Name: spatio-temporal in vivo imaging of ocular drug delivery systems using fiberoptic confocal laser microendoscopy
Uploaded: 2021-09-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy at JoVE.com

تم تمويل هذا البحث من قبل منحة NTU-Northwestern Institute for Nanomedicine (NNIN) الممنوحة (إلى SV) وجزئيا من قبل منحة مؤسسة سنغافورة الوطنية للبحوث AG/CIV/GC70-C/NRF/2013/2 ومنحة صندوق محاذاة الصناعة للصحة والعلوم الطبية الحيوية (HBMS) في سنغافورة H18/01/a0/018 التي تديرها وكالة العلوم والتكنولوجيا والبحوث (A*STAR) (إلى AMC). شكرا لأعضاء من مختبر Duke-NUS للتصوير الانتقالي والجزيئي (LTMI) لتسهيل الخدمات اللوجستية وتنفيذ الدراسات والتدريب على المعدات. شكر خاص للسيدة ويسنا نوفيرا على مساعدتها التحريرية.

تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) في SingHealth (سنغافورة). تم الحصول على إناث الفئران C57BL/6 J (6-8 أسابيع ؛ 18-20 جم) من InVivos ، سنغافورة ، وتم وضعها في درجة حرارة و vivarium التي يتم التحكم فيها بالضوء في كلية الطب Duke-NUS ، سنغافورة. تم التعامل مع الح...

