Name: polysome profiling without gradient makers or fractionation systems
Uploaded: 2021-06-01T14:00:00
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Los autores agradecen al Dr. Percy Tumbale y a la Dra. Melissa Wells por su lectura crítica de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Intramuros del Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos; Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental de los Estados Unidos (NIEHS; ZIA ES103247 a R.E.S).

1. Preparación de gradientes de sacarosa al 7% - 47%
NOTA: El rango lineal del gradiente de sacarosa se puede modificar para lograr una mejor separación dependiendo del tipo de célula utilizada. Este protocolo está optimizado para perfiles de polisomas para S. cerevisiae.
<ol><li>Preparar soluciones madre de sacarosa al 7% y 47% en tampón de gradiente de sacarosa (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2 y 1 mM DTT). Esterilizar con filtro las soluciones madre d...

<ol>
	<li>Choi, A., Barrientos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sucrose+gradient+sedimentation+analysis+of+mitochondrial+ribosomes.">Sucrose gradient sedimentation analysis of mitochondrial ribosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 2192, 211-226 (2021).</li><li>Dos Santos, R. F., Barria, C., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+analysis+of+bacterial+ribosomes+through+sucrose+gradient+ultracentrifugation.">Isolation and analysis of bacterial ribosomes through sucrose gradient ultracentrifugation.</a> Methods in Molecular Biology. 2106, 299-310 (2020).</li><li>Pringle, E. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+molecular+crosstalk+within+the+essential+Grc3/Las1+pre-rRNA+processing+complex.">Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex.</a> RNA. 24 (5), 721-738 (2018).</li><li>Hu, W., Coller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+analysis+for+determining+mRNA+and+ribosome+association+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Polysome analysis for determining mRNA and ribosome association in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 530, 193-206 (2013).</li><li>He, S. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+analysis+of+mammalian+cells.">Polysome analysis of mammalian cells.</a> Methods in Enzymolog. 530, 183-192 (2013).</li><li>Anand, M., Chakraburtty, K., Marton, M. J., Hinnebusch, A. G., Kinzy, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+interactions+between+yeast+translation+eukaryotic+elongation+factor+(eEF)+1A+and+eEF3.">Functional interactions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6985-6991 (2003).</li><li>Serikawa, K. 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Aquí se ha descrito un método para crear perfiles polisómicos sin el uso de costosos sistemas de fraccionamiento automatizado. La ventaja de este método es que hace que el perfil de polisomas sea accesible para los laboratorios que no tienen sistemas de fraccionamiento automatizados. Las principales desventajas de este protocolo son el tedioso fraccionamiento manual y la sensibilidad reducida en comparación con el sistema de fraccionamiento de densidad dedicado.
Este protocolo implica una...

