Name: polysome profiling without gradient makers or fractionation systems
Uploaded: 2021-06-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems at JoVE.com

Författarna tackar Dr. Percy Tumbale och Dr. Melissa Wells för deras kritiska läsning av detta manuskript. Detta arbete stöddes av US National Institute of Health Intramural Research Program; Amerikanska nationella institutet för miljöhälsovetenskap (NIEHS; ZIA ES103247 till R.E.S).

1. Beredning av 7% - 47% sackarosgradienter
OBS: Det linjära intervallet för sackarosgradienten kan modifieras för att uppnå bättre separation beroende på vilken celltyp som används. Detta protokoll är optimerat för polysomprofiler för S. cerevisiae.
<ol><li>Förbered stamlösningar av 7% och 47% sackaros i sackarosgradientbuffert (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2 och 1 mM DTT). Filtrera sterilisera sackarosstamlösningarna genom ett 0,22 μm filter...

<ol>
	<li>Choi, A., Barrientos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sucrose+gradient+sedimentation+analysis+of+mitochondrial+ribosomes.">Sucrose gradient sedimentation analysis of mitochondrial ribosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 2192, 211-226 (2021).</li><li>Dos Santos, R. F., Barria, C., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+analysis+of+bacterial+ribosomes+through+sucrose+gradient+ultracentrifugation.">Isolation and analysis of bacterial ribosomes through sucrose gradient ultracentrifugation.</a> Methods in Molecular Biology. 2106, 299-310 (2020).</li><li>Pringle, E. S., McCormick, C., Cheng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+profiling+analysis+of+mRNA+and+associated+proteins+engaged+in+translation.">Polysome profiling analysis of mRNA and associated proteins engaged in translation.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 125 (1), 79 (2019).</li><li>Liang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome-profiling+in+small+tissue+samples.">Polysome-profiling in small tissue samples.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 3 (2018).</li><li>Karamysheva, Z. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+profiling+in+leishmania,+human+cells+and+mouse+testis.">Polysome profiling in leishmania, human cells and mouse testis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e57600 (2018).</li><li>Jin, H. Y., Xiao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Integrated+polysome+profiling+and+ribosome+profiling+method+to+investigate+in+vivo+translatome.">An Integrated polysome profiling and ribosome profiling method to investigate in vivo translatome.</a> Methods in Molecular Biology. 1712, 1-18 (2018).</li><li>Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+translation+using+polysome+profiling.">Analysis of translation using polysome profiling.</a> Nucleic Acids Research. 45 (3), 15 (2017).</li><li>Aboulhouda, S., Di Santo, R., Therizols, G., Weinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate,+streamlined+analysis+of+mrna+translation+by+sucrose+gradient+fractionation.">Accurate, streamlined analysis of mrna translation by sucrose gradient fractionation.</a> Bio-protocol. 7 (19), 2573 (2017).</li><li>Kudla, M., Karginov, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mRNA+translation+by+polysome+profiling.">Measuring mRNA translation by polysome profiling.</a> Methods in Molecular Biology. 1421, 127-135 (2016).</li><li>Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+selective+mRNA+translation+in+mammalian+cells+by+polysome+profiling.">Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e52295 (2014).</li><li>Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+translation+initiation+during+stress+conditions+by+polysome+profiling.">Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51164 (2014).</li><li>Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+fractionation+to+analyze+mRNA+distribution+profiles.">Polysome fractionation to analyze mRNA distribution profiles.</a> Bio-protocol. 7 (3), 2126 (2017).</li><li>Chikashige, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gcn2+eIF2alpha+kinase+mediates+combinatorial+translational+regulation+through+nucleotide+motifs+and+uORFs+in+target+mRNAs.">Gcn2 eIF2alpha kinase mediates combinatorial translational regulation through nucleotide motifs and uORFs in target mRNAs.</a> Nucleic Acids Research. 48 (16), 8977-8992 (2020).</li><li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+footprint+profiling+of+translation+throughout+the+genome.">Ribosome footprint profiling of translation throughout the genome.</a> Cell. 165 (1), 22-33 (2016).</li><li>Ripmaster, T. L., Vaughn, G. P., Woolford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DRS1+to+DRS7,+novel+genes+required+for+ribosome+assembly+and+function+in+Saccharomyces+cerevisiae.">DRS1 to DRS7, novel genes required for ribosome assembly and function in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7901-7912 (1993).</li><li>Lo, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+essential+ribosome+assembly+AAA-ATPase+Rix7.">Cryo-EM structure of the essential ribosome assembly AAA-ATPase Rix7.</a> Nature Communications. 10 (1), 513 (2019).</li><li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grc3+programs+the+essential+endoribonuclease+Las1+for+specific+RNA+cleavage.">Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 5530-5538 (2017).</li><li>Woolford, J. L., Baserga, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+biogenesis+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).</li><li>Klinge, S., Woolford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+assembly+coming+into+focus.">Ribosome assembly coming into focus.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (2), 116-131 (2018).</li><li>Bassler, J., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+ribosome+assembly.">Eukaryotic ribosome assembly.</a> Annual Review of Biochemistry. 88, 281-306 (2019).</li><li>Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+puzzle+of+life:+Crafting+ribosomal+subunits.">A puzzle of life: Crafting ribosomal subunits.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 640-654 (2017).</li><li>Prattes, M., Lo, Y. H., Bergler, H., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+the+nascent+ribosome:+AAA-ATPases+in+eukaryotic+ribosome+biogenesis.">Shaping the nascent ribosome: AAA-ATPases in eukaryotic ribosome biogenesis.</a> Biomolecules. 9 (11), 715 (2019).</li><li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+molecular+crosstalk+within+the+essential+Grc3/Las1+pre-rRNA+processing+complex.">Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex.</a> RNA. 24 (5), 721-738 (2018).</li><li>Hu, W., Coller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+analysis+for+determining+mRNA+and+ribosome+association+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Polysome analysis for determining mRNA and ribosome association in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 530, 193-206 (2013).</li><li>He, S. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+analysis+of+mammalian+cells.">Polysome analysis of mammalian cells.</a> Methods in Enzymolog. 530, 183-192 (2013).</li><li>Anand, M., Chakraburtty, K., Marton, M. J., Hinnebusch, A. G., Kinzy, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+interactions+between+yeast+translation+eukaryotic+elongation+factor+(eEF)+1A+and+eEF3.">Functional interactions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6985-6991 (2003).</li><li>Serikawa, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptome+and+its+translation+during+recovery+from+cell+cycle+arrest+in+Saccharomyces+cerevisiae.">The transcriptome and its translation during recovery from cell cycle arrest in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cell Proteomics: MCP. 2 (3), 191-204 (2003).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li></ol>

