A., Barrientos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sucrose+gradient+sedimentation+analysis+of+mitochondrial+ribosomes.">Sucrose gradient sedimentation analysis of mitochondrial ribosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 2192, 211-226 (2021).</li><li>Dos Santos, R. F., Barria, C., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+analysis+of+bacterial+ribosomes+through+sucrose+gradient+ultracentrifugation.">Isolation and analysis of bacterial ribosomes through sucrose gradient ultracentrifugation.</a> Methods in Molecular Biology. 2106, 299-310 (2020).</li><li>Pringle, E. S., McCormick, C., Cheng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+profiling+analysis+of+mRNA+and+associated+proteins+engaged+in+translation.">Polysome profiling analysis of mRNA and associated proteins engaged in translation.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 125 (1), 79 (2019).</li><li>Liang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome-profiling+in+small+tissue+samples.">Polysome-profiling in small tissue samples.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 3 (2018).</li><li>Karamysheva, Z. 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(92), e52295 (2014).</li><li>Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+translation+initiation+during+stress+conditions+by+polysome+profiling.">Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51164 (2014).</li><li>Panda, A. C., Martindale, J. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+essential+ribosome+assembly+AAA-ATPase+Rix7.">Cryo-EM structure of the essential ribosome assembly AAA-ATPase Rix7.</a> Nature Communications. 10 (1), 513 (2019).</li><li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grc3+programs+the+essential+endoribonuclease+Las1+for+specific+RNA+cleavage.">Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 5530-5538 (2017).</li><li>Woolford, J. L., Baserga, S. 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Molecular Cell Biology. 20 (2), 116-131 (2018).</li><li>Bassler, J., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+ribosome+assembly.">Eukaryotic ribosome assembly.</a> Annual Review of Biochemistry. 88, 281-306 (2019).</li><li>Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+puzzle+of+life:+Crafting+ribosomal+subunits.">A puzzle of life: Crafting ribosomal subunits.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 640-654 (2017).</li><li>Prattes, M., Lo, Y. H., Bergler, H., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+the+nascent+ribosome:+AAA-ATPases+in+eukaryotic+ribosome+biogenesis.">Shaping the nascent ribosome: AAA-ATPases in eukaryotic ribosome biogenesis.</a> Biomolecules. 9 (11), 715 (2019).</li><li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+molecular+crosstalk+within+the+essential+Grc3/Las1+pre-rRNA+processing+complex.">Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex.</a> RNA. 24 (5), 721-738 (2018).</li><li>Hu, W., Coller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+analysis+for+determining+mRNA+and+ribosome+association+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Polysome analysis for determining mRNA and ribosome association in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 530, 193-206 (2013).</li><li>He, S. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+analysis+of+mammalian+cells.">Polysome analysis of mammalian cells.</a> Methods in Enzymolog. 530, 183-192 (2013).</li><li>Anand, M., Chakraburtty, K., Marton, M. J., Hinnebusch, A. G., Kinzy, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+interactions+between+yeast+translation+eukaryotic+elongation+factor+(eEF)+1A+and+eEF3.">Functional interactions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6985-6991 (2003).</li><li>Serikawa, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptome+and+its+translation+during+recovery+from+cell+cycle+arrest+in+Saccharomyces+cerevisiae.">The transcriptome and its translation during recovery from cell cycle arrest in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cell Proteomics: MCP. 2 (3), 191-204 (2003).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li></ol>

Aqui um método para criar perfis de polissomas sem o uso de sistemas de fracionamento automatizados caros foi descrito. A vantagem desse método é que ele torna o perfil de polissomas acessível a laboratórios que não possuem sistemas de fracionamento automatizados. As principais desvantagens deste protocolo são o tedioso fracionamento manual e a sensibilidade reduzida em comparação com o sistema de fracionamento de densidade dedicado.
Este protocolo envolve a preparação cuidadosa de ...

