Name: spatio-temporal in vivo imaging of ocular drug delivery systems using fiberoptic confocal laser microendoscopy
Uploaded: 2021-09-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy at JoVE.com

מחקר זה מומן על ידי מענק NTU-Northwestern של מכון ננו-רפואה (NNIN) שהוענק (ל- SV) ובחלקו על ידי מענק קרן המחקר הלאומית של סינגפור GRANT AG/CIV/GC70-C/NRF/2013/2 וקרן הבריאות והמדעים הביו-רפואיים של סינגפור (HBMS) מענק מימון מקדים למיצוב (IAF-PP) H18/01/a0/018 המנוהל על ידי הסוכנות למדע, טכנולוגיה ומחקר (A*STAR) (A*STAR) (ל- AMC). תודה לחברי מעבדת Duke-NUS להדמיה תרגומית ומולקולרית (LTMI) על הסיוע הלוגיסטי והביצוע של המחקרים וההכשרה על ציוד. תודה מיוחדת לגברת ויסנה נוברה על עזרתה במערכת.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) ב- SingHealth (סינגפור). נקבות C57BL/6 J עכברים (6- 8 שבועות; 18-20 גרם) התקבלו מ InVivos, סינגפור, ושוכנו ב טמפרטורה ויבריום מבוקר אור של בית הספר לרפואה דיוק-NUS, סינגפור. בעלי חיים טופלו בהתאם להנחיות האגודה לחקר הראייה ורפואת עי...

