Name: spatio-temporal in vivo imaging of ocular drug delivery systems using fiberoptic confocal laser microendoscopy
Uploaded: 2021-09-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy at JoVE.com

Denne forskning blev finansieret af NTU-Northwestern Institute for Nanomedicin (NNIN) tilskud tildelt (til SV) og dels af Singapore National Research Foundation Grant AG / CIV / GC70-C/NRF/2013/2 og Singapores Health and Biomedical Sciences (HBMS) Industry Alignment Fund Pre-Positioning (IAF-PP) tilskud H18/01/a0/018 administreres af Agency for Science, Technology and Research (A*STAR) (til AMC). Tak til medlemmer fra Duke-NUS Laboratory for Translational and Molecular Imaging (LTMI) for at lette logistikken og udførelsen af studierne og træningen af udstyr. Særlig tak til Ms Wisna Novera for hendes redaktionelle bistand.

Alle metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) i SingHealth (Singapore). Kvindelige C57BL/6 J mus (6- 8 uger gamle; 18-20 g) blev fremstillet fra InVivos, Singapore, og opstaldes i en temperatur og lys-kontrolleret vivarium af Duke-NUS Medical School, Singapore. Dyr blev behandlet i overensstemmelse med retningslinjerne fra Association for Research in Vision and Oftalmology (ARVO) erklæring om brug af dyr i oftalmisk og visionsforskning.
<p class="jove_c...

