Name: spatio-temporal in vivo imaging of ocular drug delivery systems using fiberoptic confocal laser microendoscopy
Uploaded: 2021-09-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy at JoVE.com

Cette recherche a été financée par la subvention NTU-Northwestern Institute for Nanomedicine (NNIN) accordée (à SV) et en partie par la subvention AG/CIV/GC70-C/NRF/2013/2 et la subvention H18/01/01/01/01/01/018 de l’Agence pour la science, la technologie et la recherche (A*STAR) de Singapour (A*STAR) (à AMC). Merci aux membres du Duke-NUS Laboratory for Translational and Molecular Imaging (LTMI) d’avoir facilité la logistique et l’exécution des études et de la formation sur les équipements. Un merci spécial à Mme Wisna Novera pour son aide éditoriale.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de SingHealth (Singapour). Des souris femelles C57BL/6 J (âgées de 6 à 8 semaines; 18 à 20 g) ont été obtenues à InVivos, à Singapour, et logées dans un vivarium à température et à lumière contrôlées de la Duke-NUS Medical School, à Singapour. Les animaux ont été traités conformément aux lignes directrices de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) pour l’utili...

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	<li>Chaw, S. Y., Novera, W., Chacko, A. -. M., Wong, T. T. L., Venkatraman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fate+of+liposomes+after+subconjunctival+ocular+delivery.">In vivo fate of liposomes after subconjunctival ocular delivery.</a> Journal of Controlled Release. 329, 162-174 (2021).</li><li>Kuo, J. C. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+colorectal+dysplasia+using+fluorescently+labelled+lectins.">Detection of colorectal dysplasia using fluorescently labelled lectins.</a> Scientific Reports. 6 (1), 24231 (2016).</li><li>Wu, Y. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+custom+multiphoton+microscopy+platform+for+live+imaging+of+mouse+cornea+and+conjunctiva.">A custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60944 (2020).</li><li>Zhivov, A., Stachs, O., Kraak, R., Stave, J., Guthoff, R. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+in+drug+delivery:+Progress+and+limitations.">Liposomes in drug delivery: Progress and limitations.</a> International Journal of Pharmaceutics. 154 (2), 123-140 (1997).</li><li>Abrishami, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+characterization,+and+in+vivo+evaluation+of+nanoliposomes-encapsulated+Bevacizumab+(Avastin)+for+intravitreal+administration.">Preparation, characterization, and in vivo evaluation of nanoliposomes-encapsulated Bevacizumab (Avastin) for intravitreal administration.</a> Retina. 29 (5), 699-703 (2009).</li><li>Pleyer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+absorption+of+cyclosporine+A+from+liposomes+incorporated+into+collagen+shields.">Ocular absorption of cyclosporine A from liposomes incorporated into collagen shields.</a> Current Eye Research. 13 (3), 177-181 (1994).</li><li>Shen, Y., Tu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+ocular+pharmacokinetics+of+ganciclovir+liposomes.">Preparation and ocular pharmacokinetics of ganciclovir liposomes.</a> The AAPS Journal. 9 (3), 371-377 (2007).</li><li>Weijtens, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concentration+of+dexamethasone+in+aqueous+and+vitreous+after+subconjunctival+injection.">High concentration of dexamethasone in aqueous and vitreous after subconjunctival injection.</a> American Journal of Ophthalmology. 128 (2), 192-197 (1999).</li><li>Voss, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+injectable+drug+delivery+system+for+subconjunctival+glaucoma+treatment.">Development of a novel injectable drug delivery system for subconjunctival glaucoma treatment.</a> Journal of Controlled Release. 214, 1-11 (2015).</li><li>Giarmoukakis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+nanoparticles+for+controlled+subconjunctival+delivery+of+latanoprost+acid:+In+vitro+and+in+vivo+evaluation.+Preliminary+results.">Biodegradable nanoparticles for controlled subconjunctival delivery of latanoprost acid: In vitro and in vivo evaluation. Preliminary results.</a> Experimental Eye Research. 112, 29-36 (2013).</li><li>Shah, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal+and+subconjunctival+melphalan+for+retinoblastoma+in+transgenic+mice.">Intravitreal and subconjunctival melphalan for retinoblastoma in transgenic mice.</a> Journal of Ophthalmology. 2014, 829879 (2014).</li><li>Dastjerdi, M. H., Sadrai, Z., Saban, D. R., Zhang, Q., Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+Penetration+of+Topical+and+Subconjunctival+Bevacizumab.">Corneal Penetration of Topical and Subconjunctival Bevacizumab.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 52 (12), 8718-8723 (2011).</li><li>Ezra-Elia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+an+in+vivo+imaging+system+be+used+to+determine+localization+and+biodistribution+of+AAV5-mediated+gene+expression+following+subretinal+and+intravitreal+delivery+in+mice.">Can an in vivo imaging system be used to determine localization and biodistribution of AAV5-mediated gene expression following subretinal and intravitreal delivery in mice.</a> Experimental Eye Research. 176, 227-234 (2018).</li><li>Movila, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+endoscopic+technology+for+real-time+monitoring+of+inflammation+caused+in+experimental+periodontitis.">Intravital endoscopic technology for real-time monitoring of inflammation caused in experimental periodontitis.</a> Journal of Immunological Methods. 457, 26-29 (2018).</li><li>Vanherp, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoscopic+fibered+confocal+fluorescence+microscopy+for+longitudinal+in+vivo+assessment+of+pulmonary+fungal+infections+in+free-breathing+mice.">Bronchoscopic fibered confocal fluorescence microscopy for longitudinal in vivo assessment of pulmonary fungal infections in free-breathing mice.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3009 (2018).</li><li>Chagnon, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+intravital+endoscopic+confocal+fluorescence+microscopy+of+normal+and+acutely+injured+rat+lungs.">In vivo intravital endoscopic confocal fluorescence microscopy of normal and acutely injured rat lungs.</a> Laboratory Investigation. 90 (6), 824-834 (2010).</li><li>Yun, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+near-infrared+fluorescence+conjugation+on+the+anti-cancer+potential+of+cetuximab.">The effect of near-infrared fluorescence conjugation on the anti-cancer potential of cetuximab.</a> Laboratory Animal Research. 34 (1), 30-36 (2018).</li></ol>

