Name: spatio-temporal in vivo imaging of ocular drug delivery systems using fiberoptic confocal laser microendoscopy
Uploaded: 2021-09-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy at JoVE.com

Diese Forschung wurde durch den Zuschuss des NTU-Northwestern Institute for Nanomedicine (NNIN) (an SV) und zum Teil durch den Grant der Singapore National Research Foundation AG/CIV/GC70-C/NRF/2013/2 und den Singapore Health and Biomedical Sciences (HBMS) Industry Alignment Fund Pre-Positioning (IAF-PP) Grant H18/01/a0/018 finanziert, der von der Agentur für Wissenschaft, Technologie und Forschung (A * STAR) (an AMC) verwaltet wird. Vielen Dank an die Mitglieder des Duke-NUS Laboratory for Translational and Molecular Imaging (LTMI) für die Erleichterung der Logistik und Durchführung der Studien und Schulungen an Geräten. Besonderer Dank geht an Frau Wisna Novera für ihre redaktionelle Unterstützung.

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) bei SingHealth (Singapur) genehmigt. Weibliche C57BL/6 J-Mäuse (6-8 Wochen alt; 18-20 g) wurden aus InVivos, Singapur, gewonnen und in einem temperatur- und lichtkontrollierten Vivarium der Duke-NUS Medical School, Singapur, untergebracht. Die Tiere wurden gemäß den Richtlinien der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) für den Einsatz von Tieren in der Augen- und Sehforschung behandelt....