Här har en metod för att skapa polysomprofiler utan användning av dyra automatiserade fraktioneringssystem beskrivits. Fördelen med denna metod är att den gör polysomprofilering tillgänglig för laboratorier som inte har automatiserade fraktioneringssystem. De största nackdelarna med detta protokoll är tråkig handfraktionering och minskad känslighet jämfört med det dedikerade densitetsfraktioneringssystemet.
Detta protokoll innebär noggrann beredning av sackarosgradienter med upp...

Ribosomer är mega-Dalton ribonukleoproteinkomplex som utför den grundläggande processen att översätta mRNA till proteiner. Ribosomer är ansvariga för att utföra syntesen av alla proteiner i en cell. Eukaryota ribosomer består av två underenheter som betecknas som den lilla ribosomala underenheten (40S) och den stora ribosomala underenheten (60S) enligt deras sedimenteringskoefficienter. Den helt monterade ribosomen betecknas som 80S monosom. Polysomer är grupper av ribosomer som arbetar med att översätta en enda mRNA-molekyl. Polysomfraktionering genom sackarosdensitetsgradientcentrifugering är en kraftfull metod som används för att skapa ribosomprofiler, identifiera specifika mRNA associerade med att översätta ribosomer och analysera polysomassocierade faktorer 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ,13. Denna teknik används ofta för att separera polysomer från enstaka ribosomer, ribosomala underenheter och budbärarribonukleoproteinpartiklar. Profilerna som erhålls från fraktionering kan ge värdefull information om översättningsaktiviteten för polysomer14 och monteringsstatusen för ribosomerna15,16,17.
Ribosommontering är en mycket komplex process som underlättas av en grupp proteiner som kallas ribosommonteringsfaktorer 18,19,20,21. Dessa faktorer utför ett brett spektrum av funktioner under ribosombiogenes genom interaktioner med många andra proteiner, inklusive ATPaser, endo- och exo-nukleaser, GTPaser, RNA-helikaser och RNA-bindande proteiner22. Polysomfraktionering har varit ett kraftfullt verktyg som används för att undersöka rollen av dessa faktorer i ribosommontering. Till exempel har denna metod använts för att visa hur mutationer i polynukleotidkinaset Grc3, en pre-rRNA-bearbetningsfaktor, kan påverka ribosommonteringsprocessen17,23 negativt. Polysomprofilering har också belyst och visat hur de bevarade motiven inom ATPase Rix7 är viktiga för ribosomproduktion16.
Förfarandet för polysomfraktionering börjar med att göra lösliga celllysater från celler av intresse. Lysatet innehåller RNA, ribosomala underenheter och polysomer, liksom andra lösliga cellulära komponenter. En kontinuerlig, linjär sackarosgradient görs i ett ultracentrifugrör. Den lösliga fraktionen av celllysat laddas försiktigt på toppen av sackarosgradientröret. Det laddade gradientröret utsätts sedan för centrifugering, vilket separerar de cellulära komponenterna efter storlek inom sackarosgradienten med tyngdkraften. De större komponenterna färdas längre in i övertoningen än de mindre komponenterna. Toppen av lutningen rymmer de mindre, långsammare resande cellulära komponenterna, medan de större, snabbare resande cellulära komponenterna finns längst ner. Efter centrifugering uppsamlas rörets innehåll som fraktioner. Denna metod separerar effektivt ribosomala underenheter, monosomer och polysomer. Den optiska densiteten för varje fraktion bestäms sedan genom att mäta spektralabsorbansen vid en våglängd av 254 nm. Plottning av absorbans kontra bråktal ger en polysomprofil.
Linjära sackarosdensitetsgradienter kan genereras med hjälp av en gradienttillverkare. Efter centrifugering fraktioneras gradienter ofta och absorbanser mäts med hjälp av ett automatiserat densitetsfraktioneringssystem 3,7,13,24,25. Även om dessa system fungerar mycket bra för att producera polysomprofiler, är de dyra och kan vara oöverkomliga för vissa laboratorier. Här presenteras ett protokoll för att generera polysomprofiler utan användning av dessa instrument. Istället använder detta protokoll utrustning som vanligtvis finns i de flesta molekylärbiologiska laboratorier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automatic Fractionator</td>
			<td>Brandel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clariostar Multimode Plate Reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15508-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads, acid washed</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td>425&#8211;600 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, 1 M</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>CAC-5290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 22 G, Metal Hub</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>7748-08</td>
			<td>custom length 9 inches, point style 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XL-100K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Centrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Test Tube Peg Rack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-810-54A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q33228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit RNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Inhibitor</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N8080119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 3 mL</td>
			<td>Coviden</td>
			<td>888151394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, 1 M,&#160; pH 7.4</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Star Microplate, 96 wells</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655801</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polysome profiling without gradient makers or fractionation systems