Os ribossomos são complexos ribonucleoproteicos mega-Dalton que realizam o processo fundamental de tradução de mRNA em proteínas. Os ribossomos são responsáveis por realizar a síntese de todas as proteínas dentro de uma célula. Os ribossomos eucarióticos compreendem duas subunidades designadas como a pequena subunidade ribossomal (40S) e a grande subunidade ribossomal (60S) de acordo com seus coeficientes de sedimentação. O ribossomo totalmente montado é designado como o monossomo dos anos 80. Os polissomos são grupos de ribossomos envolvidos na tradução de uma única molécula de mRNA. O fracionamento de polissomas por centrifugação de gradiente de densidade de sacarose é um método poderoso usado para criar perfis de ribossomos, identificar mRNAs específicos associados à tradução de ribossomos e analisar fatores associados a polissomos 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ,13. Esta técnica é frequentemente usada para separar polissomos de ribossomos únicos, subunidades ribossomais e partículas de ribonucleoproteína mensageiras. Os perfis obtidos a partir do fracionamento podem fornecer informações valiosas sobre a atividade de tradução dos polissomos14 e o status de montagem dos ribossomos15,16,17.
A montagem do ribossomo é um processo muito complexo facilitado por um grupo de proteínas conhecido como fatores de montagem do ribossomo 18,19,20,21. Esses fatores desempenham uma ampla gama de funções durante a biogênese do ribossomo por meio de interações com muitas outras proteínas, incluindo ATPases, endo e exonucleases, GTPases, helicases de RNA e proteínas de ligação ao RNA22. O fracionamento de polissomos tem sido uma ferramenta poderosa usada para investigar o papel desses fatores na montagem de ribossomos. Por exemplo, esse método tem sido utilizado para demonstrar como mutações na polinucleotídeo quinase Grc3, um fator de processamento pré-rRNA, podem afetar negativamente o processo de montagem do ribossomo17,23. O perfil de polissomas também destacou e mostrou como os motivos conservados dentro da ATPase Rix7 são essenciais para a produção de ribossomos16.
O procedimento para o fracionamento de polissomos começa com a produção de lisados celulares solúveis a partir de células de interesse. O lisado contém RNA, subunidades ribossomais e polissomos, bem como outros componentes celulares solúveis. Um gradiente de sacarose contínuo e linear é feito dentro de um tubo ultracentrífugo. A fração solúvel do lisado celular é suavemente carregada no topo do tubo de gradiente de sacarose. O tubo de gradiente carregado é então submetido à centrifugação, que separa os componentes celulares por tamanho dentro do gradiente de sacarose pela força da gravidade. Os componentes maiores viajam mais para dentro do gradiente do que os componentes menores. A parte superior do gradiente abriga os componentes celulares menores e mais lentos, enquanto os componentes celulares maiores e mais rápidos são encontrados na parte inferior. Após a centrifugação, o conteúdo do tubo é coletado como frações. Este método efetivamente separa subunidades ribossomais, monossomos e polissomos. A densidade óptica de cada fração é então determinada medindo a absorvância espectral a um comprimento de onda de 254 nm. A plotagem da absorbância vs. número de frações produz um perfil polissômico.
Gradientes lineares de densidade de sacarose podem ser gerados utilizando um fabricante de gradientes. Após a centrifugação, os gradientes são frequentemente fracionados e as absorvâncias medidas usando um sistema automatizado de fracionamento de densidade 3,7,13,24,25. Embora esses sistemas funcionem muito bem para produzir perfis de polissomos, eles são caros e podem ser proibitivos em termos de custo para alguns laboratórios. Aqui é apresentado um protocolo para gerar perfis de polissomas sem o uso desses instrumentos. Em vez disso, este protocolo utiliza equipamentos normalmente disponíveis na maioria dos laboratórios de biologia molecular.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automatic Fractionator</td>
			<td>Brandel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clariostar Multimode Plate Reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15508-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads, acid washed</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td>425&#8211;600 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, 1 M</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>CAC-5290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 22 G, Metal Hub</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>7748-08</td>
			<td>custom length 9 inches, point style 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XL-100K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Centrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Test Tube Peg Rack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-810-54A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q33228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit RNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Inhibitor</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N8080119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 3 mL</td>
			<td>Coviden</td>
			<td>888151394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, 1 M,&#160; pH 7.4</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Star Microplate, 96 wells</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655801</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polysome profiling without gradient makers or fractionation systems