<ol>
	<li>Chaw, S. Y., Novera, W., Chacko, A. -. M., Wong, T. T. L., Venkatraman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fate+of+liposomes+after+subconjunctival+ocular+delivery.">In vivo fate of liposomes after subconjunctival ocular delivery.</a> Journal of Controlled Release. 329, 162-174 (2021).</li><li>Kuo, J. C. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+colorectal+dysplasia+using+fluorescently+labelled+lectins.">Detection of colorectal dysplasia using fluorescently labelled lectins.</a> Scientific Reports. 6 (1), 24231 (2016).</li><li>Wu, Y. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+custom+multiphoton+microscopy+platform+for+live+imaging+of+mouse+cornea+and+conjunctiva.">A custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60944 (2020).</li><li>Zhivov, A., Stachs, O., Kraak, R., Stave, J., Guthoff, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+confocal+microscopy+of+the+ocular+surface.">In vivo confocal microscopy of the ocular surface.</a> The Ocular Surface. 4 (2), 81-93 (2006).</li><li>Bassyouni, F., ElHalwany, N., Ab del Rehim, M., Neyfeh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+new+technologies+applied+in+controlled+drug+delivery+system.">Advances and new technologies applied in controlled drug delivery system.</a> Research on Chemical Intermediates. 41 (4), 2165-2200 (2015).</li><li>Sercombe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+challenges+of+liposome+assisted+drug+delivery.">Advances and challenges of liposome assisted drug delivery.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, (2015).</li><li>Koning, G. A., Storm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+drug+delivery+systems+for+the+intracellular+delivery+of+macromolecular+drugs.">Targeted drug delivery systems for the intracellular delivery of macromolecular drugs.</a> Drug Discovery Today. 8 (11), 482-483 (2003).</li><li>Metselaar, J. M., Storm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+in+the+treatment+of+inflammatory+disorders.">Liposomes in the treatment of inflammatory disorders.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 2 (3), 465-476 (2005).</li><li>Ding, B. S., Dziubla, T., Shuvaev, V. V., Muro, S., Muzykantov, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+drug+delivery+systems+that+target+the+vascular+endothelium.">Advanced drug delivery systems that target the vascular endothelium.</a> Molecular Interventions. 6 (2), 98-112 (2006).</li><li>Hua, S., Wu, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+lipid-based+nanocarriers+for+targeted+pain+therapies.">The use of lipid-based nanocarriers for targeted pain therapies.</a> Frontiers in Pharmacology. 4, 143 (2013).</li><li>Sharma, A., Sharma, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+in+drug+delivery:+Progress+and+limitations.">Liposomes in drug delivery: Progress and limitations.</a> International Journal of Pharmaceutics. 154 (2), 123-140 (1997).</li><li>Abrishami, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+characterization,+and+in+vivo+evaluation+of+nanoliposomes-encapsulated+Bevacizumab+(Avastin)+for+intravitreal+administration.">Preparation, characterization, and in vivo evaluation of nanoliposomes-encapsulated Bevacizumab (Avastin) for intravitreal administration.</a> Retina. 29 (5), 699-703 (2009).</li><li>Pleyer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+absorption+of+cyclosporine+A+from+liposomes+incorporated+into+collagen+shields.">Ocular absorption of cyclosporine A from liposomes incorporated into collagen shields.</a> Current Eye Research. 13 (3), 177-181 (1994).</li><li>Shen, Y., Tu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+ocular+pharmacokinetics+of+ganciclovir+liposomes.">Preparation and ocular pharmacokinetics of ganciclovir liposomes.</a> The AAPS Journal. 9 (3), 371-377 (2007).</li><li>Weijtens, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concentration+of+dexamethasone+in+aqueous+and+vitreous+after+subconjunctival+injection.">High concentration of dexamethasone in aqueous and vitreous after subconjunctival injection.</a> American Journal of Ophthalmology. 128 (2), 192-197 (1999).</li><li>Voss, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+injectable+drug+delivery+system+for+subconjunctival+glaucoma+treatment.">Development of a novel injectable drug delivery system for subconjunctival glaucoma treatment.</a> Journal of Controlled Release. 214, 1-11 (2015).</li><li>Giarmoukakis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+nanoparticles+for+controlled+subconjunctival+delivery+of+latanoprost+acid:+In+vitro+and+in+vivo+evaluation.+Preliminary+results.">Biodegradable nanoparticles for controlled subconjunctival delivery of latanoprost acid: In vitro and in vivo evaluation. Preliminary results.</a> Experimental Eye Research. 112, 29-36 (2013).</li><li>Shah, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal+and+subconjunctival+melphalan+for+retinoblastoma+in+transgenic+mice.">Intravitreal and subconjunctival melphalan for retinoblastoma in transgenic mice.</a> Journal of Ophthalmology. 2014, 829879 (2014).</li><li>Dastjerdi, M. H., Sadrai, Z., Saban, D. R., Zhang, Q., Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+Penetration+of+Topical+and+Subconjunctival+Bevacizumab.">Corneal Penetration of Topical and Subconjunctival Bevacizumab.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 52 (12), 8718-8723 (2011).</li><li>Ezra-Elia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+an+in+vivo+imaging+system+be+used+to+determine+localization+and+biodistribution+of+AAV5-mediated+gene+expression+following+subretinal+and+intravitreal+delivery+in+mice.">Can an in vivo imaging system be used to determine localization and biodistribution of AAV5-mediated gene expression following subretinal and intravitreal delivery in mice.</a> Experimental Eye Research. 176, 227-234 (2018).</li><li>Movila, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+endoscopic+technology+for+real-time+monitoring+of+inflammation+caused+in+experimental+periodontitis.">Intravital endoscopic technology for real-time monitoring of inflammation caused in experimental periodontitis.</a> Journal of Immunological Methods. 457, 26-29 (2018).</li><li>Vanherp, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoscopic+fibered+confocal+fluorescence+microscopy+for+longitudinal+in+vivo+assessment+of+pulmonary+fungal+infections+in+free-breathing+mice.">Bronchoscopic fibered confocal fluorescence microscopy for longitudinal in vivo assessment of pulmonary fungal infections in free-breathing mice.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3009 (2018).</li><li>Chagnon, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+intravital+endoscopic+confocal+fluorescence+microscopy+of+normal+and+acutely+injured+rat+lungs.">In vivo intravital endoscopic confocal fluorescence microscopy of normal and acutely injured rat lungs.</a> Laboratory Investigation. 90 (6), 824-834 (2010).</li><li>Yun, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+near-infrared+fluorescence+conjugation+on+the+anti-cancer+potential+of+cetuximab.">The effect of near-infrared fluorescence conjugation on the anti-cancer potential of cetuximab.</a> Laboratory Animal Research. 34 (1), 30-36 (2018).</li></ol>

כפי שמוצג מהתוצאות, CLM מספק שיטה פשוטה וישימה לדמיין את התפלגות העין של ליפוזומים בעין. הדגמנו בעבר את השימוש ב- CLM כדי לאפיין את הלוקליזציה של ניסוחים ליפוזומיים שונים בתוך עין העכבר לאורך זמן1. עבור יישומים לא פולשניים, CLM מאפשר הדמיה בזמן אמת של פני השטח העין הקדמית לקבלת תובנ...

