Name: polysome profiling without gradient makers or fractionation systems
Uploaded: 2021-06-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems at JoVE.com

Yazarlar, Dr. Percy Tumbale ve Dr. Melissa Wells'e bu makaleyi eleştirel okumaları için teşekkür eder. Bu çalışma ABD Ulusal Sağlık Enstitüsü Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir; ABD Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü (NIEHS; ZIA ES103247 ila R.E.S).

1. %7 -%47 sakkaroz gradyanlarının hazırlanması
NOT: Sakkaroz gradyanının doğrusal aralığı, kullanılan hücre tipine bağlı olarak daha iyi ayırma elde etmek için değiştirilebilir. Bu protokol, S. cerevisiae için polizom profilleri için optimize edilmiştir.
<ol><li>Sakkaroz gradyan tamponunda %7 ve %47 sakarozlu stok çözeltileri hazırlayın (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2 ve 1 mM DTT). Filtre, sakkaroz stok çözeltilerini 0,22 μm'lik...

<ol>
	<li>Choi, A., Barrientos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sucrose+gradient+sedimentation+analysis+of+mitochondrial+ribosomes.">Sucrose gradient sedimentation analysis of mitochondrial ribosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 2192, 211-226 (2021).</li><li>Dos Santos, R. F., Barria, C., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+analysis+of+bacterial+ribosomes+through+sucrose+gradient+ultracentrifugation.">Isolation and analysis of bacterial ribosomes through sucrose gradient ultracentrifugation.</a> Methods in Molecular Biology. 2106, 299-310 (2020).</li><li>Pringle, E. S., McCormick, C., Cheng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+profiling+analysis+of+mRNA+and+associated+proteins+engaged+in+translation.">Polysome profiling analysis of mRNA and associated proteins engaged in translation.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 125 (1), 79 (2019).</li><li>Liang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome-profiling+in+small+tissue+samples.">Polysome-profiling in small tissue samples.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 3 (2018).</li><li>Karamysheva, Z. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+profiling+in+leishmania,+human+cells+and+mouse+testis.">Polysome profiling in leishmania, human cells and mouse testis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e57600 (2018).</li><li>Jin, H. Y., Xiao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Integrated+polysome+profiling+and+ribosome+profiling+method+to+investigate+in+vivo+translatome.">An Integrated polysome profiling and ribosome profiling method to investigate in vivo translatome.</a> Methods in Molecular Biology. 1712, 1-18 (2018).</li><li>Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+translation+using+polysome+profiling.">Analysis of translation using polysome profiling.</a> Nucleic Acids Research. 45 (3), 15 (2017).</li><li>Aboulhouda, S., Di Santo, R., Therizols, G., Weinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate,+streamlined+analysis+of+mrna+translation+by+sucrose+gradient+fractionation.">Accurate, streamlined analysis of mrna translation by sucrose gradient fractionation.</a> Bio-protocol. 7 (19), 2573 (2017).</li><li>Kudla, M., Karginov, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mRNA+translation+by+polysome+profiling.">Measuring mRNA translation by polysome profiling.</a> Methods in Molecular Biology. 1421, 127-135 (2016).</li><li>Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+selective+mRNA+translation+in+mammalian+cells+by+polysome+profiling.">Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e52295 (2014).</li><li>Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+translation+initiation+during+stress+conditions+by+polysome+profiling.">Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51164 (2014).</li><li>Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+fractionation+to+analyze+mRNA+distribution+profiles.">Polysome fractionation to analyze mRNA distribution profiles.</a> Bio-protocol. 7 (3), 2126 (2017).</li><li>Chikashige, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gcn2+eIF2alpha+kinase+mediates+combinatorial+translational+regulation+through+nucleotide+motifs+and+uORFs+in+target+mRNAs.">Gcn2 eIF2alpha kinase mediates combinatorial translational regulation through nucleotide motifs and uORFs in target mRNAs.</a> Nucleic Acids Research. 48 (16), 8977-8992 (2020).</li><li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+footprint+profiling+of+translation+throughout+the+genome.">Ribosome footprint profiling of translation throughout the genome.</a> Cell. 165 (1), 22-33 (2016).</li><li>Ripmaster, T. L., Vaughn, G. P., Woolford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DRS1+to+DRS7,+novel+genes+required+for+ribosome+assembly+and+function+in+Saccharomyces+cerevisiae.">DRS1 to DRS7, novel genes required for ribosome assembly and function in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7901-7912 (1993).</li><li>Lo, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+essential+ribosome+assembly+AAA-ATPase+Rix7.">Cryo-EM structure of the essential ribosome assembly AAA-ATPase Rix7.</a> Nature Communications. 10 (1), 513 (2019).</li><li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grc3+programs+the+essential+endoribonuclease+Las1+for+specific+RNA+cleavage.">Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 5530-5538 (2017).</li><li>Woolford, J. L., Baserga, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+biogenesis+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).</li><li>Klinge, S., Woolford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+assembly+coming+into+focus.">Ribosome assembly coming into focus.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (2), 116-131 (2018).</li><li>Bassler, J., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+ribosome+assembly.">Eukaryotic ribosome assembly.</a> Annual Review of Biochemistry. 88, 281-306 (2019).</li><li>Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+puzzle+of+life:+Crafting+ribosomal+subunits.">A puzzle of life: Crafting ribosomal subunits.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 640-654 (2017).</li><li>Prattes, M., Lo, Y. H., Bergler, H., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+the+nascent+ribosome:+AAA-ATPases+in+eukaryotic+ribosome+biogenesis.">Shaping the nascent ribosome: AAA-ATPases in eukaryotic ribosome biogenesis.</a> Biomolecules. 9 (11), 715 (2019).</li><li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+molecular+crosstalk+within+the+essential+Grc3/Las1+pre-rRNA+processing+complex.">Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex.</a> RNA. 24 (5), 721-738 (2018).</li><li>Hu, W., Coller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+analysis+for+determining+mRNA+and+ribosome+association+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Polysome analysis for determining mRNA and ribosome association in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 530, 193-206 (2013).</li><li>He, S. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+analysis+of+mammalian+cells.">Polysome analysis of mammalian cells.</a> Methods in Enzymolog. 530, 183-192 (2013).</li><li>Anand, M., Chakraburtty, K., Marton, M. J., Hinnebusch, A. G., Kinzy, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+interactions+between+yeast+translation+eukaryotic+elongation+factor+(eEF)+1A+and+eEF3.">Functional interactions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6985-6991 (2003).</li><li>Serikawa, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptome+and+its+translation+during+recovery+from+cell+cycle+arrest+in+Saccharomyces+cerevisiae.">The transcriptome and its translation during recovery from cell cycle arrest in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cell Proteomics: MCP. 2 (3), 191-204 (2003).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li></ol>