<ol>
	<li>Chaw, S. Y., Novera, W., Chacko, A. -. M., Wong, T. T. L., Venkatraman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fate+of+liposomes+after+subconjunctival+ocular+delivery.">In vivo fate of liposomes after subconjunctival ocular delivery.</a> Journal of Controlled Release. 329, 162-174 (2021).</li><li>Kuo, J. C. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+colorectal+dysplasia+using+fluorescently+labelled+lectins.">Detection of colorectal dysplasia using fluorescently labelled lectins.</a> Scientific Reports. 6 (1), 24231 (2016).</li><li>Wu, Y. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+custom+multiphoton+microscopy+platform+for+live+imaging+of+mouse+cornea+and+conjunctiva.">A custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60944 (2020).</li><li>Zhivov, A., Stachs, O., Kraak, R., Stave, J., Guthoff, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+confocal+microscopy+of+the+ocular+surface.">In vivo confocal microscopy of the ocular surface.</a> The Ocular Surface. 4 (2), 81-93 (2006).</li><li>Bassyouni, F., ElHalwany, N., Ab del Rehim, M., Neyfeh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+new+technologies+applied+in+controlled+drug+delivery+system.">Advances and new technologies applied in controlled drug delivery system.</a> Research on Chemical Intermediates. 41 (4), 2165-2200 (2015).</li><li>Sercombe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+challenges+of+liposome+assisted+drug+delivery.">Advances and challenges of liposome assisted drug delivery.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, (2015).</li><li>Koning, G. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+in+drug+delivery:+Progress+and+limitations.">Liposomes in drug delivery: Progress and limitations.</a> International Journal of Pharmaceutics. 154 (2), 123-140 (1997).</li><li>Abrishami, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+characterization,+and+in+vivo+evaluation+of+nanoliposomes-encapsulated+Bevacizumab+(Avastin)+for+intravitreal+administration.">Preparation, characterization, and in vivo evaluation of nanoliposomes-encapsulated Bevacizumab (Avastin) for intravitreal administration.</a> Retina. 29 (5), 699-703 (2009).</li><li>Pleyer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+absorption+of+cyclosporine+A+from+liposomes+incorporated+into+collagen+shields.">Ocular absorption of cyclosporine A from liposomes incorporated into collagen shields.</a> Current Eye Research. 13 (3), 177-181 (1994).</li><li>Shen, Y., Tu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+ocular+pharmacokinetics+of+ganciclovir+liposomes.">Preparation and ocular pharmacokinetics of ganciclovir liposomes.</a> The AAPS Journal. 9 (3), 371-377 (2007).</li><li>Weijtens, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concentration+of+dexamethasone+in+aqueous+and+vitreous+after+subconjunctival+injection.">High concentration of dexamethasone in aqueous and vitreous after subconjunctival injection.</a> American Journal of Ophthalmology. 128 (2), 192-197 (1999).</li><li>Voss, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+injectable+drug+delivery+system+for+subconjunctival+glaucoma+treatment.">Development of a novel injectable drug delivery system for subconjunctival glaucoma treatment.</a> Journal of Controlled Release. 214, 1-11 (2015).</li><li>Giarmoukakis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+nanoparticles+for+controlled+subconjunctival+delivery+of+latanoprost+acid:+In+vitro+and+in+vivo+evaluation.+Preliminary+results.">Biodegradable nanoparticles for controlled subconjunctival delivery of latanoprost acid: In vitro and in vivo evaluation. Preliminary results.</a> Experimental Eye Research. 112, 29-36 (2013).</li><li>Shah, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal+and+subconjunctival+melphalan+for+retinoblastoma+in+transgenic+mice.">Intravitreal and subconjunctival melphalan for retinoblastoma in transgenic mice.</a> Journal of Ophthalmology. 2014, 829879 (2014).</li><li>Dastjerdi, M. H., Sadrai, Z., Saban, D. R., Zhang, Q., Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+Penetration+of+Topical+and+Subconjunctival+Bevacizumab.">Corneal Penetration of Topical and Subconjunctival Bevacizumab.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 52 (12), 8718-8723 (2011).</li><li>Ezra-Elia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+an+in+vivo+imaging+system+be+used+to+determine+localization+and+biodistribution+of+AAV5-mediated+gene+expression+following+subretinal+and+intravitreal+delivery+in+mice.">Can an in vivo imaging system be used to determine localization and biodistribution of AAV5-mediated gene expression following subretinal and intravitreal delivery in mice.</a> Experimental Eye Research. 176, 227-234 (2018).</li><li>Movila, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+endoscopic+technology+for+real-time+monitoring+of+inflammation+caused+in+experimental+periodontitis.">Intravital endoscopic technology for real-time monitoring of inflammation caused in experimental periodontitis.</a> Journal of Immunological Methods. 457, 26-29 (2018).</li><li>Vanherp, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoscopic+fibered+confocal+fluorescence+microscopy+for+longitudinal+in+vivo+assessment+of+pulmonary+fungal+infections+in+free-breathing+mice.">Bronchoscopic fibered confocal fluorescence microscopy for longitudinal in vivo assessment of pulmonary fungal infections in free-breathing mice.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3009 (2018).</li><li>Chagnon, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+intravital+endoscopic+confocal+fluorescence+microscopy+of+normal+and+acutely+injured+rat+lungs.">In vivo intravital endoscopic confocal fluorescence microscopy of normal and acutely injured rat lungs.</a> Laboratory Investigation. 90 (6), 824-834 (2010).</li><li>Yun, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+near-infrared+fluorescence+conjugation+on+the+anti-cancer+potential+of+cetuximab.">The effect of near-infrared fluorescence conjugation on the anti-cancer potential of cetuximab.</a> Laboratory Animal Research. 34 (1), 30-36 (2018).</li></ol>

Wie aus den Ergebnissen hervorgeht, bietet CLM eine einfache und praktikable Methode, um die Augenverteilung von Liposomen im Auge abzubilden. Wir haben zuvor die Verwendung von CLM demonstriert, um die Lokalisation verschiedener liposomaler Formulierungen im Mausauge im Laufe der Zeit zu charakterisieren1. Für nicht-invasive Anwendungen ermöglicht CLM die Echtzeit-Bildgebung der vorderen Augenoberfläche, um Erkenntnisse darüber zu erhalten, wie Liposomen vom selben Tier im Auge verteilt sind....

