Name: spatio-temporal in vivo imaging of ocular drug delivery systems using fiberoptic confocal laser microendoscopy
Uploaded: 2021-09-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy at JoVE.com

Dit onderzoek werd gefinancierd door NTU-Northwestern Institute for Nanomedicine (NNIN) subsidie toegekend (aan SV) en gedeeltelijk door Singapore National Research Foundation Grant AG / CIV / GC70-C / NRF / 2013/2 en Singapore's Health and Biomedical Sciences (HBMS) Industry Alignment Fund Pre-Positioning (IAF-PP) subsidie H18/01/a0/018 beheerd door het Agentschap voor Wetenschap, Technologie en Onderzoek (A * STAR) (aan AMC). Met dank aan leden van Duke-NUS Laboratory for Translational and Molecular Imaging (LTMI) voor het faciliteren van de logistiek en uitvoering van de studies en training op apparatuur. Speciale dank aan mevrouw Wisna Novera voor haar redactionele hulp.

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van SingHealth (Singapore). Vrouwelijke C57BL/6 J-muizen (6- 8 weken oud; 18-20 g) werden verkregen uit InVivos, Singapore, en gehuisvest in een temperatuur- en lichtgestuurd vivarium van Duke-NUS Medical School, Singapore. Dieren werden behandeld volgens de richtlijnen van de Verklaring van de Vereniging voor Onderzoek in Visie en Oogheelkunde (ARVO) voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en visieonderzoek.</...