סיווג הדם, חלוקת הרקמות ותפוסת היעד של תרופות במערכות חיות הם עמודי התווך להבנה בטבע התרופה של vivo. במודלים פרה-קליניים של בעלי חיים, פרמטרים אלה מוערכים בדרך כלל על ידי דגימת דם ורקמות תכופה בנקודות זמן מסוימות לאחר מתן התרופה. עם זאת, הליכים אלה הם בדרך כלל פולשניים, לעתים קרובות כוללים מדידות שאינן הישרדות, ומחייבים קבוצות גדולות של בעלי חיים להנעה סטטיסטית. ייתכנו עלות וזמן נוספים, יחד עם חששות אתיים לשימוש מופרז בבעלי חיים. כתוצאה מכך, הדמיה לא פולשנית הופכת במהירות לצעד אינטגרלי במחקרים על ייחוס ביולוגי. מיקרונדוסקופיית לייזר קונפוקלית (CLM1,2) מתאימה היטב ליישומי עיניים כדי לדמיין באופן לא פולשני את ההתפלגות המרחבית-זמנית של טיפולים בעיני בעלי חיים חיים בעלי רגישות גבוהה ורזולוציה גבוהה 1,3,4.
CLM יש פוטנציאל להקל על הקרנה חזקה של מערכות אספקת תרופות עינית (DDS), כגון ליפוזומים, לפני כימות מקיף של DDS וזמינות ביולוגית סמים. ליפוזומים אטרקטיביים עבור הגמישות שלהם כוונון התכונות הפיזיקוכימיות והביופיסיות שלהם5,6,7,7,8,9,10,11 כדי לתמצת מגוון גדול של מטען טיפולי ולשלוט באתר הרקמה של שחרור סמים ומשך הפעולה. ליפוזומים שימשו ביישומים עיניים להעברת מולקולות גדולות, כגון נוגדן חד שבטי אווסטין12, ומולקולות קטנות כמו ציקלוספורין13 ו ganciclovir14. ליפוזומים טעונים בתרופות יש מחצית חיים ביולוגית ארוכה יותר, השפעות טיפוליות ממושכות לעומת ניסוחים "תרופה חופשית" לא ליפוזומית. עם זאת, הפצת סמים ברקמת העין מוערכת בדרך כלל מריכוז סמים ברכיבי נוזלים של העין (כלומר, דם, הומור מימי והומור זגוגי15,16,17). כמו הגורל הראשוני ב vivo של מטען התרופה טעון מוגדר על ידי המאפיינים של nanocarrier עצמו, הדמיה CLM של ליפוזומים פלואורסצנטי יכול לשמש פונדקאית עבור התרופה לחשוף מיקוד רקמות בזמני מגורים רקמה במקום. יתר על כן, ראיות חזותיות של משלוח עם CLM יכול לנווט DDS מחדש עיצוב, להעריך את היתרונות הטיפוליים של התרופה, ואולי אפילו לחזות אירועים ביולוגיים שליליים (למשל, רעילות רקמות עקב לוקליזציה לא רצויה של DDS לתקופות ממושכות של זמן).
להלן, הליך שלב אחר שלב מפורט על איך ללמוד את הייחוס הביולוגי העין של ליפוזומים בעכברים חיים עם מערכת CLM כפולת פסים. מערכת CLM ספציפית זו יכולה לזהות פלואורסצנטיות בשני צבעים (עם לייזרי עירור ירוקים ואדומים ב-488 ננומטר ו-660 ננומטר) בזמן אמת, בתדירות של 8 פריימים לשנייה. על ידי הצבה פיזית של גשושית הזיהוי על העין, הפרוטוקול מדגים רכישת תמונה וניתוח של ליפוזומים ירוקים-פלואורסצנטיים על ניהול תת-קומוניאלי בעכברים שהוזרקו מראש תוך ורידי (IV) עם 2% צבע כחול אוונס (EB). צבע EB מסייע לדמיין את המבנים הסקולריים בערוץ הפלואורסצנטיות האדום. אנו מציגים תוצאות מייצגות ממחקר המעריך 100 ננומטר ליפוזומים ניטרליים המורכבים מ- POPC פוספוליפידי (כלומר, 1-פלמיטואיל-2-אולואיל-גליצרו-3-פוספוצולין) ו מסוממים עם פוספוליפיד Fl-DHPE מתויג פלואורסצין (כלומר, N-(פלואורסצ'ין-5-תיוקרבאמול) -1,2-דיהקסה-דקנויל-גליצרו-3-פוספוטהנולמין) ביחס של 95% POPC: 5% Fl-DHPE (איור 1B ). CLM הוא מסוגל ללכוד את ליפוזומים מתויג פלואורסצ'ין ירוק ברזולוציה צירית 15 מיקרומטר ו 3.30 מיקרומטר לרוחב על ידי תיחום של גבולות רקמת העין מוכתמת EB.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.08 &#181;m polycarbonate filter</td>
			<td>Whatman, USA</td>
			<td>110604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Fisherbrand, Ireland</td>
			<td>09-720-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution</td>
			<td>Alcon, Singapore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Glass Syringe</td>
			<td>Hamilton, USA</td>
			<td>65460-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti, USA</td>
			<td>850457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 G needle (Hamilton, 0.5&#8221; PT4)</td>
			<td>Hamilton, USA</td>
			<td>7803-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm)</td>
			<td>WPI, USA</td>
			<td>ATC 2000 &#38; 61800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5)</td>
			<td>Mauna Kea Technologies, France</td>
			<td></td>
			<td>Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 &#181;m x 500 &#181;m, axial resolution: 15 &#181;m, lateral resolution: 3.3 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>472476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers #5, Dumostar</td>
			<td>WPI, USA</td>
			<td>500233</td>
			<td>11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans Blue</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>E2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fusidic acid eye drop</td>
			<td>LEO Pharma, Denmark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Malvern Panalytical, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>179337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Extruder</td>
			<td>Avanti, USA</td>
			<td>610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE)</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>F362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope System with table clamp stand</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td>SZ51 &#38; SZ2-STU3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatio-temporal in vivo imaging of ocular drug delivery systems using fiberoptic confocal laser microendoscopy