<ol>
	<li>Chaw, S. Y., Novera, W., Chacko, A. -. M., Wong, T. T. L., Venkatraman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fate+of+liposomes+after+subconjunctival+ocular+delivery.">In vivo fate of liposomes after subconjunctival ocular delivery.</a> Journal of Controlled Release. 329, 162-174 (2021).</li><li>Kuo, J. C. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+colorectal+dysplasia+using+fluorescently+labelled+lectins.">Detection of colorectal dysplasia using fluorescently labelled lectins.</a> Scientific Reports. 6 (1), 24231 (2016).</li><li>Wu, Y. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+custom+multiphoton+microscopy+platform+for+live+imaging+of+mouse+cornea+and+conjunctiva.">A custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60944 (2020).</li><li>Zhivov, A., Stachs, O., Kraak, R., Stave, J., Guthoff, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+confocal+microscopy+of+the+ocular+surface.">In vivo confocal microscopy of the ocular surface.</a> The Ocular Surface. 4 (2), 81-93 (2006).</li><li>Bassyouni, F., ElHalwany, N., Ab del Rehim, M., Neyfeh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+new+technologies+applied+in+controlled+drug+delivery+system.">Advances and new technologies applied in controlled drug delivery system.</a> Research on Chemical Intermediates. 41 (4), 2165-2200 (2015).</li><li>Sercombe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+challenges+of+liposome+assisted+drug+delivery.">Advances and challenges of liposome assisted drug delivery.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, (2015).</li><li>Koning, G. A., Storm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+drug+delivery+systems+for+the+intracellular+delivery+of+macromolecular+drugs.">Targeted drug delivery systems for the intracellular delivery of macromolecular drugs.</a> Drug Discovery Today. 8 (11), 482-483 (2003).</li><li>Metselaar, J. M., Storm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+in+the+treatment+of+inflammatory+disorders.">Liposomes in the treatment of inflammatory disorders.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 2 (3), 465-476 (2005).</li><li>Ding, B. S., Dziubla, T., Shuvaev, V. V., Muro, S., Muzykantov, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+drug+delivery+systems+that+target+the+vascular+endothelium.">Advanced drug delivery systems that target the vascular endothelium.</a> Molecular Interventions. 6 (2), 98-112 (2006).</li><li>Hua, S., Wu, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+lipid-based+nanocarriers+for+targeted+pain+therapies.">The use of lipid-based nanocarriers for targeted pain therapies.</a> Frontiers in Pharmacology. 4, 143 (2013).</li><li>Sharma, A., Sharma, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+in+drug+delivery:+Progress+and+limitations.">Liposomes in drug delivery: Progress and limitations.</a> International Journal of Pharmaceutics. 154 (2), 123-140 (1997).</li><li>Abrishami, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+characterization,+and+in+vivo+evaluation+of+nanoliposomes-encapsulated+Bevacizumab+(Avastin)+for+intravitreal+administration.">Preparation, characterization, and in vivo evaluation of nanoliposomes-encapsulated Bevacizumab (Avastin) for intravitreal administration.</a> Retina. 29 (5), 699-703 (2009).</li><li>Pleyer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+absorption+of+cyclosporine+A+from+liposomes+incorporated+into+collagen+shields.">Ocular absorption of cyclosporine A from liposomes incorporated into collagen shields.</a> Current Eye Research. 13 (3), 177-181 (1994).</li><li>Shen, Y., Tu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+ocular+pharmacokinetics+of+ganciclovir+liposomes.">Preparation and ocular pharmacokinetics of ganciclovir liposomes.</a> The AAPS Journal. 9 (3), 371-377 (2007).</li><li>Weijtens, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concentration+of+dexamethasone+in+aqueous+and+vitreous+after+subconjunctival+injection.">High concentration of dexamethasone in aqueous and vitreous after subconjunctival injection.</a> American Journal of Ophthalmology. 128 (2), 192-197 (1999).</li><li>Voss, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+injectable+drug+delivery+system+for+subconjunctival+glaucoma+treatment.">Development of a novel injectable drug delivery system for subconjunctival glaucoma treatment.</a> Journal of Controlled Release. 214, 1-11 (2015).</li><li>Giarmoukakis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+nanoparticles+for+controlled+subconjunctival+delivery+of+latanoprost+acid:+In+vitro+and+in+vivo+evaluation.+Preliminary+results.">Biodegradable nanoparticles for controlled subconjunctival delivery of latanoprost acid: In vitro and in vivo evaluation. Preliminary results.</a> Experimental Eye Research. 112, 29-36 (2013).</li><li>Shah, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal+and+subconjunctival+melphalan+for+retinoblastoma+in+transgenic+mice.">Intravitreal and subconjunctival melphalan for retinoblastoma in transgenic mice.</a> Journal of Ophthalmology. 2014, 829879 (2014).</li><li>Dastjerdi, M. H., Sadrai, Z., Saban, D. R., Zhang, Q., Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+Penetration+of+Topical+and+Subconjunctival+Bevacizumab.">Corneal Penetration of Topical and Subconjunctival Bevacizumab.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 52 (12), 8718-8723 (2011).</li><li>Ezra-Elia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+an+in+vivo+imaging+system+be+used+to+determine+localization+and+biodistribution+of+AAV5-mediated+gene+expression+following+subretinal+and+intravitreal+delivery+in+mice.">Can an in vivo imaging system be used to determine localization and biodistribution of AAV5-mediated gene expression following subretinal and intravitreal delivery in mice.</a> Experimental Eye Research. 176, 227-234 (2018).</li><li>Movila, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+endoscopic+technology+for+real-time+monitoring+of+inflammation+caused+in+experimental+periodontitis.">Intravital endoscopic technology for real-time monitoring of inflammation caused in experimental periodontitis.</a> Journal of Immunological Methods. 457, 26-29 (2018).</li><li>Vanherp, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoscopic+fibered+confocal+fluorescence+microscopy+for+longitudinal+in+vivo+assessment+of+pulmonary+fungal+infections+in+free-breathing+mice.">Bronchoscopic fibered confocal fluorescence microscopy for longitudinal in vivo assessment of pulmonary fungal infections in free-breathing mice.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3009 (2018).</li><li>Chagnon, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+intravital+endoscopic+confocal+fluorescence+microscopy+of+normal+and+acutely+injured+rat+lungs.">In vivo intravital endoscopic confocal fluorescence microscopy of normal and acutely injured rat lungs.</a> Laboratory Investigation. 90 (6), 824-834 (2010).</li><li>Yun, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+near-infrared+fluorescence+conjugation+on+the+anti-cancer+potential+of+cetuximab.">The effect of near-infrared fluorescence conjugation on the anti-cancer potential of cetuximab.</a> Laboratory Animal Research. 34 (1), 30-36 (2018).</li></ol>