<ol>
	<li>Chaw, S. Y., Novera, W., Chacko, A. -. M., Wong, T. T. L., Venkatraman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fate+of+liposomes+after+subconjunctival+ocular+delivery.">In vivo fate of liposomes after subconjunctival ocular delivery.</a> Journal of Controlled Release. 329, 162-174 (2021).</li><li>Kuo, J. C. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+colorectal+dysplasia+using+fluorescently+labelled+lectins.">Detection of colorectal dysplasia using fluorescently labelled lectins.</a> Scientific Reports. 6 (1), 24231 (2016).</li><li>Wu, Y. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+custom+multiphoton+microscopy+platform+for+live+imaging+of+mouse+cornea+and+conjunctiva.">A custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60944 (2020).</li><li>Zhivov, A., Stachs, O., Kraak, R., Stave, J., Guthoff, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+confocal+microscopy+of+the+ocular+surface.">In vivo confocal microscopy of the ocular surface.</a> The Ocular Surface. 4 (2), 81-93 (2006).</li><li>Bassyouni, F., ElHalwany, N., Ab del Rehim, M., Neyfeh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+new+technologies+applied+in+controlled+drug+delivery+system.">Advances and new technologies applied in controlled drug delivery system.</a> Research on Chemical Intermediates. 41 (4), 2165-2200 (2015).</li><li>Sercombe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+challenges+of+liposome+assisted+drug+delivery.">Advances and challenges of liposome assisted drug delivery.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, (2015).</li><li>Koning, G. A., Storm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+drug+delivery+systems+for+the+intracellular+delivery+of+macromolecular+drugs.">Targeted drug delivery systems for the intracellular delivery of macromolecular drugs.</a> Drug Discovery Today. 8 (11), 482-483 (2003).</li><li>Metselaar, J. M., Storm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+in+the+treatment+of+inflammatory+disorders.">Liposomes in the treatment of inflammatory disorders.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 2 (3), 465-476 (2005).</li><li>Ding, B. S., Dziubla, T., Shuvaev, V. V., Muro, S., Muzykantov, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+drug+delivery+systems+that+target+the+vascular+endothelium.">Advanced drug delivery systems that target the vascular endothelium.</a> Molecular Interventions. 6 (2), 98-112 (2006).</li><li>Hua, S., Wu, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+lipid-based+nanocarriers+for+targeted+pain+therapies.">The use of lipid-based nanocarriers for targeted pain therapies.</a> Frontiers in Pharmacology. 4, 143 (2013).</li><li>Sharma, A., Sharma, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+in+drug+delivery:+Progress+and+limitations.">Liposomes in drug delivery: Progress and limitations.</a> International Journal of Pharmaceutics. 154 (2), 123-140 (1997).</li><li>Abrishami, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+characterization,+and+in+vivo+evaluation+of+nanoliposomes-encapsulated+Bevacizumab+(Avastin)+for+intravitreal+administration.">Preparation, characterization, and in vivo evaluation of nanoliposomes-encapsulated Bevacizumab (Avastin) for intravitreal administration.</a> Retina. 29 (5), 699-703 (2009).</li><li>Pleyer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+absorption+of+cyclosporine+A+from+liposomes+incorporated+into+collagen+shields.">Ocular absorption of cyclosporine A from liposomes incorporated into collagen shields.</a> Current Eye Research. 13 (3), 177-181 (1994).</li><li>Shen, Y., Tu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+ocular+pharmacokinetics+of+ganciclovir+liposomes.">Preparation and ocular pharmacokinetics of ganciclovir liposomes.</a> The AAPS Journal. 9 (3), 371-377 (2007).</li><li>Weijtens, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concentration+of+dexamethasone+in+aqueous+and+vitreous+after+subconjunctival+injection.">High concentration of dexamethasone in aqueous and vitreous after subconjunctival injection.</a> American Journal of Ophthalmology. 128 (2), 192-197 (1999).</li><li>Voss, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+injectable+drug+delivery+system+for+subconjunctival+glaucoma+treatment.">Development of a novel injectable drug delivery system for subconjunctival glaucoma treatment.</a> Journal of Controlled Release. 214, 1-11 (2015).</li><li>Giarmoukakis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+nanoparticles+for+controlled+subconjunctival+delivery+of+latanoprost+acid:+In+vitro+and+in+vivo+evaluation.+Preliminary+results.">Biodegradable nanoparticles for controlled subconjunctival delivery of latanoprost acid: In vitro and in vivo evaluation. Preliminary results.</a> Experimental Eye Research. 112, 29-36 (2013).</li><li>Shah, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal+and+subconjunctival+melphalan+for+retinoblastoma+in+transgenic+mice.">Intravitreal and subconjunctival melphalan for retinoblastoma in transgenic mice.</a> Journal of Ophthalmology. 2014, 829879 (2014).</li><li>Dastjerdi, M. H., Sadrai, Z., Saban, D. R., Zhang, Q., Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+Penetration+of+Topical+and+Subconjunctival+Bevacizumab.">Corneal Penetration of Topical and Subconjunctival Bevacizumab.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 52 (12), 8718-8723 (2011).</li><li>Ezra-Elia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+an+in+vivo+imaging+system+be+used+to+determine+localization+and+biodistribution+of+AAV5-mediated+gene+expression+following+subretinal+and+intravitreal+delivery+in+mice.">Can an in vivo imaging system be used to determine localization and biodistribution of AAV5-mediated gene expression following subretinal and intravitreal delivery in mice.</a> Experimental Eye Research. 176, 227-234 (2018).</li><li>Movila, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+endoscopic+technology+for+real-time+monitoring+of+inflammation+caused+in+experimental+periodontitis.">Intravital endoscopic technology for real-time monitoring of inflammation caused in experimental periodontitis.</a> Journal of Immunological Methods. 457, 26-29 (2018).</li><li>Vanherp, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoscopic+fibered+confocal+fluorescence+microscopy+for+longitudinal+in+vivo+assessment+of+pulmonary+fungal+infections+in+free-breathing+mice.">Bronchoscopic fibered confocal fluorescence microscopy for longitudinal in vivo assessment of pulmonary fungal infections in free-breathing mice.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3009 (2018).</li><li>Chagnon, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+intravital+endoscopic+confocal+fluorescence+microscopy+of+normal+and+acutely+injured+rat+lungs.">In vivo intravital endoscopic confocal fluorescence microscopy of normal and acutely injured rat lungs.</a> Laboratory Investigation. 90 (6), 824-834 (2010).</li><li>Yun, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+near-infrared+fluorescence+conjugation+on+the+anti-cancer+potential+of+cetuximab.">The effect of near-infrared fluorescence conjugation on the anti-cancer potential of cetuximab.</a> Laboratory Animal Research. 34 (1), 30-36 (2018).</li></ol>

كما هو موضح من النتائج ، يوفر CLM طريقة بسيطة ومجدية لتصوير التوزيع العيني للجسيمات الشحمية في العين. لقد أظهرنا سابقا استخدام CLM لتوصيف توطين التركيبات الشحمية المختلفة داخل عين الفأر بمرور الوقت1. بالنسبة للتطبيقات غير الغازية ، يسمح CLM بالتصوير في الوقت الفعلي لسطح العين الأ...