<ol>
	<li>Chaw, S. Y., Novera, W., Chacko, A. -. M., Wong, T. T. L., Venkatraman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fate+of+liposomes+after+subconjunctival+ocular+delivery.">In vivo fate of liposomes after subconjunctival ocular delivery.</a> Journal of Controlled Release. 329, 162-174 (2021).</li><li>Kuo, J. C. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+colorectal+dysplasia+using+fluorescently+labelled+lectins.">Detection of colorectal dysplasia using fluorescently labelled lectins.</a> Scientific Reports. 6 (1), 24231 (2016).</li><li>Wu, Y. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+custom+multiphoton+microscopy+platform+for+live+imaging+of+mouse+cornea+and+conjunctiva.">A custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60944 (2020).</li><li>Zhivov, A., Stachs, O., Kraak, R., Stave, J., Guthoff, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+confocal+microscopy+of+the+ocular+surface.">In vivo confocal microscopy of the ocular surface.</a> The Ocular Surface. 4 (2), 81-93 (2006).</li><li>Bassyouni, F., ElHalwany, N., Ab del Rehim, M., Neyfeh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+new+technologies+applied+in+controlled+drug+delivery+system.">Advances and new technologies applied in controlled drug delivery system.</a> Research on Chemical Intermediates. 41 (4), 2165-2200 (2015).</li><li>Sercombe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+challenges+of+liposome+assisted+drug+delivery.">Advances and challenges of liposome assisted drug delivery.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, (2015).</li><li>Koning, G. A., Storm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+drug+delivery+systems+for+the+intracellular+delivery+of+macromolecular+drugs.">Targeted drug delivery systems for the intracellular delivery of macromolecular drugs.</a> Drug Discovery Today. 8 (11), 482-483 (2003).</li><li>Metselaar, J. M., Storm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+in+the+treatment+of+inflammatory+disorders.">Liposomes in the treatment of inflammatory disorders.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 2 (3), 465-476 (2005).</li><li>Ding, B. S., Dziubla, T., Shuvaev, V. V., Muro, S., Muzykantov, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+drug+delivery+systems+that+target+the+vascular+endothelium.">Advanced drug delivery systems that target the vascular endothelium.</a> Molecular Interventions. 6 (2), 98-112 (2006).</li><li>Hua, S., Wu, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+lipid-based+nanocarriers+for+targeted+pain+therapies.">The use of lipid-based nanocarriers for targeted pain therapies.</a> Frontiers in Pharmacology. 4, 143 (2013).</li><li>Sharma, A., Sharma, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+in+drug+delivery:+Progress+and+limitations.">Liposomes in drug delivery: Progress and limitations.</a> International Journal of Pharmaceutics. 154 (2), 123-140 (1997).</li><li>Abrishami, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+characterization,+and+in+vivo+evaluation+of+nanoliposomes-encapsulated+Bevacizumab+(Avastin)+for+intravitreal+administration.">Preparation, characterization, and in vivo evaluation of nanoliposomes-encapsulated Bevacizumab (Avastin) for intravitreal administration.</a> Retina. 29 (5), 699-703 (2009).</li><li>Pleyer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+absorption+of+cyclosporine+A+from+liposomes+incorporated+into+collagen+shields.">Ocular absorption of cyclosporine A from liposomes incorporated into collagen shields.</a> Current Eye Research. 13 (3), 177-181 (1994).</li><li>Shen, Y., Tu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+ocular+pharmacokinetics+of+ganciclovir+liposomes.">Preparation and ocular pharmacokinetics of ganciclovir liposomes.</a> The AAPS Journal. 9 (3), 371-377 (2007).</li><li>Weijtens, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concentration+of+dexamethasone+in+aqueous+and+vitreous+after+subconjunctival+injection.">High concentration of dexamethasone in aqueous and vitreous after subconjunctival injection.</a> American Journal of Ophthalmology. 128 (2), 192-197 (1999).</li><li>Voss, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+injectable+drug+delivery+system+for+subconjunctival+glaucoma+treatment.">Development of a novel injectable drug delivery system for subconjunctival glaucoma treatment.</a> Journal of Controlled Release. 214, 1-11 (2015).</li><li>Giarmoukakis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+nanoparticles+for+controlled+subconjunctival+delivery+of+latanoprost+acid:+In+vitro+and+in+vivo+evaluation.+Preliminary+results.">Biodegradable nanoparticles for controlled subconjunctival delivery of latanoprost acid: In vitro and in vivo evaluation. Preliminary results.</a> Experimental Eye Research. 112, 29-36 (2013).</li><li>Shah, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal+and+subconjunctival+melphalan+for+retinoblastoma+in+transgenic+mice.">Intravitreal and subconjunctival melphalan for retinoblastoma in transgenic mice.</a> Journal of Ophthalmology. 2014, 829879 (2014).</li><li>Dastjerdi, M. H., Sadrai, Z., Saban, D. R., Zhang, Q., Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+Penetration+of+Topical+and+Subconjunctival+Bevacizumab.">Corneal Penetration of Topical and Subconjunctival Bevacizumab.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 52 (12), 8718-8723 (2011).</li><li>Ezra-Elia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+an+in+vivo+imaging+system+be+used+to+determine+localization+and+biodistribution+of+AAV5-mediated+gene+expression+following+subretinal+and+intravitreal+delivery+in+mice.">Can an in vivo imaging system be used to determine localization and biodistribution of AAV5-mediated gene expression following subretinal and intravitreal delivery in mice.</a> Experimental Eye Research. 176, 227-234 (2018).</li><li>Movila, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+endoscopic+technology+for+real-time+monitoring+of+inflammation+caused+in+experimental+periodontitis.">Intravital endoscopic technology for real-time monitoring of inflammation caused in experimental periodontitis.</a> Journal of Immunological Methods. 457, 26-29 (2018).</li><li>Vanherp, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoscopic+fibered+confocal+fluorescence+microscopy+for+longitudinal+in+vivo+assessment+of+pulmonary+fungal+infections+in+free-breathing+mice.">Bronchoscopic fibered confocal fluorescence microscopy for longitudinal in vivo assessment of pulmonary fungal infections in free-breathing mice.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3009 (2018).</li><li>Chagnon, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+intravital+endoscopic+confocal+fluorescence+microscopy+of+normal+and+acutely+injured+rat+lungs.">In vivo intravital endoscopic confocal fluorescence microscopy of normal and acutely injured rat lungs.</a> Laboratory Investigation. 90 (6), 824-834 (2010).</li><li>Yun, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+near-infrared+fluorescence+conjugation+on+the+anti-cancer+potential+of+cetuximab.">The effect of near-infrared fluorescence conjugation on the anti-cancer potential of cetuximab.</a> Laboratory Animal Research. 34 (1), 30-36 (2018).</li></ol>

Zoals blijkt uit de resultaten, biedt CLM een eenvoudige en haalbare methode om de oculaire verdeling van liposomen in het oog in beeld te brengen. We hebben eerder het gebruik van CLM aangetoond om de lokalisatie van verschillende liposomale formuleringen in het muisoog in de loop van de tijd te karakteriseren1. Voor niet-invasieve toepassingen maakt CLM real-time beeldvorming van het voorste oculaire oppervlak mogelijk voor inzichten in hoe liposomen in het oog worden verdeeld van hetzelfde dier...