Comme le montrent les résultats, CLM fournit une méthode simple et réalisable pour imager la distribution oculaire des liposomes dans l’œil. Nous avons déjà démontré l’utilisation du CLM pour caractériser la localisation de diverses formulations liposomales dans l’œil de la souris au fil du temps1. Pour les applications non invasives, le CLM permet une imagerie en temps réel de la surface oculaire antérieure pour mieux comprendre comment les liposomes sont distribués dans l’œ...

La clairance sanguine, la distribution tissulaire et l’occupation cible des médicaments dans les systèmes vivants sont des piliers pour comprendre la disposition in vivo des médicaments. Dans les modèles animaux précliniques, ces paramètres sont généralement évalués par des prélèvements sanguins et tissulaires fréquents à des moments particuliers après l’administration du médicament. Cependant, ces procédures sont généralement invasives, incluent souvent des mesures de non-survie et nécessitent de grandes cohortes d’animaux pour l’alimentation statistique. Il peut y avoir des coûts et du temps supplémentaires, ainsi que des préoccupations éthiques pour l’utilisation excessive d’animaux. En conséquence, l’imagerie non invasive devient rapidement une étape essentielle dans les études sur les biodistributions. La microendoscopie laser confocale (CLM1,2) est bien adaptée aux applications oculaires pour imager de manière non invasive la distribution spatio-temporelle des produits thérapeutiques dans les yeux d’animaux vivants avec une sensibilité et une résolution élevées1,3,4.
Le CLM a le potentiel de faciliter le dépistage robuste des systèmes d’administration de médicaments oculaires (DDS), tels que les liposomes, avant la quantification complète du DDS et la biodisponibilité des médicaments. Les liposomes sont attrayants pour leur flexibilité dans le réglage de leurs propriétés physico-chimiques et biophysiques5,6,7,8,9,10,11 pour encapsuler une grande variété de cargaisons thérapeutiques et contrôler le site tissulaire de libération du médicament et la durée d’action. Les liposomes ont été utilisés dans des applications oculaires pour l’administration de grosses molécules, telles que l’anticorps monoclonal bevacizumab12, et de petites molécules comme la cyclosporine13 et le ganciclovir14. Les liposomes chargés de médicaments ont des demi-vies biologiques plus longues et des effets thérapeutiques prolongés par rapport aux formulations non liposomiques de « médicaments libres ». Cependant, la distribution des médicaments dans le tissu oculaire est généralement extrapolée à partir des concentrations de médicaments dans les composants fluides de l’œil (c.-à-d. le sang, l’humeur aqueuse et l’humeur vitrée15,16,17). Comme le devenir initial in vivo de la cargaison de médicament chargée est défini par les propriétés du nanotransporteur lui-même, l’imagerie CLM des liposomes fluorescents peut servir de substitut au médicament pour révéler le ciblage tissulaire et les temps de résidence tissulaire in situ. En outre, les preuves visuelles de l’administration avec CLM peuvent orienter la refonte du DDS, évaluer les avantages thérapeutiques du médicament et peut-être même prédire les événements biologiques indésirables (par exemple, la toxicité tissulaire due à la localisation indésirable du DDS pendant de longues périodes).
Ici, une procédure étape par étape est détaillée sur la façon d’étudier la biodistribution oculaire des liposomes chez les souris vivantes avec un système CLM à double bande. Ce système CLM spécifique peut détecter la fluorescence bicolore (avec des lasers d’excitation vert et rouge à 488 nm et 660 nm) en temps réel, avec une fréquence de 8 images / s. En plaçant physiquement la sonde de détection sur l’œil, le protocole démontre l’acquisition d’images et l’analyse de liposomes fluorescents verts lors de l’administration sous-conjonctivale chez des souris pré-injectées par voie intraveineuse (IV) avec un colorant Evans Blue (EB) à 2%. Le colorant EB aide à visualiser les structures vascularisées dans le canal de fluorescence rouge. Nous montrons les résultats représentatifs d’une étude évaluant des liposomes neutres de 100 nm composés du phospholipide POPC (c.