إن إزالة الدم وتوزيع الأنسجة والإشغال المستهدف للعقاقير في الأنظمة الحية هي ركائز لفهم التصرف في الأدوية في الجسم الحي. في النماذج الحيوانية قبل السريرية ، يتم تقييم هذه المعلمات عادة عن طريق أخذ عينات الدم والأنسجة بشكل متكرر في نقاط زمنية معينة بعد إعطاء الدواء. ومع ذلك ، فإن هذه الإجراءات غازية بشكل عام ، وغالبا ما تتضمن قياسات عدم البقاء على قيد الحياة ، وتتطلب مجموعات كبيرة من الحيوانات للتشغيل الإحصائي. قد تكون هناك تكلفة إضافية ووقت متكبد ، إلى جانب المخاوف الأخلاقية للاستخدام المفرط للحيوانات. ونتيجة لذلك ، أصبح التصوير غير الجراحي بسرعة خطوة أساسية في دراسات التوزيعات الحيوية. يعد التنظير المجهري بالليزر البؤري (CLM1,2) مناسبا تماما للتطبيقات العينية لتصوير التوزيع المكاني والزماني للعلاجات بشكل غير جراحي في عيون الحيوانات الحية ذات الحساسية العالية والدقة العالية1,3,4.
لدى CLM القدرة على تسهيل الفحص القوي لأنظمة توصيل الأدوية العينية (DDS) ، مثل الجسيمات الشحمية ، قبل التحديد الكمي الشامل ل DDS والتوافر البيولوجي للأدوية. الجسيمات الشحمية جذابة لمرونتها في ضبط خصائصها الفيزيائية والكيميائية الحيوية5،6،7،8،9،10،11 لتغليف مجموعة كبيرة ومتنوعة من البضائع العلاجية والتحكم في موقع الأنسجة لإطلاق الدواء ومدة العمل. تم استخدام الجسيمات الشحمية في تطبيقات العين لتوصيل جزيئات كبيرة ، مثل الجسم المضاد أحادي النسيلة bevacizumab12 ، والجزيئات الصغيرة مثل السيكلوسبورين13 و ganciclovir14. الجسيمات الشحمية المحملة بالأدوية لها عمر نصف بيولوجي أطول وتأثيرات علاجية طويلة الأمد مقارنة بتركيبات "الدواء الحر" غير الشحمية. ومع ذلك ، عادة ما يتم استقراء توزيع الدواء في أنسجة العين من تركيزات المخدرات في المكونات السائلة للعين (أي الدم ، والفكاهة المائية ، والفكاهة الزجاجية 15،16،17). نظرا لأن المصير الأولي في الجسم الحي لشحنة الدواء المحملة يتم تحديده من خلال خصائص الناقل النانوي نفسه ، فإن تصوير CLM للجسيمات الشحمية الفلورية يمكن أن يكون بمثابة بديل للدواء للكشف عن استهداف الأنسجة وأوقات إقامة الأنسجة في الموقع. علاوة على ذلك ، يمكن للأدلة المرئية على التسليم باستخدام CLM توجيه إعادة تصميم DDS ، وتقييم الفوائد العلاجية للدواء ، وربما حتى التنبؤ بالأحداث البيولوجية الضارة (على سبيل المثال ، سمية الأنسجة بسبب التوطين غير المرغوب فيه ل DDS لفترات طويلة من الزمن).
هنا ، يتم تفصيل إجراء خطوة بخطوة حول كيفية دراسة التوزيع الحيوي للجسيمات الشحمية في العين في الفئران الحية باستخدام نظام CLM ثنائي النطاق. يمكن لنظام CLM المحدد هذا اكتشاف التألق بلونين (مع ليزر الإثارة الأخضر والأحمر عند 488 نانومتر و 660 نانومتر) في الوقت الفعلي ، بتردد 8 إطارات / ثانية. من خلال وضع مسبار الكشف جسديا على العين ، يوضح البروتوكول الحصول على صورة وتحليل الجسيمات الشحمية الفلورية الخضراء عند تناولها تحت الملتحمة في الفئران التي تم حقنها مسبقا عن طريق الوريد (IV) مع صبغة إيفانز بلو (EB) بنسبة 2٪. تساعد صبغة EB على تصور الهياكل الوعائية في قناة التألق الحمراء. نعرض نتائج تمثيلية من دراسة تقيم الجسيمات الشحمية المحايدة 100 نانومتر المكونة من الفوسفوليبيد POPC (أي 1-بالميتويل-2-أوليويل-غليسيرو-3-فوسفوكولين) والمنشطات مع الفوسفوليبيد Fl-DHPE الموسوم بالفلوريسين (أي N-(فلوريسين-5-ثيوكاربامويل) -1,2-dihexa-decanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine) بنسبة 95٪ POPC: 5٪ Fl-DHPE (الشكل 1B ). CLM قادر على التقاط الجسيمات الشحمية الخضراء الموسومة بالفلوريسين عند 15 ميكرومتر محوري و 3.30 ميكرومتر جانبي عن طريق ترسيم حدود أنسجة العين الملطخة ب EB.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.08 &#181;m polycarbonate filter</td>
			<td>Whatman, USA</td>
			<td>110604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Fisherbrand, Ireland</td>
			<td>09-720-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution</td>
			<td>Alcon, Singapore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Glass Syringe</td>
			<td>Hamilton, USA</td>
			<td>65460-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti, USA</td>
			<td>850457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 G needle (Hamilton, 0.5&#8221; PT4)</td>
			<td>Hamilton, USA</td>
			<td>7803-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm)</td>
			<td>WPI, USA</td>
			<td>ATC 2000 &#38; 61800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5)</td>
			<td>Mauna Kea Technologies, France</td>
			<td></td>
			<td>Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 &#181;m x 500 &#181;m, axial resolution: 15 &#181;m, lateral resolution: 3.3 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>472476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers #5, Dumostar</td>
			<td>WPI, USA</td>
			<td>500233</td>
			<td>11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans Blue</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>E2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fusidic acid eye drop</td>
			<td>LEO Pharma, Denmark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Malvern Panalytical, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>179337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Extruder</td>
			<td>Avanti, USA</td>
			<td>610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE)</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>F362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope System with table clamp stand</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td>SZ51 &#38; SZ2-STU3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatio-temporal in vivo imaging of ocular drug delivery systems using fiberoptic confocal laser microendoscopy