Burada, pahalı otomatik fraksiyonasyon sistemleri kullanılmadan polizom profilleri oluşturmanın bir yöntemi açıklanmıştır. Bu yöntemin avantajı, polizom profillemeyi otomatik fraksiyonasyon sistemlerine sahip olmayan laboratuvarlar için erişilebilir hale getirmesidir. Bu protokolün en büyük dezavantajları, sıkıcı el fraksiyonasyonu ve özel yoğunluk fraksiyonasyon sistemine kıyasla daha az hassasiyettir.
Bu protokol, ribozomal alt birimleri, monozomları ve polizomları ...

Ribozomlar, mRNA'yı proteinlere dönüştürmenin temel işlemini gerçekleştiren mega-Dalton ribonükleoprotein kompleksleridir. Ribozomlar, bir hücre içindeki tüm proteinlerin sentezini gerçekleştirmekten sorumludur. Ökaryotik ribozomlar, sedimantasyon katsayılarına göre küçük ribozomal alt birim (40S) ve büyük ribozomal alt birim (60S) olarak adlandırılan iki alt birimden oluşur. Tamamen monte edilmiş ribozom, 80S monozomu olarak adlandırılır. Polizomlar, tek bir mRNA molekülünü çevirmekle uğraşan ribozom gruplarıdır. Sakkaroz yoğunluk gradyanı santrifüjleme ile polizom fraksiyonasyonu, ribozom profilleri oluşturmak, ribozomların çevrilmesiyle ilişkili spesifik mRNA'ları tanımlamak ve polizomla ilişkili faktörleri analiz etmek için kullanılan güçlü bir yöntemdir 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ,13. Bu teknik genellikle polizomları tek ribozomlardan, ribozomal alt birimlerden ve haberci ribonükleoprotein parçacıklarından ayırmak için kullanılır. Fraksiyonasyondan elde edilen profiller, polizomların çeviri aktivitesi14 ve ribozomların montaj durumu15,16,17 hakkında değerli bilgiler sağlayabilir.
Ribozom montajı, ribozom montaj faktörleri18,19,20,21 olarak bilinen bir grup protein tarafından kolaylaştırılan çok karmaşık bir süreçtir. Bu faktörler, ribozom biyogenezi sırasında, ATPazlar, endo ve ekzo-nükleazlar, GTPazlar, RNA helikazlar ve RNA bağlayıcı proteinler22 dahil olmak üzere diğer birçok proteinle etkileşimler yoluyla çok çeşitli işlevler yerine getirir. Polizom fraksiyonasyonu, bu faktörlerin ribozom montajındaki rolünü araştırmak için kullanılan güçlü bir araç olmuştur. Örneğin, bu yöntem, bir pre-rRNA işleme faktörü olan polinükleotid kinaz Grc3'teki mutasyonların ribozom montaj işlemini nasıl olumsuz yönde etkileyebileceğini göstermek için kullanılmıştır17,23. Polizom profilleme ayrıca ATPase Rix7 içindeki korunmuş motiflerin ribozom üretimi için nasıl gerekli olduğunu vurgulamış ve göstermiştir16.
Polizom fraksiyonasyonu prosedürü, ilgilenilen hücrelerden çözünür hücre lizatları yapmakla başlar. Lisat RNA, ribozomal alt birimler ve polizomların yanı sıra diğer çözünür hücresel bileşenleri içerir. Bir ultrasantrifüj tüpü içinde sürekli, doğrusal bir sakkaroz gradyanı yapılır. Hücre lizatının çözünür fraksiyonu, sakkaroz gradyan tüpünün üstüne yavaşça yüklenir. Yüklü gradyan tüpü daha sonra santrifüjlemeye tabi tutulur, bu da hücresel bileşenleri sakkaroz gradyanı içindeki boyuta göre yerçekimi kuvveti ile ayırır. Daha büyük bileşenler, gradyana daha küçük bileşenlerden daha fazla gider. Degradenin üst kısmı daha küçük, daha yavaş hareket eden hücresel bileşenleri barındırırken, altta daha büyük, daha hızlı hareket eden hücresel bileşenler bulunur. Santrifüjlemeden sonra, tüpün içeriği fraksiyonlar halinde toplanır. Bu yöntem ribozomal alt birimleri, monozomları ve polizomları etkili bir şekilde ayırır. Her fraksiyonun optik yoğunluğu daha sonra spektral absorbansın 254 nm dalga boyunda ölçülmesiyle belirlenir. Absorbans ve fraksiyon sayısının çizilmesi polizom profili verir.
Doğrusal sakkaroz yoğunluk gradyanları, bir gradyan oluşturucu kullanılarak üretilebilir. Santrifüjlemeyi takiben, gradyanlar genellikle fraksiyone edilir ve absorbanslar otomatik bir yoğunluk fraksiyonasyonsistemi 3,7,13,24,25 kullanılarak ölçülür. Bu sistemler polizom profilleri üretmek için çok iyi çalışsa da, pahalıdır ve bazı laboratuvarlar için maliyet engelleyici olabilir. Burada, bu aletleri kullanmadan polizom profilleri oluşturmak için bir protokol sunulmaktadır. Bunun yerine, bu protokol tipik olarak çoğu moleküler biyoloji laboratuvarında bulunan ekipmanı kullanır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automatic Fractionator</td>
			<td>Brandel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clariostar Multimode Plate Reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15508-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads, acid washed</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td>425&#8211;600 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, 1 M</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>CAC-5290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 22 G, Metal Hub</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>7748-08</td>
			<td>custom length 9 inches, point style 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XL-100K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Centrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Test Tube Peg Rack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-810-54A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q33228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit RNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Inhibitor</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N8080119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 3 mL</td>
			<td>Coviden</td>
			<td>888151394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, 1 M,&#160; pH 7.4</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Star Microplate, 96 wells</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655801</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polysome profiling without gradient makers or fractionation systems