De bloedklaring, weefselverdeling en doelbezetting van geneesmiddelen in levende systemen zijn pijlers voor het begrijpen van in vivo medicijndispositie. In preklinische diermodellen worden deze parameters meestal beoordeeld door frequente bloed- en weefselbemonstering op bepaalde tijdstippen na toediening van het geneesmiddel. Deze procedures zijn echter over het algemeen invasief, omvatten vaak niet-overlevingsmetingen en vereisen grote diercohorten voor statistische macht. Er kunnen extra kosten en tijd worden gemaakt, samen met ethische zorgen voor overmatig gebruik van dieren. Als gevolg hiervan is niet-invasieve beeldvorming hard op weg een integrale stap te worden in biodistributiestudies. Confocale lasermicro-endoscopie (CLM1,2) is zeer geschikt voor oculaire toepassingen om de spatio-temporele verdeling van therapeutica in de ogen van levende dieren met een hoge gevoeligheid en hoge resolutie niet-invasief in beeld te brengen1,3,4.
CLM heeft het potentieel om robuuste screening van oculaire medicijnafgiftesystemen (DDS), zoals liposomen, te vergemakkelijken voorafgaand aan uitgebreide kwantificering van de DDS en de biologische beschikbaarheid van geneesmiddelen. Liposomen zijn aantrekkelijk vanwege hun flexibiliteit bij het afstemmen van hun fysisch-chemische en biofysische eigenschappen5,6,7,8,9,10,11 om een grote verscheidenheid aan therapeutische lading in te kapselen en de weefselplaats van medicijnafgifte en werkingsduur te beheersen. Liposomen zijn gebruikt in oculaire toepassingen voor de afgifte van grote moleculen, zoals het monoklonale antilichaam bevacizumab12, en kleine moleculen zoals ciclosporine13 en ganciclovir14. Geneesmiddel-geladen liposomen hebben langere biologische halfwaardetijden en langdurige therapeutische effecten in vergelijking met niet-liposomale "vrije drug" formuleringen. De distributie van geneesmiddelen in oogweefsel wordt echter meestal geëxtrapoleerd uit geneesmiddelconcentraties in vloeibare componenten van het oog (d.w.z. bloed, waterige humor en glasvochthumor15,16,17). Aangezien het initiële in vivo lot van de geladen medicijnlading wordt bepaald door de eigenschappen van de nanodrager zelf, kan CLM-beeldvorming van de fluorescerende liposomen dienen als een surrogaat voor het medicijn om weefseltargeting en in situ weefselresidentietijden te onthullen. Bovendien kan visueel bewijs van toediening met CLM het herontwerp van DDS sturen, de therapeutische voordelen van het medicijn evalueren en misschien zelfs nadelige biologische gebeurtenissen voorspellen (bijv. Weefseltoxiciteit als gevolg van ongewenste lokalisatie van DDS gedurende langere tijd).
Hierin wordt een stapsgewijze procedure beschreven over het bestuderen van de oculaire biodistributie van liposomen in levende muizen met een dual-band CLM-systeem. Dit specifieke CLM-systeem kan tweekleurenfluorescentie (met groene en rode excitatielasers bij 488 nm en 660 nm) in realtime detecteren, met een frequentie van 8 frames / s. Door de detectiesonde fysiek op het oog te plaatsen, demonstreert het protocol beeldacquisitie en analyse van groen-fluorescerende liposomen bij subconjunctivale toediening bij muizen die intraveneus (IV) worden geïnjecteerd met 2% Evans Blue (EB) kleurstof. EB-kleurstof helpt bij het visualiseren van de gevasculariseerde structuren in het rode fluorescentiekanaal. We tonen representatieve resultaten van een studie ter beoordeling van 100 nm neutrale liposomen bestaande uit het fosfolipide POPC (d.w.z. 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfocholine) en gedopeerd met fluoresceïne-gelabeld fosfolipide Fl-DHPE (d.w.z. N-(fluoresceïne-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexa-decanoylsn-glycero-3-fosfoethanolamine) in een verhouding van 95% POPC: 5% Fl-DHPE (figuur 1B ). CLM is in staat om de groene fluoresceïne-gelabelde liposomen te vangen bij 15 μm axiale en 3,30 μm laterale resolutie door afbakening van EB-gekleurde oculaire weefselgrenzen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.08 &#181;m polycarbonate filter</td>
			<td>Whatman, USA</td>
			<td>110604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Fisherbrand, Ireland</td>
			<td>09-720-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution</td>
			<td>Alcon, Singapore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Glass Syringe</td>
			<td>Hamilton, USA</td>
			<td>65460-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti, USA</td>
			<td>850457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 G needle (Hamilton, 0.5&#8221; PT4)</td>
			<td>Hamilton, USA</td>
			<td>7803-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm)</td>
			<td>WPI, USA</td>
			<td>ATC 2000 &#38; 61800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5)</td>
			<td>Mauna Kea Technologies, France</td>
			<td></td>
			<td>Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 &#181;m x 500 &#181;m, axial resolution: 15 &#181;m, lateral resolution: 3.3 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>472476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers #5, Dumostar</td>
			<td>WPI, USA</td>
			<td>500233</td>
			<td>11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans Blue</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>E2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fusidic acid eye drop</td>
			<td>LEO Pharma, Denmark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Malvern Panalytical, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>179337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Extruder</td>
			<td>Avanti, USA</td>
			<td>610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE)</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>F362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope System with table clamp stand</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td>SZ51 &#38; SZ2-STU3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatio-temporal in vivo imaging of ocular drug delivery systems using fiberoptic confocal laser microendoscopy