Die Blutclearance, die Gewebeverteilung und die Zielbelegung von Medikamenten in lebenden Systemen sind Säulen für das Verständnis der In-vivo-Wirkstoffdisposition. In präklinischen Tiermodellen werden diese Parameter typischerweise durch häufige Blut- und Gewebeentnahmen zu bestimmten Zeitpunkten nach der Verabreichung des Arzneimittels beurteilt. Diese Verfahren sind jedoch im Allgemeinen invasiv, beinhalten oft Nicht-Überlebensmessungen und erfordern große Tierkohorten für die statistische Auswertung. Es können zusätzliche Kosten und Zeit anfallen, zusammen mit ethischen Bedenken für übermäßigen Gebrauch von Tieren. Infolgedessen wird die nicht-invasive Bildgebung schnell zu einem integralen Schritt in Bioverteilungsstudien. Die konfokale Lasermikroendoskopie (CLM1,2) eignet sich gut für okuläre Anwendungen, um die räumlich-zeitliche Verteilung von Therapeutika in den Augen lebender Tiere mit hoher Empfindlichkeit und hoher Auflösung nicht-invasiv abzubilden1,3,4.
CLM hat das Potenzial, ein robustes Screening von okulären Drug Delivery Systemen (DDS) wie Liposomen vor einer umfassenden Quantifizierung des DDS und der Bioverfügbarkeit des Arzneimittels zu erleichtern. Liposomen sind attraktiv für ihre Flexibilität bei der Abstimmung ihrer physikalisch-chemischen und biophysikalischen Eigenschaften5,6,7,8,9,10,11, um eine Vielzahl von therapeutischen Ladungen zu verkapseln und die Gewebestelle der Wirkstofffreisetzung und die Wirkungsdauer zu kontrollieren. Liposomen wurden in okulären Anwendungen zur Abgabe großer Moleküle wie dem monoklonalen Antikörper Bevacizumab12 und kleinen Molekülen wie Cyclosporin13 und Ganciclovir14 eingesetzt. Arzneimittelbeladene Liposomen haben längere biologische Halbwertszeiten und verlängerte therapeutische Wirkungen im Vergleich zu nicht-liposomalen "freien Arzneimittel" -Formulierungen. Die Arzneimittelverteilung im Augengewebe wird jedoch typischerweise aus arzneimittelkonzentrationen in flüssigen Komponenten des Auges (d. H. Blut, Kammerwasser und Glaskörper) extrapoliert15,16,17). Da das anfängliche In-vivo-Schicksal der beladenen Wirkstoffladung durch die Eigenschaften des Nanocarriers selbst definiert wird, kann die CLM-Bildgebung der fluoreszierenden Liposomen als Surrogat für das Medikament dienen, um Gewebe-Targeting und In-situ-Gewebeverweilzeiten aufzudecken. Darüber hinaus kann der visuelle Nachweis der Verabreichung mit CLM das DDS-Redesign steuern, den therapeutischen Nutzen des Arzneimittels bewerten und möglicherweise sogar unerwünschte biologische Ereignisse vorhersagen (z. B. Gewebetoxizität aufgrund unerwünschter Lokalisation von DDS über einen längeren Zeitraum).
Hierin wird ein Schritt-für-Schritt-Verfahren beschrieben, wie die okuläre Bioverteilung von Liposomen in lebenden Mäusen mit einem Dual-Band-CLM-System untersucht werden kann. Dieses spezielle CLM-System kann zweifarbige Fluoreszenz (mit grünen und roten Anregungslasern bei 488 nm und 660 nm) in Echtzeit mit einer Frequenz von 8 Bildern/s erkennen. Durch die physische Platzierung der Nachweissonde auf dem Auge demonstriert das Protokoll die Bilderfassung und Analyse von grün fluoreszierenden Liposomen bei subkonjunktivaler Verabreichung in Mäusen, die intravenös (IV) mit 2% Evans Blue (EB) Farbstoff vorinjiziert wurden. EB-Farbstoff hilft, die vaskularisierten Strukturen im roten Fluoreszenzkanal sichtbar zu machen. Wir zeigen repräsentative Ergebnisse aus einer Studie, in der 100 nm neutrale Liposomen untersucht wurden, die aus dem Phospholipid POPC (d.h. 1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholin) bestehen und mit Fluorescein-markiertem Phospholipid Fl-DHPE (d.h. N-(Fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexa-decanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamin dotiert sind) im Verhältnis von 95% POPC: 5% Fl-DHPE (Abbildung 1B ). CLM ist in der Lage, die grünen Fluorescein-markierten Liposomen mit 15 μm axialer und 3,30 μm lateraler Auflösung durch Abgrenzung von EB-gefärbten Augengewebegrenzen zu erfassen.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.08 &#181;m polycarbonate filter</td>
			<td>Whatman, USA</td>
			<td>110604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Fisherbrand, Ireland</td>
			<td>09-720-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution</td>
			<td>Alcon, Singapore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Glass Syringe</td>
			<td>Hamilton, USA</td>
			<td>65460-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti, USA</td>
			<td>850457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 G needle (Hamilton, 0.5&#8221; PT4)</td>
			<td>Hamilton, USA</td>
			<td>7803-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm)</td>
			<td>WPI, USA</td>
			<td>ATC 2000 &#38; 61800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5)</td>
			<td>Mauna Kea Technologies, France</td>
			<td></td>
			<td>Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 &#181;m x 500 &#181;m, axial resolution: 15 &#181;m, lateral resolution: 3.3 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>472476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers #5, Dumostar</td>
			<td>WPI, USA</td>
			<td>500233</td>
			<td>11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans Blue</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>E2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fusidic acid eye drop</td>
			<td>LEO Pharma, Denmark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Malvern Panalytical, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>179337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Extruder</td>
			<td>Avanti, USA</td>
			<td>610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE)</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>F362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope System with table clamp stand</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td>SZ51 &#38; SZ2-STU3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatio-temporal in vivo imaging of ocular drug delivery systems using fiberoptic confocal laser microendoscopy