-à-d. 1-palmitoyl-2-oléoyl-glycero-3-phosphocholine) et dopés avec du phospholipide Fl-DHPE marqué à la fluorescéine (c.-à-d. N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexa-decanoylsn-glycero-3-phosphoéthanolamine) à un rapport de 95 % POPC : 5 % Fl-DHPE (Figure 1B ). Le CLM est capable de capturer les liposomes verts marqués à la fluorescéine à une résolution axiale de 15 μm et latérale de 3,30 μm par délimitation des limites des tissus oculaires colorés par EB.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.08 &#181;m polycarbonate filter</td>
			<td>Whatman, USA</td>
			<td>110604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Fisherbrand, Ireland</td>
			<td>09-720-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution</td>
			<td>Alcon, Singapore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Glass Syringe</td>
			<td>Hamilton, USA</td>
			<td>65460-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti, USA</td>
			<td>850457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 G needle (Hamilton, 0.5&#8221; PT4)</td>
			<td>Hamilton, USA</td>
			<td>7803-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm)</td>
			<td>WPI, USA</td>
			<td>ATC 2000 &#38; 61800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5)</td>
			<td>Mauna Kea Technologies, France</td>
			<td></td>
			<td>Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 &#181;m x 500 &#181;m, axial resolution: 15 &#181;m, lateral resolution: 3.3 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>472476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers #5, Dumostar</td>
			<td>WPI, USA</td>
			<td>500233</td>
			<td>11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans Blue</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>E2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fusidic acid eye drop</td>
			<td>LEO Pharma, Denmark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Malvern Panalytical, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>179337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Extruder</td>
			<td>Avanti, USA</td>
			<td>610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE)</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>F362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope System with table clamp stand</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td>SZ51 &#38; SZ2-STU3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatio-temporal in vivo imaging of ocular drug delivery systems using fiberoptic confocal laser microendoscopy

L’injection sous-conjonctivale est une voie attrayante pour administrer des médicaments oculaires en raison de l’accès transscléral facile qui contourne les barrières oculaires antérieures, telles que la cornée et la conjonctive. Bien que les effets thérapeutiques et la pharmacocinétique des médicaments lors de l’injection sous-conjonctivale aient été décrits dans certaines études, très peu évaluent la distribution oculaire des médicaments ou des systèmes d’administration de médicaments (DDS). Ce dernier est essentiel pour l’optimisation de la conception du DDS intraoculaire et de la biodisponibilité du médicament afin d’obtenir la localisation oculaire souhaitée et la durée d’action (par exemple, aiguë ou prolongée). Cette étude établit l’utilisation de la microendoscopie laser confocale à fibre optique (CLM) pour étudier qualitativement la distribution oculaire des liposomes fluorescents en temps réel chez des souris vivantes après injection sous-conjonctivale. Conçu pour l’inspection visuelle in vivo des tissus au niveau microscopique, il s’agit également de la première description complète de la méthode d’imagerie CLM pour étudier la distribution spatio-temporelle des injectables dans l’œil après injection sous-conjonctivale.