Som det fremgår af resultaterne, CLM giver en enkel og mulig metode til at billedet den okulære fordeling af liposomer i øjet. Vi har tidligere demonstreret brugen af CLM til at karakterisere lokaliseringen af forskellige liposomale formuleringer i museøjet over tid1. Til ikke-invasive anvendelser tillader CLM realtidsbilleddannelse af den forreste okulære overflade for indsigt i, hvordan liposomer fordeles i øjet fra det samme dyr. Dette gør CLM egnet til pre-screen nanocarrier / DDS før ...

Blod clearance, væv distribution, og mål belægning af narkotika i levende systemer er søjler til at forstå in vivo narkotika disposition. I prækliniske dyremodeller vurderes disse parametre typisk ved hyppig blodprøvetagning og vævsprøvetagning på bestemte tidspunkter efter lægemiddeladministration. Men disse procedurer er generelt invasive, omfatter ofte ikke-overlevelsesmålinger og nødvendiggør store dyrekohorter til statistisk kraft. Der kan være ekstra omkostninger og tid, sammen med etiske bekymringer for overdreven brug af dyr. Som et resultat, ikke-invasiv billeddannelse er hurtigt ved at blive et integreret skridt i biodistribution undersøgelser. Konfoktal lasermikroskopi (CLM1,2) er velegnet til okulære anvendelser til ikke-invasivt billede spatio-temporal fordeling af terapeutiske i øjnene af levende dyr med høj følsomhed og høj opløsning1,3,4.
CLM har potentiale til at lette robust screening af okulære lægemiddelleveringssystemer (DDS), såsom liposomer, før omfattende kvantificering af DDS og lægemiddelbiotilgængelighed. Liposomer er attraktive for deres fleksibilitet i tuning deres fysisk-kemiske og biofysiske egenskaber5,6,7,8,9,10,11 at indkapsle et stort udvalg af terapeutisk last og kontrollere vævsstedet for lægemiddelfrigivelse og varigheden af handling. Liposomer er blevet anvendt i okulære applikationer til levering af store molekyler, såsom monoklonale antistof bevacizumab12, og små molekyler som cyclosporin13 og ganciclovir14. Lægemiddel-loaded liposomer har længere biologiske halveringstider og langvarige terapeutiske virkninger i forhold til ikke-liposomale "frie stof" formuleringer. Men, lægemiddelfordeling i okulært væv er typisk ekstrapoleret fra lægemiddelkoncentrationer i væskekomponenter i øjet (dvs. blod, vandig humor, og glasagtig humor15,16,17). Som den oprindelige in vivo skæbne lastet stof last er defineret af egenskaberne af nanocarrier selv, CLM billeddannelse af fluorescerende liposomer kan tjene som en surrogat for stoffet til at afsløre væv målretning og in situ væv bopæl gange. Desuden kan visuelle beviser for levering med CLM styre DDS re-design, evaluere terapeutiske fordele ved lægemidlet, og måske endda forudsige negative biologiske hændelser (f.eks væv toksicitet på grund af uønsket lokalisering af DDS for langvarige perioder).
Heri er en trinvis procedure detaljeret om, hvordan man studerer den okulære biodistribution af liposomer i levende mus med et dual-band CLM-system. Dette specifikke CLM-system kan registrere tofarvet fluorescens (med grønne og røde excitation lasere ved 488 nm og 660 nm) i realtid, med en frekvens på 8 billeder / s. Ved fysisk at placere detektionssonden på øjet demonstrerer protokollen billedopsamling og analyse af grøn-fluorescerende liposomer ved subkonjunktival administration hos mus, der injiceres intravenøst (IV) med 2% Evans Blue (EB) farvestof. EB farvestof hjælper visualisere vascularized strukturer i den røde fluorescens kanal. Vi viser repræsentative resultater fra en undersøgelse, der vurderer 100 nm neutrale liposomer, der består af fosfolipid-POPC (dvs. 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfocholin) og dopet med fluorescein-tagged fosfolipid Fl-DHPE (dvs. N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexa-decanoylsn-glycero-3-fosphoethanolamin) i et forhold på 95% POPC: 5% Fl-DHPE (Figur 1B ). CLM er i stand til at fange de grønne fluorescein-mærkede liposomer ved 15 μm aksial og 3,30 μm lateral opløsning ved afgrænsning af EB-farvede okulære vævsgrænser.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.08 &#181;m polycarbonate filter</td>
			<td>Whatman, USA</td>
			<td>110604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Fisherbrand, Ireland</td>
			<td>09-720-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution</td>
			<td>Alcon, Singapore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Glass Syringe</td>
			<td>Hamilton, USA</td>
			<td>65460-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti, USA</td>
			<td>850457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 G needle (Hamilton, 0.5&#8221; PT4)</td>
			<td>Hamilton, USA</td>
			<td>7803-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm)</td>
			<td>WPI, USA</td>
			<td>ATC 2000 &#38; 61800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5)</td>
			<td>Mauna Kea Technologies, France</td>
			<td></td>
			<td>Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 &#181;m x 500 &#181;m, axial resolution: 15 &#181;m, lateral resolution: 3.3 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>472476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers #5, Dumostar</td>
			<td>WPI, USA</td>
			<td>500233</td>
			<td>11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans Blue</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>E2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fusidic acid eye drop</td>
			<td>LEO Pharma, Denmark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Malvern Panalytical, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>179337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Extruder</td>
			<td>Avanti, USA</td>
			<td>610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE)</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>F362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope System with table clamp stand</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td>SZ51 &#38; SZ2-STU3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatio-temporal in vivo imaging of ocular drug delivery systems using fiberoptic confocal laser microendoscopy