Sakkaroz yoğunluk gradyanı santrifüjleme ile polizom fraksiyonasyonu, ribozom profilleri oluşturmak, ribozomlar tarafından çevrilen spesifik mRNA'ları tanımlamak ve polizomla ilişkili faktörleri analiz etmek için kullanılabilecek güçlü bir araçtır. Otomatik gradyan üreticileri ve gradyan fraksiyonasyon sistemleri bu teknikle yaygın olarak kullanılırken, bu sistemler genellikle pahalıdır ve sınırlı kaynaklara sahip laboratuvarlar için maliyet engelleyici olabilir veya araştırmaları için bu yöntemi nadiren veya ara sıra gerçekleştirme ihtiyaçları nedeniyle masrafı haklı çıkaramazlar. Burada, özel fraksiyonasyon aletleri olmadan çoğu moleküler biyoloji laboratuvarında bulunan standart ekipmanı kullanarak çoğaltılabilir polizom profilleri üretmek için bir protokol sunulmaktadır. Ayrıca, gradyan fraksiyonasyon sistemi olan ve olmayan polizom profillerin karşılaştırılması sağlanmaktadır. Tekrarlanabilir polizom profillerini optimize etme ve üretme stratejileri tartışılmaktadır. Saccharomyces cerevisiae bu protokolde model organizma olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu protokol birçok farklı organizma ve hücre tipi için ribozom profilleri oluşturmak üzere kolayca değiştirilebilir ve uyarlanabilir.

Şekil 3'te üç temsili polizom profili gösterilmiştir. Tüm profiller aynı maya suşundan gelmektedir. Tipik bir polizom profili, 40S, 60S ve 80S ribozomal alt birimleri ve polizomlar için iyi çözülmüş zirvelere sahip olacaktır. Her ribozomal alt birimin tepesi ve polizom zirvesi her profilde belirgin olacaktır (Şekil 3). Otomatik yoğunluk fraksiyonasyon sisteminden temsili bir profil Şekil 3A'da gösterilmiştir. Bu...

Watch this Scientific Journal Video about Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems at JoVE.com

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Bu protokol, otomatik gradyan üreticileri veya gradyan fraksiyonasyon sistemleri kullanmadan bir çoklu profilin nasıl oluşturulacağını açıklar.