O fracionamento de polissomos por centrifugação de gradiente de densidade de sacarose é uma ferramenta poderosa que pode ser usada para criar perfis de ribossomos, identificar mRNAs específicos sendo traduzidos por ribossomos e analisar fatores associados a polissomos. Embora os fabricantes automatizados de gradientes e os sistemas de fracionamento de gradientes sejam comumente usados com essa técnica, esses sistemas geralmente são caros e podem ser proibitivos em termos de custo para laboratórios que têm recursos limitados ou não podem justificar a despesa devido à sua necessidade infrequente ou ocasional de executar esse método para suas pesquisas. Aqui, um protocolo é apresentado para gerar perfis de polissomo de forma reprodutível usando equipamentos padrão disponíveis na maioria dos laboratórios de biologia molecular sem instrumentos de fracionamento especializados. Além disso, uma comparação de perfis de polissomas gerados com e sem um sistema de fracionamento de gradiente é fornecida. Estratégias para otimizar e produzir perfis de polissomos reprodutíveis são discutidas. Saccharomyces cerevisiae é utilizado como organismo modelo neste protocolo. No entanto, este protocolo pode ser facilmente modificado e adaptado para gerar perfis de ribossomos para muitos organismos e tipos de células diferentes.

Três perfis de polissomas representativos são mostrados na Figura 3. Todos os perfis são da mesma cepa de levedura. Um perfil típico de polissomas terá picos bem resolvidos para as subunidades ribossômicas dos anos 40, 60 e 80, bem como polissomos. A crista de cada subunidade ribossomal e o pico do polissomo serão aparentes em cada perfil (Figura 3). Um perfil representativo de um sistema automatizado de fracionamento de densidade é mostrado na <strong c...

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Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Este protocolo descreve como gerar um perfil de polissomo sem usar fabricantes automatizados de gradientes ou sistemas de fracionamento de gradiente.