Die subkonjunktivale Injektion ist ein attraktiver Weg zur Verabreichung von Augenmedikamenten aufgrund des einfachen transskleralen Zugangs, der anteriore Augenbarrieren wie Hornhaut und Bindehaut umgeht. Während therapeutische Wirkungen und Pharmakokinetik der Arzneimittel bei subkonjunktivaler Injektion in einigen Studien beschrieben wurden, beurteilen nur sehr wenige die Augenverteilung von Arzneimitteln oder Drug Delivery Systems (DDS). Letzteres ist entscheidend für die Optimierung des intraokularen DDS-Designs und der Bioverfügbarkeit des Arzneimittels, um die gewünschte Okularlokalisation und Wirkungsdauer (z. B. akut versus verlängert) zu erreichen. Diese Studie etabliert die Verwendung der faseroptischen konfokalen Lasermikroendoskopie (CLM) zur qualitativen Untersuchung der Augenverteilung von fluoreszierenden Liposomen in Echtzeit in lebenden Mäusen nach subkonjunktivaler Injektion. Konzipiert für die visuelle In-vivo-Inspektion von Geweben auf mikroskopischer Ebene, ist dies auch die erste vollständige Beschreibung der CLM-Bildgebungsmethode zur Untersuchung der räumlich-zeitlichen Verteilung von Injektionsmitteln im Auge nach subkonjunktivaler Injektion.

Das Protokoll zeigt den Nutzen von CLM zur Beurteilung der räumlich-zeitlichen Augenverteilung von grün fluoreszierenden Liposomen, die durch subkonjunktivale Injektion verabreicht werden. Um die zweifarbige Fähigkeit (488 nm und 660 nm Anregungswellenlängen) des CLM-Systems zu nutzen, wurden 100 nm neutrale POPC-Liposomen, die injiziert werden sollten, mit 5% Fl-DHPE dotiert (Zusammensetzungs- und Charakterisierungsdaten sind in Abbildung 1B dargestellt), und EB wurde IV injiziert, um L...

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Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

Wir stellen ein Protokoll für den Einsatz der faseroptischen konfokalen Lasermikroendoskopie (CLM) vor, um die räumlich-zeitliche Verteilung von Liposomen im Auge nach subkonjunktivaler Injektion nicht-invasiv zu untersuchen.

Räumlich-zeitliche In-vivo-Bildgebung von okulären Wirkstoffabgabesystemen mittels faseroptischer konfokaler Lasermikroendoskopie

Subconjunctival injection is an attractive route to administer ocular drugs due to easy trans-scleral access that bypasses anterior ocular barriers, such ...