Degrade Yapıcılar veya Fraksiyonasyon Sistemleri Olmadan Polizom Profilleme

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

Bu protokol, hücre içindeki ribozomların aktivitesi hakkında moleküler ayrıntıları ortaya çıkaran bir polizom profilinin nasıl oluşturulacağını açıklar. Bu teknik, kullanıcıların otomatik gradyan fraksiyonasyon sistemlerine erişimi olmayan bir polizom profili tarafından sağlanan değerli bilgileri elde etmelerini sağlar. Degradeleri hazırlarken zaman ayırın ve gradyanları, doğrusal bir gradyana yerleşirken bir kompresör veya diğer mekanik işlemler tarafından bozulmayacakları bir yerde saklayın.Başlamak için, sakkaroz gradyan tamponunda% 7 ve% 47 sakkaroz stok çözeltileri hazırlayın. Filtre, sakkaroz stok çözeltilerini 0,22 mikronluk bir filtreyle sterilize eder. %7 ve %47'lik stok çözeltilerini dağıtarak ve karıştırarak 17, 27 ve %37 oranında sakkaroz çözeltisi hazırlayın.Altı polipropilen santrifüj tüpünü tam görünümlü bir test tüpü rafına yerleştirin. Tüpler arasında yeterli boşluk olduğundan emin olun, böylece bir tüple yapılan hareketler diğerlerini rahatsız etmez. Üç mililitrelik bir şırıngaya künt uçlu dokuz inçlik, 22 gauge bir iğne takın ve şırınganın gradyanları ayarlamadan önce sakkaroz çözeltisini damlamadan tutabilmesini sağlamak için bir test dolgusu yapın ve dağıtın.Her santrifüj tüpünün dibine iki mililitre %7 sakkaroz ekleyin. Daha sonra, iğne ucunu tüp tabanının hemen yakınına yerleştirerek% 7'lik çözeltinin altına% 17 sakarozun iki mililitresini ekleyin. Çözeltiyi dikkatlice ve yavaşça dağıtın.Prosedürü% 27, 37 ve% 47 sakkaroz çözeltisinin her biri iki mililitre ile tekrarlayın, her katmanın diğerinden yoğunlukların ayrılmasını gösteren bir çizgi ile ayırt edilebilmesini sağlayın. Gradyanları, sürekli, artan bir sakkaroz yüzdesine yerleşmelerini sağlamak için gece boyunca dört santigrat derecede saklayın. Mayanın büyümesi ve toplanmasından sonra, Saccharomyces cerevisiae hücreleri, soğutulmuş 700 mikrolitre polizom ekstraksiyon tamponunda hücreleri yeniden askıya alır.100 birim RNAse İnhibitörü ekleyin. Ardından, yaklaşık 425 ila 600 mikron boyutunda 400 mikrolitre önceden soğutulmuş cam boncuk ekleyin. Karışımı cam boncuklarla 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve maya hücrelerini beş dakika boyunca bir boncuk çırpıcıda kuvvetli ajitasyonla bozun.Hücreleri bozduktan sonra, santrifüjleme ile lizatı netleştirin. Floresan tabanlı bir RNA algılama sistemi kullanarak, absorbansı 260 nanometrede ölçerek arıtılmış lizattaki RNA konsantrasyonunu belirleyin. RNA konsantrasyonunun mikrolitre başına 0,5 ila bir mikrogram olduğundan emin olun.RNA konsantrasyonu çok düşükse, hücreleri askıya almak için kullanılan ekstraksiyon tamponunun hacmini azaltın. Lisatı dikkatlice gradyanların üstüne yükleyin. Pipet ucunu polipropilen tüpün üst kısmındaki iç duvara yaslayın.Tüpü açın ve lizatı yavaşça gradyanın üstüne dağıtın, duvara doğru sürün. Tüpleri yavaşça sallanan bir kova rotorunun önceden