Subkonjunktival injektion er en attraktiv vej til at administrere okulære lægemidler på grund af nem trans-scleral adgang, der omgår forreste okulære barrierer, såsom hornhinden og bindehinden. Mens terapeutiske virkninger og farmakokinetik af lægemidlerne ved subkonjunktival injektion er blevet beskrevet i nogle undersøgelser, meget få vurdere den okulære fordeling af lægemidler eller narkotika leveringssystemer (DDS). Sidstnævnte er afgørende for optimering af intraokulær DDS design og lægemiddelbiotilgængelighed for at opnå den ønskede okulær lokalisering og varighed af handling (f.eks. akut versus langvarig). Denne undersøgelse etablerer brugen af fiberoptisk konfokal lasermikroskopi (CLM) til kvalitativt at studere den okulære fordeling af fluorescerende liposomer i realtid hos levende mus efter subkonjunktival injektion. Da dette er designet til in vivo visuel inspektion af væv på mikroskopisk niveau, er dette også den første fulde beskrivelse af CLM-billeddannelsesmetoden til at studere spatio-temporal fordeling af injectables i øjet efter subkonjunktival injektion.

Protokollen viser nytten af CLM til at vurdere den spatio-tidsmæssige okulære fordeling af grønne fluorescerende liposomer administreres gennem subkonjunktival injektion. For at gøre brug af dual-color kapacitet (488 nm og 660 nm excitation bølgelængder) af CLM-systemet, 100 nm neutral POPC liposomer, der skal injiceres blev dopet med 5% Fl-DHPE (sammensætning og karakterisering data er vist i figur 1B), og EB blev injiceret IV at identificere landemærker i øjet. Tilstedeværelsen a...