Dieses Protokoll erleichtert das Screening neuer Formulierungen, um besser zu verstehen, wie sich Modifikationen auf ihre Gewebeverweilzeiten auswirken, was für die Entwicklung eines optimalen Arzneimittelabgabesystems von entscheidender Bedeutung ist. Diese Technik ist nichtinvasiv und ermöglicht Echtzeit-Bildgebung, was den übermäßigen Einsatz von Tieren für die Probenahme reduziert. Drug-Delivery-Systeme können für bildgebende und therapeutische Anwendungen neu gestaltet werden, indem einfach das therapeutische Medikament und die bildgebende Einheit in einem Nano-Carrier zusammengefasst werden.Dies hat nützliche Anwendungen sowohl bei der Behandlung von Krebs als auch bei Infektionskrankheiten. Das Verfahren wird Rasha Msallam, senior research fellow aus meinem Labor, demonstrieren. Zunächst wird die Maus zwei Stunden vor der subkonjunktivalen Injektion intravenös über den Schwanz mit 2,5 Milligramm pro Kilogramm Evans Blue oder EB injiziert. Nachdem Sie die Maus mit 5% Isofluran sediert haben, übertragen Sie die Maus auf einen Nasenkegel und halten Sie die sedierte Maus auf einem Heizkissen.Schneiden Sie dann die Schnurrhaare in der Nähe des zu injizierenden Auges ab. Geben Sie einen Tropfen von 0,5% Proxymetacainhydrochlorid-Lösung direkt auf das Auge. Laden Sie als Nächstes eine 10-Mikroliter-Glasspritze, die mit einer 32-Gauge-Nadel mit fluoreszierenden Liposomen ausgestattet ist, und stellen Sie sicher, dass die Luftblasen nicht in der Spritze vorhanden sind.Heben Sie mit einer Pinzette die Bindehaut an und injizieren Sie langsam Liposomen in den subkonjunktivalen Raum, dann ziehen Sie die Nadel langsam zurück, um den Rückfluss zu verhindern. Sorgen Sie für die Bildung von Bleb, die mit fluoreszierenden Liposomen gefüllt sind. Verabreichen Sie einen 1% igen Fusitsäuretropfen auf das Auge und überwachen Sie die Maus, bis sie wieder zu Bewusstsein kommt.Schalten Sie das CLM-System ein. Schließen Sie die Sonde an das CLM-System an. Wählen Sie an dieser Stelle das Sichtfeld und den Speicherort für die Erfassungsdateien aus.Passen Sie die Laserintensität an, um sicherzustellen, dass die Fluoreszenzdetektion für Fluorescein-DHPE im linearen Bereich liegt, und halten Sie die Intensität konsistent für den Vergleich zwischen Bildern, die zu verschiedenen Zeitpunkten aufgenommen wurden. Nachdem das System 15 Minuten lang aufgewärmt wurde, kalibrieren Sie das System gemäß den Anweisungen des Herstellers mit dem Kalibrierkit, das die Reinigungs-, Spül- und Fluoro-4-Lösungen für jeden Laser enthält. Beginnen Sie kurz mit der Kalibrierung, indem Sie die Spitze jeweils fünf Sekunden lang in die Reinigungsflasche und dann in die Spülflasche tauchen.Lassen Sie die Spitze für die Hintergrundaufzeichnung in der Luft, um die Hintergrundwerte der verschiedenen Fasern der Sonden zu normalisieren und die Bildgleichmäßigkeit zu gewährleisten. Tauchen Sie die Spitze erneut fünf Sekunden lang in die Reinigungsflasche und dann in die Spülflasche. Als nächstes tauchen Sie die Spitze fünf Sekunden lang in die Durchstechflasche mit Fluor-4 488-Nanometer, um die Signalwerte zu normalisieren.Wiederholen Sie das Eintauchen der Spitze für fünf Sekunden in die Reinigungsflasche, gefolgt von der Spülflasche. Bewahren Sie die Spitze in der Spülflasche auf, bis das im vorherigen Schritt aufgezeichnete Fluoreszenzsignal verschwindet. Übertragen Sie dann die Spitze in die Durchstechflasche, die Fluor-4 660-Nanometer enthält, um die Signalwerte von verschiedenen Fasern in der Sonde zu normalisieren.Stellen Sie nach der Kalibrierung sicher, dass der Wert für den Hintergrund der Sonde kleiner als 100 ist. Andernfalls führen Sie eine wiederholte Reinigung der Sonde mit einem Baumwollspitzenapplikator durch. Schalten Sie den Tiertemperaturregler mit angeschlossenem Heizkissen ein und stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius ein.Nachdem Sie das Heizkissen mit einem chirurgischen Vorhang abgedeckt haben, befestigen Sie den Nasenkonus auf dem Heizkissen. Nachdem Sie die Maus mit 5% Isofluran in einer Induktionskammer sediert haben, übertragen Sie die Maus auf den Nasenkegel und halten Sie die sedierte Maus auf einem Heizkissen. Dann geben Sie einen Tropfen Anästhetikum 0,5% Proxymetacainhydrochlorid-Lösung