Le protocole démontre l’utilité de la CLM pour évaluer la distribution oculaire spatio-temporale des liposomes fluorescents verts administrés par injection sous-conjonctivale. Pour tirer parti de la capacité bicolore (longueurs d’onde d’excitation de 488 nm et 660 nm) du système CLM, des liposomes POPC neutres de 100 nm à injecter ont été dopés avec 5% de Fl-DHPE (les données de composition et de caractérisation sont montrées à la figure 1B), et EB a été injecté IV pou...

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Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

Nous présentons un protocole pour l’utilisation de la microendoscopie laser confocale à fibre optique (CLM) pour étudier de manière non invasive la distribution spatio-temporelle des liposomes dans l’œil après injection sous-conjonctivale.

Imagerie spatio-temporelle in vivo de systèmes d’administration de médicaments oculaires à l’aide d’une microendoscopie laser confocale à fibre optique

Subconjunctival injection is an attractive route to administer ocular drugs due to easy trans-scleral access that bypasses anterior ocular barriers, such ...

Ce protocole facilite le dépistage de nouvelles formulations afin de mieux comprendre comment les modifications affectent leurs temps de résidence tissulaire, ce qui est essentiel dans la conception d’un système d’administration de médicaments optimal. Cette technique est non invasive et permet l’imagerie en temps réel, ce qui réduit l’utilisation excessive d’animaux pour l’échantillonnage. Les systèmes d’administration de médicaments peuvent être repensés pour l’imagerie et les applications thérapeutiques en incluant simplement le médicament thérapeutique et la fraction d’imagerie dans un nano-porteur.Cela a des applications utiles dans le traitement du cancer et des maladies infectieuses. Rasha Msallam, chercheuse principale de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer, deux heures avant l’injection sous-conjonctivale, injecter à la souris par voie intraveineuse via la queue 2,5 milligrammes par kilogramme de bleu Evans, ou EB. Après avoir sédatif la souris avec 5% d’isoflurane, transférez la souris dans un cône de nez et maintenez la souris sous sédation sur un coussin chauffant.Ensuite, coupez les moustaches près de l’œil à injecter. Instiller une goutte de solution de chlorhydrate de métamétacine à 0,5% directement sur l’œil. Ensuite, chargez une seringue en verre de 10 microlitres équipée d’une aiguille de calibre 32 avec des liposomes fluorescents et assurez-vous que les bulles d’air ne sont pas présentes dans la seringue.À l’aide d’une pince, soulevez la conjonctive et injectez lentement des liposomes dans l’espace sous-conjonctival, puis retirez l’aiguille lentement, empêchant ainsi le reflux. Assurer la formation de bleb rempli de liposomes fluorescents. Administrer une goutte d’acide fustique de 1% sur l’œil et surveiller la souris jusqu’à ce qu’elle reprenne conscience.Allumez le système CLM. Connectez la sonde au système CLM. Choisissez le champ de vision et l’emplacement des fichiers d’acquisition à ce stade.Ajustez l’intensité du laser pour vous assurer que la détection de fluorescence de la fluorescéine DHPE est dans la plage linéaire et gardez l’intensité cohérente pour la comparaison entre les images prises à différents moments. Une fois le système réchauffé pendant 15 minutes, étalonnez le système conformément aux instructions du fabricant à l’aide du kit d’étalonnage contenant les solutions de nettoyage, de rinçage et de fluoro-4 pour chaque laser. En bref, commencez à calibrer en immergeant la pointe pendant cinq secondes chacune dans le flacon nettoyant, puis dans le flacon de rinçage.Laissez la pointe en l’air pour l’enregistrement en arrière-plan afin de normaliser les valeurs d’arrière-plan des différentes fibres des sondes, assurant ainsi l’uniformité de l’image. Encore une fois, immergez la pointe pendant cinq secondes dans le flacon nettoyant, puis dans le flacon de rinçage. Ensuite, immergez la pointe dans le flacon contenant du fluoro-4 488 nanomètres pendant cinq secondes pour