Subconjunctivale injectie is een aantrekkelijke route om oculaire geneesmiddelen toe te dienen vanwege de gemakkelijke transsclerale toegang die anterieure oculaire barrières omzeilt, zoals het hoornvlies en het bindvlies. Hoewel therapeutische effecten en farmacokinetiek van de geneesmiddelen bij subconjunctivale injectie in sommige studies zijn beschreven, beoordelen zeer weinigen de oculaire distributie van geneesmiddelen of medicijnafgiftesystemen (DDS). Dit laatste is van cruciaal belang voor de optimalisatie van het intraoculaire DDS-ontwerp en de biologische beschikbaarheid van geneesmiddelen om de gewenste oculaire lokalisatie en werkingsduur te bereiken (bijv. Acuut versus langdurig). Deze studie stelt het gebruik van fiberoptische confocale lasermicro-endoscopie (CLM) vast om de oculaire verdeling van fluorescerende liposomen in realtime in levende muizen na sub-conjunctivale injectie kwalitatief te bestuderen. Omdat dit is ontworpen voor in vivo visuele inspectie van weefsels op microscopisch niveau, is dit ook de eerste volledige beschrijving van de CLM-beeldvormingsmethode om de spatio-temporele verdeling van injectables in het oog na subconjunctivale injectie te bestuderen.

Het protocol toont het nut van CLM aan om de spatio-temporele oculaire verdeling van groene fluorescerende liposomen toegediend via subconjunctivale injectie te beoordelen. Om gebruik te maken van de dual-color capaciteit (488 nm en 660 nm excitatie golflengten) van het CLM-systeem, werden 100 nm neutrale POPC liposomen die moesten worden geïnjecteerd gedopeerd met 5% Fl-DHPE (samenstellings- en karakteriseringsgegevens zijn weergegeven in figuur 1B), en EB werd IV geïnjecteerd om oriënta...

Watch this Scientific Journal Video about Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy at JoVE.com

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

We presenteren een protocol voor het gebruik van fiberoptische confocale lasermicro-endoscopie (CLM) om de spatio-temporele verdeling van liposomen in het oog na subconjunctivale injectie niet-invasief te bestuderen.

Spatio-temporale in vivo beeldvorming van oculaire medicijnafgiftesystemen met behulp van fiberoptische confocale lasermicro-endoscopie

Subconjunctival injection is an attractive route to administer ocular drugs due to easy trans-scleral access that bypasses anterior ocular barriers, such ...