الحقن تحت الملتحمة هو طريق جذاب لإدارة أدوية العين بسبب سهولة الوصول عبر الصلبة التي تتجاوز حواجز العين الأمامية ، مثل القرنية والملتحمة. في حين تم وصف الآثار العلاجية والحركية الدوائية للأدوية عند الحقن تحت الملتحمة في بعض الدراسات ، فإن عددا قليلا جدا منها يقيم التوزيع العيني للأدوية أو أنظمة توصيل الدواء (DDS). هذا الأخير أمر بالغ الأهمية لتحسين تصميم DDS داخل العين والتوافر البيولوجي للأدوية لتحقيق التوطين العيني المطلوب ومدة العمل (على سبيل المثال ، الحادة مقابل الطويلة). تثبت هذه الدراسة استخدام المجهر بالليزر البؤري الليفي البصري (CLM) لدراسة نوعية للتوزيع العيني للجسيمات الشحمية الفلورية في الوقت الفعلي في الفئران الحية بعد الحقن تحت الملتحمة. كونها مصممة للفحص البصري في الجسم الحي للأنسجة على المستوى المجهري ، وهذا هو أيضا أول وصف كامل لطريقة التصوير CLM لدراسة التوزيع المكاني والزماني للحقن في العين بعد الحقن تحت الملتحمة.

يوضح البروتوكول فائدة CLM لتقييم التوزيع العيني المكاني الصدغي للجسيمات الشحمية الفلورية الخضراء التي تدار عن طريق الحقن تحت الملتحمة. للاستفادة من القدرة المزدوجة اللون (488 نانومتر و 660 نانومتر من الأطوال الموجية للإثارة) لنظام CLM ، تم تخدير الجسيمات الشحمية POPC المحايدة التي سيتم حقنها ب 5?...

Watch this Scientific Journal Video about Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy at JoVE.com

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

نقدم بروتوكولا لاستخدام المجهري بالليزر البؤري الليفي البصري (CLM) لدراسة التوزيع المكاني الصدغي للجسيمات الشحمية في العين بشكل غير جراحي بعد الحقن تحت الملتحمة.

التصوير المكاني الصدغي في الجسم الحي لأنظمة توصيل الأدوية العينية باستخدام المجهر الليزري البؤري الليفي البصري

Subconjunctival injection is an attractive route to administer ocular drugs due to easy trans-scleral access that bypasses anterior ocular barriers, such ...