Watch this Scientific Journal Video about Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy at JoVE.com

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

Vi præsenterer en protokol for brug af fiberoptisk konfokal lasermikroskopi (CLM) til ikke-invasivt at studere den spatio-tidsmæssige fordeling af liposomer i øjet efter subkonjunktival injektion.

Spatio-temporal In Vivo Imaging af Ocular Drug Delivery Systems ved hjælp af Fiberoptic Confocal Laser Mikroendoskopi

Subconjunctival injection is an attractive route to administer ocular drugs due to easy trans-scleral access that bypasses anterior ocular barriers, such ...

Denne protokol letter screening af nye formuleringer for bedre at forstå, hvordan ændringer påvirker deres vævsboligtider, hvilket er afgørende for at designe et optimalt lægemiddelleveringssystem. Denne teknik er ikke-invasiv og tillader realtidsbilleddannelse, hvilket reducerer overdreven brug af dyr til prøveudtagning. Lægemiddelleveringssystemer kan redesignes til billeddannelse og terapeutiske anvendelser ved blot at inkludere det terapeutiske lægemiddel og billeddannelsen i en nanobærer.Dette har nyttige anvendelser i både behandling af kræft og smitsomme sygdomme. Det vil være Rasha Msallam, seniorforsker fra mit laboratorium. Til at begynde med, to timer før subkonjunktival injektion, injicere musen intravenøst via hale med 2,5 milligram pr kg Evans blå, eller EB. Efter at have bedøvet musen med 5% isoflurane, overfør musen til en næsekegle og opretholde bedøvet mus på en varmepude.Trim derefter whiskers nær øjet, der skal injiceres. Indgyde et fald på 0,5% proxymetacain hydrochloridopløsning direkte på øjet. Derefter skal du indlæse en 10-mikroliter glassprøjte udstyret med en 32-gauge nål med fluorescerende liposomer og sikre, at luftboblerne ikke er til stede i sprøjten.Ved hjælp af en pincet, løft bindehinden og langsomt injicere liposomer i subkonjunktival plads, derefter trække nålen langsomt, forhindrer tilbage flow. Sørg for dannelsen af bleb fyldt med fluorescerende liposomer. Administrere en 1% fusitisk syre dråbe på øjet og overvåge musen, indtil den genvinder bevidstheden.Tænd for CLM-systemet. Tilslut sonden til CLM-systemet. Vælg visningsfeltet og placeringen for anskaffelsesfilerne på dette tidspunkt.Juster laserintensiteten for at sikre, at fluorescensdetektering for fluorescein DHPE er i det lineære område, og hold intensiteten ensartet for sammenligning mellem billeder taget på forskellige tidspunkter. Når systemet er opvarmet i 15 minutter, kalibreres systemet i overensstemmelse med producentens anvisninger ved hjælp af kalibreringssættet, der indeholder udrensnings-, skylnings- og fluoro-4-opløsningerne for hver laser. Kort, start kalibrering ved at nedsænke spidsen i fem sekunder hver i rense hætteglasset, og derefter i skylleglasset.Lad spidsen stå i luften til baggrundsoptagelse for at normalisere baggrundsværdierne fra sonderne forskellige fibre, hvilket sikrer billedets ensartethed. Igen nedsænke spidsen i fem sekunder i renseglasset og derefter i skylleglasset. Derefter nedsænkes spidsen i hætteglaset, der indeholder fluor-4 488-nanometer i fem sekunder for at normalisere signalværdierne.Gentag spidsen nedsænkning i fem sekunder i renseglass efterfulgt af skylleglasset. Hold spidsen i skylleglasset, indtil fluorescenssignalet, der blev registreret i det foregående trin, forsvinder. Overfør derefter spidsen i hætteglaset, der indeholder fluor-4 660-nanometer for at normalisere signalværdier fra forskellige fibre i sonden.Efter kalibrering skal du sikre dig, at værdien er mindre end 100 for sondens baggrund. Ellers skal du udføre gentagen rengøring af sonden med en bomuldsspidsapplikator. Tænd for dyretemperaturregulatoren med en vedhæftet varmepude, og juster temperaturen til 37 grader Celsius.Efter at have dækket varmepuden med en kirurgisk drapering, fastgør