Dit protocol vergemakkelijkt het screenen van nieuwe formuleringen om beter te begrijpen hoe modificaties hun weefselresidentietijden beïnvloeden, wat van cruciaal belang is bij het ontwerpen van een optimaal medicijnafgiftesysteem. Deze techniek is niet-invasief en maakt realtime beeldvorming mogelijk, waardoor het overmatige gebruik van dieren voor bemonstering wordt verminderd. Medicijnafgiftesystemen kunnen opnieuw worden ontworpen voor beeldvorming en therapeutische toepassingen door eenvoudigweg het therapeutische medicijn en het beeldvormingsgedeelte in één nanodrager op te nemen.Dit heeft nuttige toepassingen bij zowel de behandeling van kanker als infectieziekten. Rasha Msallam, een senior research fellow uit mijn laboratorium, demonstreert de procedure. Om te beginnen, twee uur voor subconjunctivale injectie, injecteer de muis intraveneus via de staart met 2,5 milligram per kilogram Evans blue, of EB. Na het verdoven van de muis met 5% isofluraan, brengt u de muis over naar een neuskegel en houdt u de verdoofde muis op een verwarmingskussen.Snijd vervolgens de snorharen in de buurt van het oog dat moet worden geïnjecteerd. Breng een druppel van 0,5% proxymetacaine hydrochloride-oplossing direct op het oog aan. Laad vervolgens een glazen spuit van 10 microliter uitgerust met een 32-gauge naald met fluorescerende liposomen en zorg ervoor dat de luchtbellen niet in de spuit aanwezig zijn.Til met een pincet het bindvlies op en injecteer langzaam liposomen in de subconjunctivale ruimte en trek de naald vervolgens langzaam terug, waardoor terugstroming wordt voorkomen. Zorg voor de vorming van bleb gevuld met fluorescerende liposomen. Dien een 1% fusitische zuurdruppel op het oog toe en controleer de muis totdat deze weer bij bewustzijn komt.Schakel het CLM-systeem in. Sluit de sonde aan op het CLM-systeem. Kies op dit punt het gezichtsveld en de locatie voor de acquisitiebestanden.Pas de laserintensiteit aan om ervoor te zorgen dat de fluorescentiedetectie voor fluoresceïne DHPE zich in het lineaire bereik bevindt en houd de intensiteit consistent voor vergelijking tussen afbeeldingen die op verschillende tijdstippen zijn gemaakt. Nadat het systeem gedurende 15 minuten is opgewarmd, kalibreert u het systeem volgens de instructies van de fabrikant met behulp van de kalibratiekit met de reinigings-, spoel- en fluoro-4-oplossingen voor elke laser. Begin kort met kalibreren door de punt gedurende vijf seconden onder te dompelen in de reinigingsflacon en vervolgens in de spoelflacon.Laat de punt in de lucht voor achtergrondopname om de achtergrondwaarden van de verschillende vezels van de sondes te normaliseren, waardoor de uniformiteit van het beeld wordt gegarandeerd. Dompel de punt nogmaals gedurende vijf seconden onder in de reinigingsflacon en vervolgens in de spoelflacon. Dompel vervolgens de tip gedurende vijf seconden onder in de injectieflacon met fluor-4 488-nanometer om de signaalwaarden te normaliseren.Herhaal de tip onderdompeling gedurende vijf seconden in de reinigingsflacon, gevolgd door de spoelflacon. Houd de punt in de spoelflacon totdat het fluorescentiesignaal dat in de vorige stap is geregistreerd, verdwijnt. Breng vervolgens de tip over in de injectieflacon met fluoro-4 660-nanometer om de signaalwaarden van verschillende vezels in de sonde te normaliseren.Controleer na kalibratie of de waarde minder dan 100 is voor de achtergrond van de sonde. Voer anders herhaalde reiniging van de sonde uit met een wattenstaafje applicator. Schakel de diertemperatuurregelaar in met een aangesloten verwarmingskussen en stel de temperatuur in op 37 graden Celsius.Nadat u het verwarmingskussen hebt bedekt met een chirurgisch gordijn, bevestigt u de neuskegel op het verwarmingskussen. Na het verdoven van de muis met behulp van 5% isofluraan in een inductiekamer, brengt u de muis over naar de neuskegel en houdt u de verdoofde muis op een verwarmingskussen. Breng vervolgens een druppel verdovingsmiddel 0,5% proxymetacainehydrochloride-oplossing op het oog aan.Om het oogoppervlak te wassen en de kristallisatie van de lens te