يسهل هذا البروتوكول فحص التركيبات الجديدة لفهم أفضل لكيفية تأثير التعديلات على أوقات إقامة الأنسجة ، وهو أمر بالغ الأهمية في تصميم نظام مثالي لتوصيل الأدوية. هذه التقنية غير جراحية وتسمح بالتصوير في الوقت الفعلي ، مما يقلل من الاستخدام المفرط للحيوانات لأخذ العينات. يمكن إعادة تصميم أنظمة توصيل الأدوية للتصوير والتطبيقات العلاجية ببساطة عن طريق تضمين الدواء العلاجي والتصوير التصويري في ناقل نانو واحد.هذا له تطبيقات مفيدة في كل من علاج السرطان والأمراض المعدية. ستعرض الإجراء رشا مسلم ، وهي زميلة أبحاث أقدم من مختبري. بادئ ذي بدء ، قبل ساعتين من الحقن تحت الملتحمة ، حقن الفأر عن طريق الوريد عن طريق الذيل مع 2.5 ملليغرام لكل كيلوغرام من إيفانز الأزرق ، أو EB. بعد تخدير الماوس بنسبة 5٪ isoflurane ، انقل الماوس إلى مخروط الأنف وحافظ على الماوس المهدئ على وسادة التدفئة.ثم ، قم بتقليم الشعيرات بالقرب من العين المراد حقنها. غرس قطرة من 0.5 ٪ محلول هيدروكلوريد proxymetacaine مباشرة على العين. بعد ذلك ، قم بتحميل حقنة زجاجية 10 ميكرولتر مجهزة بإبرة قياس 32 مع الجسيمات الشحمية الفلورية وتأكد من عدم وجود فقاعات الهواء في المحقنة.باستخدام ملاقط ، ارفع الملتحمة وحقن الجسيمات الشحمية ببطء في الفضاء تحت الملتحمة ، ثم اسحب الإبرة ببطء ، مما يمنع التدفق الخلفي. تأكد من تكوين بليب مملوء بالجسيمات الشحمية الفلورية. قم بإعطاء قطرة حمض fusitic بنسبة 1٪ على العين وراقب الفأر حتى يستعيد وعيه.قم بتشغيل نظام CLM. قم بتوصيل المسبار بنظام CLM. اختر مجال العرض وموقع ملفات الاستحواذ في هذه المرحلة.اضبط شدة الليزر للتأكد من أن الكشف عن التألق للفلوريسين DHPE في النطاق الخطي ، والحفاظ على الكثافة متسقة للمقارنة بين الصور الملتقطة في نقاط زمنية مختلفة. بعد تسخين النظام لمدة 15 دقيقة، قم بمعايرة النظام وفقا لتعليمات الشركة المصنعة باستخدام مجموعة المعايرة التي تحتوي على محاليل التطهير والشطف والفلورو-4 لكل ليزر. باختصار ، ابدأ في المعايرة عن طريق غمر الطرف لمدة خمس ثوان في كل قارورة التطهير ، ثم في قارورة الشطف.اترك الطرف في الهواء لتسجيل الخلفية لتطبيع قيم الخلفية من المجسات الألياف المختلفة ، مما يضمن توحيد الصورة. مرة أخرى ، اغمر الطرف لمدة خمس ثوان في قارورة التطهير ، ثم في قارورة الشطف. بعد ذلك ، اغمر الطرف في القارورة التي تحتوي على الفلورو-4 488-نانومتر لمدة خمس ثوان لتطبيع قيم الإشارة.كرر غمر الطرف لمدة خمس ثوان في قارورة التنظيف متبوعة بقارورة الشطف. احتفظ بالطرف في قارورة الشطف حتى تختفي إشارة التألق المسجلة في الخطوة السابقة. ثم انقل الطرف الموجود في القارورة التي تحتوي على الفلورو-4 660 نانومتر لتطبيع قيم الإشارة من الألياف المختلفة في المسبار.بعد المعايرة، تأكد من أن القيمة أقل من 100 لخلفية المسبار. خلاف ذلك ، قم بإجراء التنظيف المتكرر للمسبار باستخدام قضيب طرف قطني. قم بتشغيل وحدة التحكم في درجة حرارة الحيوان باستخدام وسادة تسخين مرفقة ، واضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية.بعد تغطية وسادة التدفئة بستارة جراحية ، قم بإصلاح مخروط الأنف على وسادة التدفئة. بعد تخدير الماوس باستخدام 5٪ isoflurane في غرفة الحث ، انقل الماوس إلى مخروط الأنف وحافظ على الماوس المخدر على لوحة تسخين. ثم ، غرس قطرة من مخدر 0.5 ٪ محلول هيدروكلوريد proxymetacaine على العين.لغسل سطح العين وتجنب تبلور العدسة ، حافظ على تشحيم العينين عن طريق إسقاط بضع قطرات مالحة. بعد ذلك ، قم بتدوير وضبط عدسة المجهر لعرض عين الماوس بشكل مريح في التركيز المباشر عند تكبير 0.67 مرة. قم بتشغيل الليزر ووضع المسبار مثل القلم مباشرة على منطقة العين المراد تصويرها.بعد ذلك ، ابدأ في تسجيل الاستحواذ لمراقبة التألق في العين في المنطقة موضع الاهتمام. أوقف التسجيل عندما يتم وضع علامة على جميع المناطق وتصنيفها وفقا لخريطة العين لمعرفة موقع المسبار الدقيق في الإطار الدقيق. سيتم حفظ ملفات الاستحواذ تلقائيا كملفات فيديو في الموقع الذي تم اختياره مسبقا.كشف التصوير الفلوري عن تمايز واضح بين منطقتي الصلبة والقرنية. تسبب ارتفاع الأوعية الدموية في episclera والملتحمة في تلطيخ منطقة الصلبة باللون الأحمر مع EB. القرنية ، التي تفتقر إلى الأوعية الدموية ، بدت سوداء. لوحظ التباين الفلوري للعضلي والصلبة في دراسة استمرت سبعة أيام.أكدت الفئران الضابطة المحقونة بصبغة الفلوريسين خصوصية التألق المشتق من الجسيمات الشحمية. كانت كثافة التألق عالية في اليومين الأول والثالث. أدى التألق الأخضر إلى تقليل الجسيمات الشحمية في منطقتي العضل والصلبة مع مرور الوقت.لم تكن الاختلافات في إشارات التألق من اليوم الأول إلى اليوم الثالث بعد الحقن في مناطق الأطراف الصدغية والأطراف العليا كبيرة ، مما يشير إلى تفضيل الجسيمات الشحمية المحايدة على منطقة النسيم ، وخاصة محيط القرنية. بالنسبة للمناطق الصدغية والمتفوقة في اليوم الأول بعد الحقن ، كان التألق في الصلبة أعلى بست مرات منه في الأطراف. بحلول اليوم الثالث والسابع ، انخفضت الجسيمات الشحمية بشكل كبير في الصلبة في المناطق الزمنية والمتفوقة ، ويعزى ذلك إلى آليات إزالة العين.تم الكشف عن أقل كمية من التألق في المناطق الأنفية والسفلية ، بسبب المسافة من موقع الحقن. من المهم تسمية إطارات البقع وفقا لخريطة العين قبل إيقاف التسجيل. حافظ على اتساق شدة الليزر، وحدد الحد الأقصى لقيمة الخلفية للمقارنة المناسبة عبر التجارب المختلفة.بعد تحديد تركيبات الرصاص ، يمكن إجراء دراسات شاملة للحركية الدوائية والتوزيع الحيوي على الحيوانات لدراسة التوافر البيولوجي للدواء ، والتحقق من الفعالية العلاجية لتركيباتها.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