Los ribosomas son complejos de ribonucleoproteínas mega-Dalton que realizan el proceso fundamental de traducir el ARNm en proteínas. Los ribosomas son responsables de llevar a cabo la síntesis de todas las proteínas dentro de una célula. Los ribosomas eucariotas comprenden dos subunidades designadas como la subunidad ribosómica pequeña (40S) y la subunidad ribosómica grande (60S) de acuerdo con sus coeficientes de sedimentación. El ribosoma completamente ensamblado se designa como el monosoma 80S. Los polisomas son grupos de ribosomas dedicados a traducir una sola molécula de ARNm. El fraccionamiento de polisomas por centrifugación por gradiente de densidad de sacarosa es un método poderoso utilizado para crear perfiles de ribosomas, identificar ARNm específicos asociados con la traducción de ribosomas y analizar factores asociados a polisomas 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ,13. Esta técnica se utiliza a menudo para separar polisomas de ribosomas individuales, subunidades ribosómicas y partículas de ribonucleoproteína mensajera. Los perfiles obtenidos del fraccionamiento pueden proporcionar información valiosa sobre la actividad de traducción de los polisomas14 y el estado de ensamblaje de los ribosomas15,16,17.
El ensamblaje de ribosomas es un proceso muy complejo facilitado por un grupo de proteínas conocidas como factores de ensamblaje de ribosomas 18,19,20,21. Estos factores realizan una amplia gama de funciones durante la biogénesis de los ribosomas a través de interacciones con muchas otras proteínas, incluyendo ATPasas, endo y exo-nucleasas, GTPasas, helicasas de ARN y proteínas de unión a ARN22. El fraccionamiento de polisomas ha sido una poderosa herramienta utilizada para investigar el papel de estos factores en el ensamblaje de ribosomas. Por ejemplo, este método ha sido utilizado para demostrar cómo las mutaciones en la polinucleótido quinasa Grc3, un factor de procesamiento pre-rRNA, pueden afectar negativamente el proceso de ensamblaje de ribosomas17,23. El perfil de polisomas también ha resaltado y mostrado cómo los motivos conservados dentro de la ATPasa Rix7 son esenciales para la producción de ribosomas16.
El procedimiento para el fraccionamiento de polisomas comienza con la fabricación de lisados celulares solubles a partir de células de interés. El lisado contiene ARN, subunidades ribosómicas y polisomas, así como otros componentes celulares solubles. Se realiza un gradiente de sacarosa lineal continuo dentro de un tubo de ultracentrífuga. La fracción soluble del lisado celular se carga suavemente en la parte superior del tubo de gradiente de sacarosa. El tubo de gradiente cargado se somete a centrifugación, que separa los componentes celulares por tamaño dentro del gradiente de sacarosa por la fuerza de la gravedad. Los componentes más grandes viajan más lejos en el gradiente que los componentes más pequeños. La parte superior del gradiente alberga los componentes celulares más pequeños y lentos, mientras que los componentes celulares más grandes y de viaje más rápido se encuentran en la parte inferior. Después de la centrifugación, el contenido del tubo se recoge como fracciones. Este método separa eficazmente las subunidades ribosómicas, monosomas y polisomas. La densidad óptica de cada fracción se determina midiendo la absorbancia espectral a una longitud de onda de 254 nm. Trazar absorbancia vs. número de fracción produce un perfil de polisoma.
Los gradientes lineales de densidad de sacarosa se pueden generar utilizando un fabricante de gradiente. Después de la centrifugación, los gradientes a menudo se fraccionan y las absorbancias se miden utilizando un sistema automatizado de fraccionamiento de densidad 3,7,13,24,25. Si bien estos sistemas funcionan muy bien para producir perfiles polisomónicos, son costosos y pueden ser prohibitivos para algunos laboratorios. Aquí se presenta un protocolo para generar perfiles polisómicos sin el uso de estos instrumentos. En cambio, este protocolo utiliza equipos típicamente disponibles en la mayoría de los laboratorios de biología molecular.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automatic Fractionator</td>
			<td>Brandel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clariostar Multimode Plate Reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15508-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads, acid washed</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td>425&#8211;600 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, 1 M</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>CAC-5290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 22 G, Metal Hub</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>7748-08</td>
			<td>custom length 9 inches, point style 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XL-100K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Centrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Test Tube Peg Rack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-810-54A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q33228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit RNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Inhibitor</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N8080119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 3 mL</td>
			<td>Coviden</td>
			<td>888151394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, 1 M,&#160; pH 7.4</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Star Microplate, 96 wells</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655801</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polysome profiling without gradient makers or fractionation systems

El fraccionamiento de polisomas por centrifugación por gradiente de densidad de sacarosa es una herramienta poderosa que se puede utilizar para crear perfiles de ribosomas, identificar ARNm específicos que son traducidos por ribosomas y analizar factores asociados a polisomas. Si bien los fabricantes automatizados de gradientes y los sistemas de fraccionamiento de gradiente se usan comúnmente con esta técnica, estos sistemas son generalmente costosos y pueden ser prohibitivos para los laboratorios que tienen recursos limitados o no pueden justificar el gasto debido a su necesidad poco frecuente u ocasional de realizar este método para su investigación. Aquí, se presenta un protocolo para generar de forma reproducible perfiles polisomáticos utilizando equipos estándar disponibles en la mayoría de los laboratorios de biología molecular sin instrumentos especializados de fraccionamiento. Además, se proporciona una comparación de perfiles de polisomas generados con y sin un sistema de fraccionamiento de gradiente. Se discuten estrategias para optimizar y producir perfiles polisómicos reproducibles. Saccharomyces cerevisiae se utiliza como organismo modelo en este protocolo. Sin embargo, este protocolo se puede modificar y adaptar fácilmente para generar perfiles de ribosomas para muchos organismos y tipos de células diferentes.

En la Figura 3 se muestran tres perfiles polisómicos representativos. Todos los perfiles son de la misma cepa de levadura. Un perfil polisomático típico tendrá picos bien resueltos para las subunidades ribosómicas 40S, 60S y 80S, así como para los polisomas. La cresta de cada subunidad ribosómica y pico del polisoma será evidente en cada perfil (Figura 3). En la Figura 3A se muestra un perfil representativo de un sistema aut...

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Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Este protocolo describe cómo generar un perfil de polisoma sin utilizar generadores de gradiente automatizados o sistemas de fraccionamiento de gradiente.

Perfilado de polisomas sin fabricantes de gradiente ni sistemas de fraccionamiento