næsekeglen på varmepuden. Efter at have bedøvet musen ved hjælp af 5% isoflurane i et induktionskammer, overfør musen til næsekeglen og opretholde den bedøvede mus på en varmepude. Derefter indgyde en dråbe bedøvelsesmiddel 0,5% proxymetacain hydrochloridopløsning på øjet.For at vaske den okulære overflade og undgå krystallisering af linsen, holde øjnene smurt ved at droppe et par saltvand dråber. Drej derefter og juster mikroskopets okular for at se museøjet ergonomisk i direkte fokus ved 0,67 gange forstørrelse. Tænd for laseren, og anbring sonden som en pen direkte på øjenområdet for at blive afbildet.Begynd derefter at registrere erhvervelse for at observere fluorescensen i øjet i det interesseområde. Stop optagelsen, når alle områder er markeret og mærket i henhold til øjekortet for at kende den nøjagtige sondeplacering ved den nøjagtige ramme. Anskaffelsesfilerne gemmes automatisk som videofiler på den tidligere valgte placering.Fluorescens imaging afslørede tydelig differentiering mellem sclera og hornhinden regioner. Høj vascularization af episclera og bindeled forårsaget sclera regionen til plet rød med EB. Hornhinden, som mangler vaskulatur, syntes sort. Kontrasten fluorescens af limbus og sclera blev observeret i syv-dages undersøgelse.Fluorescein farvestof-injicerede kontrol mus bekræftet specificiteten af liposom-afledt fluorescens. Fluorescensintensiteterne var høje på første og tredje dag. Grøn fluorescens proxied liposom reduktion i limbus og sclera regioner over tid.Forskellene i fluorescenssignalerne fra dag til dag tre efter injektionen i tidsmæssige limbus- og superior limbus-regioner var ikke signifikante, hvilket indikerer, at neutrale liposomer foretrækkes frem for limbusregionen, især hornhindeoverdelen. For de tidsmæssige og overlegne regioner på post-injektion dag ét, fluorescens i sclera var seks gange højere end i limbus. Ved den tredje og syvende dag blev liposomer reduceret betydeligt i sclera i de tidsmæssige og overlegne regioner, tilskrevet okulære clearance mekanismer.Den laveste mængde fluorescens blev påvist i de nasale og ringere områder på grund af afstanden fra injektionsstedet. Det er vigtigt at mærke fleck-rammerne i henhold til øjekortet, før optagelsen stoppes. Hold laserintensiteten konsistent, og definer den maksimale baggrundsværdi for korrekt sammenligning på tværs af forskellige eksperimenter.Efter identifikation af blyformuleringer kan der gennemføres omfattende farmakokinetiske og biodistributionsundersøgelser hos dyr for at studere lægemidlets biotilgængelighed og validere den terapeutiske effekt af deres formuleringer.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Spatio-tidsmæssige Manipulation af Lille GTPase aktivitet på Subcellulær niveau og på Tidsplan for Seconds i levende celler

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Selvrapportering Stilladser for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Modeller og metoder til evaluering Transport af Drug Delivery Systems over cellulære Barrierer

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

En Label-fri teknik til Spatio-temporale Imaging af encellede Sekret

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

Multimodal Imaging og spektroskopi Fiber-bundle Microendoscopy platform for ikke-invasiv,<em&gt; In vivo</em&gt; Analyse Tissue

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Fremstilling and Drug Delivery Anvendelser af Silk Nanopartikler

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

Omfattende evaluering af effektiviteten og sikkerheden af moderkagen-målrettet medicinafgivelse ved hjælp af tre komplementære metoder

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Forberedelse proteinproducerende syntetiske celler ved hjælp af cellefri bakterielle ekstrakter, liposomer og emulsionoverførsel

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...