Polysomfraktionering genom sackarosdensitetsgradientcentrifugering är ett kraftfullt verktyg som kan användas för att skapa ribosomprofiler, identifiera specifika mRNA som översätts av ribosomer och analysera polysomassocierade faktorer. Medan automatiserade gradienttillverkare och gradientfraktioneringssystem ofta används med denna teknik, är dessa system i allmänhet dyra och kan vara oöverkomliga för laboratorier som har begränsade resurser eller inte kan motivera kostnaden på grund av deras sällsynta eller tillfälliga behov av att utföra denna metod för sin forskning. Här presenteras ett protokoll för att reproducerbart generera polysomprofiler med hjälp av standardutrustning som finns i de flesta molekylärbiologiska laboratorier utan specialiserade fraktioneringsinstrument. Dessutom tillhandahålls en jämförelse av polysomprofiler genererade med och utan ett gradientfraktioneringssystem. Strategier för att optimera och producera reproducerbara polysomprofiler diskuteras. Saccharomyces cerevisiae används som modellorganism i detta protokoll. Detta protokoll kan dock enkelt modifieras och anpassas för att generera ribosomprofiler för många olika organismer och celltyper.

Tre representativa polysomprofiler visas i figur 3. Alla profiler är från samma jäststam. En typisk polysomprofil kommer att ha välupplösta toppar för 40S, 60S och 80S ribosomala underenheter samt polysomer. Krönet för varje ribosomal underenhet och polysomtopp kommer att synas på varje profil (figur 3). En representativ profil från ett automatiserat densitetsfraktioneringssystem visas i figur 3A. De sackarosgradienter som...

Watch this Scientific Journal Video about Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems at JoVE.com

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Det här protokollet beskriver hur du genererar en polysomprofil utan att använda automatiserade övertoningstillverkare eller övertoningsfraktioneringssystem.