voorkomen, houdt u de ogen gesmeerd door een paar zoute druppels te laten vallen. Draai en pas vervolgens het oculair van de microscoop aan om het muisoog ergonomisch in de directe focus te bekijken met een vergroting van 0,67 keer. Schakel de laser in en plaats de sonde als een pen direct op het ooggebied dat in beeld moet worden gebracht.Begin vervolgens met het registreren van acquisitie om de fluorescentie in het oog in het betreffende gebied te observeren. Stop de opname wanneer alle regio's zijn gemarkeerd en gelabeld volgens de oogkaart om de exacte sondelocatie op het exacte frame te kennen. De acquisitiebestanden worden automatisch opgeslagen als videobestanden op de eerder gekozen locatie.De fluorescentiebeeldvorming onthulde een duidelijk onderscheid tussen de sclera- en hoornvliesgebieden. Hoge vascularisatie van de episclera en conjunctiva zorgde ervoor dat het sclera-gebied rood kleurde met EB. Het hoornvlies, dat geen vasculatuur heeft, leek zwart. De contrastfluorescentie van limbus en sclera werd waargenomen in zeven dagen durende studie.Met fluoresceïnekleurstof geïnjecteerde controlemuizen bevestigden de specificiteit van liposoom-afgeleide fluorescentie. De fluorescentie-intensiteiten waren hoog op de eerste en derde dag. Groene fluorescentie proxied de liposoom vermindering in de limbus en sclera regio's in de loop van de tijd.De verschillen in de fluorescentiesignalen van dag één na injectie tot dag drie in temporale limbus- en superieure limbusregio's waren niet significant, wat wijst op de voorkeur van neutrale liposomen voor het limbusgebied, met name de cornea-periferie. Voor de temporale en superieure regio's op de eerste dag na injectie was de fluorescentie in de sclera zes keer hoger dan in de limbus. Tegen de derde en zevende dag waren liposomen significant verminderd in de sclera in de temporale en superieure regio's, toegeschreven aan oculaire klaringsmechanismen.De laagste hoeveelheid fluorescentie werd gedetecteerd in de nasale en inferieure regio's, vanwege de afstand tot de injectieplaats. Het is belangrijk om de vlekframes te labelen volgens de oogkaart voordat de opname wordt gestopt. Houd de laserintensiteit consistent en definieer de maximale achtergrondwaarde voor een goede vergelijking tussen verschillende experimenten.Na de identificatie van loodformuleringen kunnen uitgebreide farmacokinetische en biodistributiestudies bij dieren worden uitgevoerd om de biologische beschikbaarheid van het geneesmiddel te bestuderen en de therapeutische werkzaamheid van hun formuleringen te valideren.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Hoge-resolutie Fiber-optic Microendoscopy voor In situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Video-rate Scanning confocale microscopie en Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Spatio-temporele Manipulatie van kleine GTPase activiteit bij subcellulaire niveau en op de tijdschaal van seconden in levende cellen

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Zelfrapportage Stellingen voor 3-dimensionale Cultuur van de Cel

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Modellen en methoden om vervoer van Drug Delivery Systems Across Cellular Barrières Evalueer

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

A-Label gratis Techniek voor de ruimte en tijd Imaging van Single Cell afscheiding

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

Multimodale beeldvorming en spectroscopie Fiber-bundel microendoscopy Platform voor niet-invasieve,<em&gt; In Vivo</em&gt; Tissue Analyse

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Fabricage en Drug Delivery Toepassingen van Silk Nanodeeltjes

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

Uitgebreide evaluatie van de effectiviteit en veiligheid van Placenta-gerichte Drug Delivery met behulp van drie aanvullende methoden

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Voorbereiding van eiwit producerende synthetische cellen met behulp van cell free bacteriële extracten, liposomen en emulsie transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...