ذات دقة عالية الألياف الضوئية للMicroendoscopy في الموقع الخلوية التصوير

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

فيديو معدل الميكروسكوب متحد البؤر المسح الضوئي وMicroendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

المكانية والزمانية التلاعب من نشاط GTPase الصغيرة على المستوى التحت خلوية وعلى المقياس الزمني من ثانية في الخلايا الحية

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

سقالات الإبلاغ الذاتي للخلية ثقافة 3 الأبعاد

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

نماذج وأساليب لتقييم نقل المخدرات نظم التسليم عبر الحواجز الخلوية

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

تقنية تسمية خالية لتصوير المكانية والزمانية لإفرازات خلية واحدة

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

المتعدد الوسائط التصوير ومنهاج Microendoscopy الطيفي الألياف الرزمة لغير الغازية،<em&gt; في فيفو</em&gt; تحليل الأنسجة

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

تطبيقات تصنيع وتسليم المخدرات من النانوية الحرير

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

تقييم شامل لفعالية وسلامة إيصال الأدوية المستهدفة للمشيمة باستخدام ثلاثة أساليب تكميلية

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

إعداد البروتين إنتاج الخلايا الاصطناعية باستخدام مقتطفات البكتيريا الحرة الخلية، Liposomes ونقل المستحلب

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...