Polysomprofilering utan övertoningstillverkare eller fraktioneringssystem

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

Detta protokoll beskriver hur man genererar en polysomprofil som avslöjar molekylära detaljer om aktiviteten hos ribosomer inuti cellen. Denna teknik gör det möjligt för användare att få den värdefulla informationen från en polysomprofil, som inte har tillgång till automatiserade gradientfraktioneringssystem. Ta dig tid medan du förbereder lutningarna och lagra lutningarna på en plats där de inte störs av en kompressor eller andra mekaniska operationer när de sätter sig i en linjär lutning.Börja med att förbereda stamlösningar av 7 och 47% sackaros i sackarosgradientbuffert. Filtrera sterilisera sackarosstamlösningarna genom ett 0,22 mikron filter. Förbered 14 ml 17, 27 och 37% sackaroslösningar genom att dispensera och blanda 7 och 47% stamlösningar.Placera sex polypropencentrifugrör i ett provrörsställ med full vy. Se till att det finns tillräckligt med utrymme mellan rören så att åtgärderna med ett rör inte stör de andra. Fäst en nio tums, 22 gauge nål med en trubbig spets på en tre milliliter spruta, och utför en testfyllning och dispensera för att säkerställa att sprutan kan hålla sackaroslösningen utan dropp innan du ställer in lutningarna.Tillsätt två milliliter av 7% sackaros till botten av varje centrifugrör. Tillsätt sedan två milliliter av 17% sackaros under 7% -lösningen genom att placera nålspetsen i omedelbar närhet av rörbotten. Försiktigt och långsamt dispensera lösningen.Upprepa proceduren med två milliliter vardera av 27, 37 och 47% sackaroslösning, så att varje lager kan särskiljas från det andra genom en linje som markerar separationen av densiteter. Förvara gradienterna vid fyra grader Celsius över natten så att de kan sätta sig i en kontinuerlig, ökande andel sackaros. Efter tillväxt och skörd av jäst, Saccharomyces cerevisiae celler, återsuspendera cellerna i kylda 700 mikroliter polysome extraktionsbuffert.Tillsätt 100 enheter RNAse-hämmare. Tillsätt sedan 400 mikroliter förkylda glaspärlor med en ungefärlig storlek på 425 till 600 mikron. Överför blandningen till ett 1,5 ml centrifugrör med glaspärlorna och stör jästcellerna genom kraftig omrörning i en pärlvisp i fem minuter.Efter att ha stört cellerna, klargöra lysatet genom centrifugering. Bestäm koncentrationen av RNA i det klarade lysatet genom att mäta absorbansen vid 260 nanometer med användning av ett fluorescensbaserat RNA-detektionssystem. Se till att RNA-koncentrationen är 0,5 till ett mikrogram per mikroliter.Om RNA-koncentrationen är för låg, minska volymen av extraktionsbuffert som används för att återsuspendera cellerna. Ladda försiktigt lysatet på toppen av övertoningarna. Placera pipettspetsen mot innerväggen högst upp på polypropenröret.Vinkla röret och fördela långsamt lysatet på toppen av lutningen och dribbla mot väggen. Placera försiktigt rören i de förkylda hinkarna på en svängande skoprotor och centrifugera lutningarna. Efter centrifugering, avlägsna försiktigt centrifugrören från den svängande skoprotorn och placera dem i en rörhållare.Märk 96-brunnsplattorna för att lagra fraktionerna och förkyla på is. Samla 100 eller 200 mikroliterfraktioner från toppen av lutningen genom att försiktigt sätta in en pipettspets i toppen av lutningen och samla fraktionerna tills hela lutningen är alikvoterad. Mät absorbansen för varje fraktion vid 254 nanometer med en spektrofotometer mot 7 och 47% sackaroslösningarna som ämnen.Skapa polysomprofilen genom att plotta bråktalet kontra absorbansen. Tre representativa polysomprofiler från jäst S.Cerevisiae, visas. Kammen på varje ribosomal underenhet och polysomtopp är uppenbar på varje profil.En representativ profil från ett automatiserat densitetsfraktioneringssystem visas här. Denna profil framställdes från en kontinuerlig absorbansprofil när sackarosgradienten förskjutits från botten upp av en jaktlösning, genom en detektorflödescell och samlades i fraktioner. Polysomprofilen som genereras genom handfraktionering av 200- och 100 mikroliterprover visas här.Det viktigaste att komma ihåg med denna procedur är att inte störa lutningarna. Var försiktig så att du inte introducerar luftbubblor eller stör lutningen genom att dispensera lösningen för snabbt. Efter denna procedur kan RNA extraheras från gradienterna för vidare analys för att bestämma mRNA som associeras med aktiva ribosomer

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Hjärnmembranfraktioner: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Tillvägagångssätt för att utvärdera lokalisering av subsynaptisk protein

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

Fraktionering för upplösning av lösliga och olösliga Huntingtin arter

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome profilering i Leishmania, mänskliga celler och mus Testis

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Upptäckt av små GTPase Prenylation och GTP bindande använder membran fraktionering och GTPase-linked Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

Manipulera levande celler att bygga stabila 3D cellulära montering utan konstgjorda byggnadsställning

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

Identifiering av havet nejonöga feromoner med hjälp av Bioassay-guidad fraktionering

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

Cell fraktionering av U937 celler i avsaknad av höghastighetståg centrifugering

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptid profilering och identifiering illustrerad av angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Mätning av interaktioner mellan fluorescerande sonder och lignin i Plant sektioner av sFLIM baserat på ursprunglig Autofluorescence

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Högupplöst Complexome-profilering genom att Cryoslicing BN-MS Analysis

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...