normaliser les valeurs du signal.Répétez l’immersion de la pointe pendant cinq secondes dans le flacon nettoyant suivi du flacon de rinçage. Gardez la pointe dans le flacon de rinçage jusqu’à ce que le signal de fluorescence enregistré à l’étape précédente disparaisse. Ensuite, transférez la pointe dans le flacon contenant du fluoro-4 660 nanomètres pour normaliser les valeurs de signal de différentes fibres de la sonde.Après l’étalonnage, assurez-vous que la valeur est inférieure à 100 pour l’arrière-plan de la sonde. Sinon, effectuez un nettoyage répété de la sonde avec un applicateur à pointe en coton. Allumez le régulateur de température animal avec un coussin chauffant attaché et ajustez la température à 37 degrés Celsius.Après avoir recouvert le coussin chauffant d’un drap chirurgical, fixez le cône de nez sur le coussin chauffant. Après avoir sédatif la souris à l’aide de 5% d’isoflurane dans une chambre d’induction, transférez la souris au cône de nez et maintenez la souris sous sédation sur un coussin chauffant. Ensuite, instillez une goutte de solution anesthésique de 0,5% de chlorhydrate de métamétacine sur l’œil.Pour laver la surface oculaire et éviter la cristallisation de la lentille, gardez les yeux lubrifiés en laissant tomber quelques gouttes salines. Ensuite, faites pivoter et ajustez l’oculaire du microscope pour voir l’œil de la souris de manière ergonomique dans la mise au point directe à un grossissement de 0,67 fois. Allumez le laser et placez la sonde comme un stylo directement sur la région de l’œil à imager.Ensuite, commencez à enregistrer l’acquisition pour observer la fluorescence dans l’œil à la région d’intérêt. Arrêtez l’enregistrement lorsque toutes les régions sont signalées et étiquetées en fonction de la carte des yeux pour connaître l’emplacement exact de la sonde dans le cadre exact. Les fichiers d’acquisition seront enregistrés automatiquement en tant que fichiers vidéo à l’emplacement précédemment choisi.L’imagerie par fluorescence a révélé une différenciation distincte entre les régions de la sclérotique et de la cornée. Une vascularisation élevée de l’épisclére et de la conjonctive a provoqué une coloration rouge de la région de la sclérotique avec EB. La cornée, qui manque de vascularisation, semblait noire. La fluorescence de contraste des limbes et de la sclérotique a été observée dans une étude de sept jours.Des souris témoins injectées de colorant de fluorescéine ont confirmé la spécificité de la fluorescence dérivée des liposomes. Les intensités de fluorescence étaient élevées les premier et troisième jours. La fluorescence verte proxiquait la réduction des liposomes dans les régions des limbes et des sclérotiques au fil du temps.Les différences dans les signaux de fluorescence du premier jour post-injection au troisième jour au niveau des limbes temporaux et des limbes supérieurs n’étaient pas significatives, ce qui indique une préférence des liposomes neutres pour la région des limbes, en particulier la périphérie cornéenne. Pour les régions temporales et supérieures le premier jour post-injection, la fluorescence dans la sclérotique était six fois plus élevée que dans les limbes. Aux troisième et septième jours, les liposomes ont été significativement réduits dans la sclérotique dans les régions temporale et supérieure, attribués aux mécanismes de clairance oculaire.La plus faible quantité de fluorescence a été détectée dans les régions nasales et inférieures, en raison de la distance par rapport au site d’injection. Il est important d’étiqueter les images de mouchetures en fonction de la carte des yeux avant l’arrêt de l’enregistrement. Gardez l’intensité laser cohérente et définissez la valeur de fond maximale pour une comparaison correcte entre différentes expériences.Après l’identification des formulations principales, des études pharmacocinétiques et de biodistribution complètes chez l’animal peuvent être menées pour étudier la biodisponibilité du médicament et valider l’efficacité thérapeutique de leurs formulations.

Research

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