auf das Auge.Um die Augenoberfläche zu waschen und die Kristallisation der Linse zu vermeiden, halten Sie die Augen geschmiert, indem Sie ein paar Salztropfen fallen lassen. Drehen und justieren Sie dann das Okular des Mikroskops, um das Mausauge ergonomisch im direkten Fokus bei 0,67-facher Vergrößerung zu betrachten. Schalten Sie den Laser ein und legen Sie die Sonde wie einen Stift direkt auf die zu fotografierende Augenregion.Beginnen Sie dann mit der Aufzeichnung der Erfassung, um die Fluoreszenz im Auge in der interessierenden Region zu beobachten. Stoppen Sie die Aufzeichnung, wenn alle Regionen gemäß der Augenkarte gekennzeichnet und beschriftet sind, um die genaue Sondenposition im genauen Rahmen zu kennen. Die Erfassungsdateien werden automatisch als Videodateien an dem zuvor ausgewählten Speicherort gespeichert.Die Fluoreszenzbildgebung zeigte eine deutliche Differenzierung zwischen den Bereichen Sklera und Hornhaut. Eine hohe Vaskularisierung der Episklera und der Bindehaut führte dazu, dass sich die Skleraregion rot mit EB färbte. Die Hornhaut, der das Gefäßsystem fehlt, erschien schwarz. Die Kontrastfluoreszenz von Limbus und Sklera wurde in einer siebentägigen Studie beobachtet.Fluorescein-Farbstoff-injizierte Kontrollmäuse bestätigten die Spezifität der Liposomen-abgeleiteten Fluoreszenz. Die Fluoreszenzintensitäten waren am ersten und dritten Tag hoch. Grüne Fluoreszenz proxizierte die Liposomenreduktion in den Limbus- und Skleraregionen im Laufe der Zeit.Die Unterschiede in den Fluoreszenzsignalen vom ersten bis zum dritten Tag nach der Injektion an den Regionen des Temporal limbus und des oberen Limbus waren nicht signifikant, was auf die Präferenz neutraler Liposomen gegenüber der Limbusregion, insbesondere der Hornhautperipherie, hindeutet. Für die temporalen und oberen Regionen am ersten Tag nach der Injektion war die Fluoreszenz in der Sklera sechsmal höher als im Limbus. Am dritten und siebten Tag waren liposomen in der Sklera in den temporalen und oberen Regionen signifikant reduziert, was auf die Okulären Clearance-Mechanismen zurückzuführen ist.Die geringste Menge an Fluoreszenz wurde aufgrund der Entfernung von der Injektionsstelle in den nasalen und unteren Regionen nachgewiesen. Es ist wichtig, die Fleckenrahmen entsprechend der Eyemap zu beschriften, bevor die Aufnahme gestoppt wird. Halten Sie die Laserintensität konsistent und definieren Sie den maximalen Hintergrundwert für einen ordnungsgemäßen Vergleich zwischen verschiedenen Experimenten.Nach der Identifizierung von Leitformulierungen können umfassende pharmakokinetische und Biodistributionsstudien an Tieren durchgeführt werden, um die Bioverfügbarkeit des Arzneimittels zu untersuchen und die therapeutische Wirksamkeit ihrer Formulierungen zu validieren.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Hochauflösende LWL-Mikroendoskopiesysteme für In situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Forschung

Biotechnik

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Video-rate konfokalen Mikroskopie und Mikroendoskopiesysteme

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Räumlich-zeitliche Manipulation kleiner GTPase-Aktivität in subzellulären Ebene und auf Zeitskala von Sekunden in lebenden Zellen

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Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

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Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

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Multimodale Bildgebung und Spektroskopie Faserbündelmikroendoskopie Plattform für Nicht-invasive,<em&gt; In Vivo</em&gt; Gewebeanalyse

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Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Herstellung und Drug-Delivery-Anwendungen von Silk Nanopartikel

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Umfassende Bewertung der Wirksamkeit und Sicherheit von Plazenta-gezielte Medikamentenverabreichung mit drei komplementäre Methoden

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Herstellung von Proteinproduktion synthetischer Zellen mit zellfreien bakteriellen Extrakten, Liposomen und Emulsionstransfer

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