Perfil de polissomas sem fabricantes de gradientes ou sistemas de fracionamento

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

Este protocolo descreve como gerar um perfil de polissomo que revela detalhes moleculares sobre a atividade dos ribossomos dentro da célula. Essa técnica permite que os usuários obtenham as informações valiosas fornecidas por um perfil de polissomos, que não têm acesso a sistemas automatizados de fracionamento de gradiente. Tome seu tempo ao preparar os gradientes e armazene os gradientes em um local onde eles não serão interrompidos por um compressor ou outras operações mecânicas à medida que se estabelecem em um gradiente linear.Para começar, preparar soluções-estoque de 7 e 47% de sacarose em tampão gradiente de sacarose. Filtrar esterilizar as soluções-mãe de sacarose através de um filtro de 0,22 mícron. Preparar 14 mililitros de soluções de 17, 27% e 37% de sacarose, dispensando e misturando as soluções de estoque de 7 e 47%.Coloque seis tubos de centrífuga de polipropileno em um rack de tubo de ensaio de visão completa. Certifique-se de que há espaço suficiente entre os tubos para que as ações com um tubo não perturbem os outros. Anexe uma agulha de nove polegadas, calibre 22 com uma ponta romba a uma seringa de três mililitros e execute um enchimento e dispense de teste para garantir que a seringa possa segurar a solução de sacarose sem qualquer gotejamento antes de configurar os gradientes.Adicione dois mililitros de sacarose a 7% ao fundo de cada tubo de centrífuga. Em seguida, adicione dois mililitros de sacarose a 17% abaixo da solução a 7%, posicionando a ponta da agulha nas imediações do fundo do tubo. Dispense a solução com cuidado e lentamente.Repita o procedimento com dois mililitros cada uma das soluções de 27, 37 e 47% de sacarose, garantindo que cada camada seja distinguível da outra por uma linha que marque a separação das densidades. Armazene os gradientes a quatro graus Celsius durante a noite para permitir que eles se instalem em uma porcentagem contínua e crescente de sacarose. Após o crescimento e colheita de leveduras, as células de Saccharomyces cerevisiae, ressuspendem as células em 700 microlitros refrigerados de tampão de extração de polissomos.Adicione 100 unidades de inibidor de RNAse. Em seguida, adicione 400 microlitros de contas de vidro pré-refrigeradas com um tamanho aproximado de 425 a 600 mícrons. Transfira a mistura para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro com as contas de vidro e interrompa as células de levedura por agitação vigorosa em um batedor de contas por cinco minutos.Depois de interromper as células, esclareça o lisado por centrifugação. Determine a concentração do RNA no lisado clarificado medindo a absorbância a 260 nanômetros, usando um sistema de detecção de RNA baseado em fluorescência. Certifique-se de que a concentração de RNA é de 0,5 a um micrograma por microlitro.Se a concentração de RNA for muito baixa, reduza o volume de tampão de extração usado para ressuspender as células. Carregue cuidadosamente o lisado na parte superior dos gradientes. Coloque a ponta da pipeta contra a parede interna na parte superior do tubo de polipropileno.Incline o tubo e dispense lentamente o lisado no topo do gradiente, pingando contra a parede. Coloque suavemente os tubos nos baldes pré-resfriados de um rotor de balde oscilante e centrifugar os gradientes. Após a centrifugação, remova cuidadosamente os tubos de centrífuga do rotor da caçamba oscilante e coloque-os em um suporte de tubo.Rotule as placas de 96 poços para armazenar as frações e pré-resfrie no gelo. Colete frações de 100 ou 200 microlitros a partir do topo do gradiente, inserindo cuidadosamente uma ponta de pipeta na parte superior do gradiente e coletando as frações até que todo o gradiente seja alíquotado. Medir a absorvância de cada fração a 254 nanômetros com um espectrofotômetro contra as soluções de 7 e 47% de sacarose em branco.Crie o perfil de polissomo plotando o número de frações versus a absorvência. Três perfis de polissomas representativos da levedura S.Cerevisiae, são mostrados. A crista de cada subunidade ribossomal e pico de polissomo é aparente em cada perfil.Um perfil representativo de um sistema automatizado de fracionamento de densidade é mostrado aqui. Este perfil foi produzido a partir de um perfil de absorbância contínua à medida que o gradiente de sacarose era deslocado de baixo para cima por uma solução de perseguição, através de uma célula de fluxo detectora e coletado em frações. O perfil de polissomo gerado pelo fracionamento manual de amostras de 200 e 100 microlitros é mostrado aqui.A coisa mais importante a lembrar com este procedimento é não interromper os gradientes. Tome cuidado para não introduzir bolhas de ar ou interromper o gradiente dispensando a solução muito rapidamente. Após este procedimento, o RNA pode ser extraído dos gradientes para análise adicional para determinar mRNAs que estão se associando a ribossomos ativos

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Fracionamento de Membranas Cerebrais: Um<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Abordagem para Avaliar a Localização de Proteínas Subinápticas

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Bioquímica

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

Fracionamento para resolução das espécies de Huntingtin solúvel e insolúvel

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome de criação de perfil em Leishmania, células humanas e testículo de rato

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Deteção de pequena GTPase Prenilação e GTP ligação usando o fracionamento de membrana e ensaio de imunoabsorção ligada de GTPase

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

Manipulando células vivas para construir estável montagem celular 3D sem andaime Artificial

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

A identificação das feromonas de lampreia do mar usando guiada por bioensaio fracionamento

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

Fracionamento celular de células U937, na ausência de centrifugação de alta velocidade

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Perfil e identificação de nitropeptídeos ilustrados pela angiotensina II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Medindo interações entre sondas fluorescentes e lignina em seções de plantas por sFLIM Com base na autofluorescência nativa

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Perfilamento Complexome de alta resolução por Cryoslicing BN-MS Analysis

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...