soğutulmuş kovalarına yerleştirin ve gradyanları santrifüj edin. Santrifüjlemeden sonra, santrifüj tüplerini sallanan kova rotorundan dikkatlice çıkarın ve bir tüp tutucuya yerleştirin.Fraksiyonları saklamak ve buz üzerinde önceden soğutmak için 96 kuyucuklu plakaları etiketleyin. Degradenin tepesinden başlayarak 100 veya 200 mikrolitre fraksiyonu toplayın, gradyanın üstüne dikkatlice bir pipet ucu yerleştirin ve tüm gradyan aliquote olana kadar fraksiyonları toplayın. Her fraksiyonun 254 nanometredeki emilimini,% 7 ve% 47 sakkaroz çözeltilerine karşı boşluk olarak bir spektrofotometre ile ölçün.Kesir sayısını absorbansa karşı çizerek çoklu profili oluşturun. Maya S.Cerevisiae'den üç temsili polizom profili gösterilmiştir. Her ribozomal alt birimin tepesi ve polizom zirvesi her profilde belirgindir.Otomatik yoğunluk fraksiyonasyon sisteminden temsili bir profil burada gösterilmiştir. Bu profil, sakkaroz gradyanı aşağıdan yukarıya doğru bir kovalama çözeltisi ile, bir dedektör akış hücresi aracılığıyla yer değiştirdiği ve fraksiyonlar halinde toplandığı için sürekli bir absorbans profilinden üretildi. 200 ve 100 mikrolitrelik numunelerin elle parçalanmasıyla oluşturulan polizom profili burada gösterilmiştir.Bu prosedürle hatırlanması gereken en önemli şey, gradyanları bozmamaktır. Hava kabarcıkları sokmamaya veya çözeltiyi çok hızlı dağıtarak gradyanı bozmamaya dikkat edin. Bu prosedürü takiben, RNA, aktif ribozomlarla ilişkili mRNA'ları belirlemek için daha fazla analiz için gradyanlardan ekstrakte edilebilir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Beyin Membranı Fraksiyonu: Bir<emEx Vivo</em&gt; Subsınaptik Protein Lokalizasyonunu Değerlendirmede Yaklaşım

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

Çözünür ve çözünmez Huntingtin türler çözümlenmesi için ayırma

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome LEISHMANIA, insan hücreleri ve fare Testis profil oluşturma

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Küçük GTPazlar prenilasyon ve bağlayıcı kullanarak membran ayırma ve GTPazlar bağlı Immunosorbent Assay GTP tespiti

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

Canlı hücreler yapay iskele olmayan istikrarlı 3D hücresel derleme oluşturmak için değiştirme

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

Bioassay-güdümlü ayırma kullanarak deniz taşemen Feromonlar tanımlaması

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

Yüksek hızlı Santrifüjü yokluğunda U937 hücrelerinin hücre ayırma

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Anjiyotensin II tarafından gösterilen nitropeptid profil oluşturma ve tanımlama

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Floresan Problar ve Lignin Bitki Kesitlerinde Doğal Otofloresan Dayalı SFLIM Ile Etkileşimlerinin Ölçülmesi

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

BN-MS Analizi Cryoslicing tarafından Yüksek Çözünürlüklü Complexome Profilleme

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...