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

Este protocolo describe cómo generar un perfil polisomático que revela detalles moleculares sobre la actividad de los ribosomas dentro de la célula. Esta técnica permite a los usuarios obtener la valiosa información proporcionada por un perfil polisómico, que no tiene acceso a sistemas automatizados de fraccionamiento de gradiente. Tómese su tiempo mientras prepara los gradientes y guárdelos en un lugar donde no se vean interrumpidos por un compresor u otras operaciones mecánicas a medida que se asientan en un gradiente lineal.Para comenzar, prepare soluciones madre de sacarosa al 7 y 47% en tampón de gradiente de sacarosa. Filtro esterilizar las soluciones madre de sacarosa a través de un filtro de 0,22 micras. Prepare 14 mililitros de soluciones de sacarosa al 17, 27 y 37% dispensando y mezclando las soluciones de 7 y 47% de existencias.Coloque seis tubos centrífugos de polipropileno en un bastidor de tubos de ensayo de vista completa. Asegúrese de que haya suficiente espacio entre los tubos para que las acciones con un tubo no perturben a los demás. Conecte una aguja de nueve pulgadas y calibre 22 con una punta roma a una jeringa de tres mililitros, y realice un llenado y dispensación de prueba para asegurarse de que la jeringa pueda contener la solución de sacarosa sin gotear antes de configurar los gradientes.Agregue dos mililitros de sacarosa al 7% al fondo de cada tubo de centrífuga. Luego, agregue dos mililitros de sacarosa al 17% debajo de la solución al 7%, colocando la punta de la aguja dentro de las inmediaciones del fondo del tubo. Dispense la solución con cuidado y lentamente.Repita el procedimiento con dos mililitros cada uno de la solución de sacarosa al 27, 37 y 47%, asegurándose de que cada capa se distinga de la otra por una línea que marque la separación de densidades. Almacene los gradientes a cuatro grados centígrados durante la noche para permitir que se asienten en un porcentaje continuo y creciente de sacarosa. Después del crecimiento y la cosecha de levadura, las células de Saccharomyces cerevisiae, resuspenden las células en 700 microlitros refrigerados de tampón de extracción de polisomas.Añadir 100 unidades de inhibidor de la ARNsa. Luego, agregue 400 microlitros de perlas de vidrio preenfriadas con un tamaño aproximado de 425 a 600 micras. Transfiera la mezcla a un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros con las perlas de vidrio e interrumpa las células de levadura mediante una agitación vigorosa en un batidor de cuentas durante cinco minutos.Después de interrumpir las células, aclarar el lisado por centrifugación. Determine la concentración del ARN en el lisado clarificado midiendo la absorbancia a 260 nanómetros, utilizando un sistema de detección de ARN basado en fluorescencia. Asegúrese de que la concentración de ARN sea de 0,5 a un microgramo por microlitro.Si la concentración de ARN es demasiado baja, reduzca el volumen de tampón de extracción utilizado para resuspender las células. Cargue cuidadosamente el lisado en la parte superior de los degradados. Coloque la punta de la pipeta contra la pared interior en la parte superior del tubo de polipropileno.Incline el tubo y dispense lentamente el lisado en la parte superior del degradado, goteando contra la pared. Coloque suavemente los tubos en los cubos preenfriados de un rotor de cangilón oscilante y centrifugar los gradientes. Después de la centrifugación, retire con cuidado los tubos de centrífuga del rotor del cucharón oscilante y colóquelos en un soporte de tubos.Etiquete las placas de 96 pocillos para almacenar las fracciones y preenfriarlas en hielo. Recoja fracciones de 100 o 200 microlitros a partir de la parte superior del degradado, insertando cuidadosamente una punta de pipeta en la parte superior del degradado y recogiendo las fracciones hasta que todo el gradiente sea alícuoto. Mida la absorbancia de cada fracción a 254 nanómetros con un espectrofotómetro contra las soluciones de sacarosa al 7 y 47% como espacios en blanco.Cree el perfil del polisoma trazando el número de fracción frente a la absorbancia. Se muestran tres perfiles de polisomas representativos de la levadura S.Cerevisiae. La cresta de cada subunidad ribosómica y pico del polisoma es evidente en cada perfil.Aquí se muestra un perfil representativo de un sistema automatizado de fraccionamiento de densidad. Este perfil se produjo a partir de un perfil de absorbancia continua ya que el gradiente de sacarosa fue desplazado de abajo hacia arriba por una solución de persecución, a través de una celda de flujo detector y recogido en fracciones. Aquí se muestra el perfil polisomal generado por fraccionamiento manual de muestras de 200 y 100 microlitros.Lo más importante que debe recordar con este procedimiento es no interrumpir los gradientes. Tenga cuidado de no introducir burbujas de aire o interrumpir el gradiente al dispensar la solución demasiado rápido. Después de este procedimiento, se puede extraer ARN de los gradientes para su posterior análisis para determinar los ARNm que se asocian con ribosomas activos.

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Detección de la pequeña GTPasa Prenilación y GTP obligatorio usar membrana fraccionamiento y GTPasa-linked Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

Manipulación de células vivas para construir estable montaje celular 3D sin andamio Artificial

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

La identificación de las feromonas de la lamprea de mar usando fraccionamiento guiado por bioensayo

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

Fraccionamiento de la célula de las células U937 en ausencia de centrifugación de alta velocidad

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Perfilado e identificación de nitropéptidos ilustrados por Angiotensin A II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Medición de interacciones entre sondas fluorescentes y lignina en secciones de plantas por sFLIM basado en autofluorescencia nativa

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Perfiles de Complexome de Alta Resolución por Cryoslicing BN-MS Analysis

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...