הזרקה תת-ימית היא דרך אטרקטיבית למתן תרופות עיניות בשל גישה טרנס-סקלרלית קלה העוקפת מחסומי עיניים קדמיים, כגון הקרנית והלחמית. בעוד השפעות טיפוליות ופרמקוקינטיקה של התרופות על הזרקה תת-כיוונית תוארו במחקרים מסוימים, מעטים מאוד להעריך את ההפצה העין של תרופות או מערכות אספקת תרופות (DDS). זה האחרון הוא קריטי עבור אופטימיזציה של עיצוב DDS תוך עיני וזמינות ביולוגית סמים כדי להשיג את לוקליזציה העין הרצוי ומשך הפעולה (למשל, חריף לעומת ממושך). מחקר זה קובע את השימוש במיקרואנדוסקופיית לייזר קונפוקלית סיבים אופטיים (CLM) כדי לחקור באופן איכותי את התפלגות העין של ליפוזומים פלואורסצנטיים בזמן אמת בעכברים חיים לאחר הזרקת תת-הלחמית. להיות מתוכנן לבדיקה חזותית ויוו של רקמות ברמה המיקרוסקופית, זהו גם התיאור המלא הראשון של שיטת ההדמיה CLM לחקור התפלגות מרחבית-זמנית של הזרקה בעין לאחר הזרקה תת-כיוונית.

הפרוטוקול מדגים את התועלת של CLM כדי להעריך את התפלגות העין המרחבית-זמנית של ליפוזומים פלואורסצנטיים ירוקים המנוהלים באמצעות הזרקה תת-ימית. כדי לעשות שימוש ביכולת הצבע הכפול (488 ננומטר ואורכי גל של 660 ננומטר עירור) של מערכת CLM, 100 ננומטר ליפוזומי POPC ניטרליים להזרקה סוממו עם 5% Fl-DHPE (נתוני הרכב ו...

Watch this Scientific Journal Video about Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy at JoVE.com

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

אנו מציגים פרוטוקול לשימוש במיקרונדוסקופיית לייזר קונפוקלית סיבים אופטיים (CLM) כדי לחקור באופן לא פולשני את ההתפלגות המרחבית-זמנית של ליפוזומים בעין לאחר הזרקה תת-ימית.

Spatio-Temporal In Vivo הדמיה של מערכות אספקת תרופות עיניות באמצעות מיקרונדוסקופיה לייזר קונפוקל קונפוקלי פיברופטים

Subconjunctival injection is an attractive route to administer ocular drugs due to easy trans-scleral access that bypasses anterior ocular barriers, such ...

פרוטוקול זה מאפשר סינון של ניסוחים חדשים כדי להבין טוב יותר כיצד שינויים משפיעים על זמני המגורים שלהם רקמה, וזה קריטי בעיצוב מערכת אספקת תרופות אופטימלית. טכניקה זו אינה פולשנית ומאפשרת הדמיה בזמן אמת, מה שמפחית את השימוש המופרז בבעלי חיים לדגימה. מערכות אספקת תרופות ניתן לעצב מחדש עבור הדמיה ויישומים טיפוליים פשוט על ידי הכללת התרופה הטיפולית ואת moiety הדמיה בננו-נשא אחד.זה יש יישומים שימושיים הן בטיפול בסרטן ומחלות זיהומיות. מפגינה את ההליך תהיה רשא מסלם, עמיתת מחקר בכירה מהמעבדה שלי. ראשית, שעתיים לפני הזרקת תת-צינור, הזרקו לעכבר דרך הווריד דרך הזנב 2.5 מיליגרם לקילוגרם של כחול אוונס, או EB. לאחר הרגעת העכבר עם 5% איזופלוריין, להעביר את העכבר לקונוס האף ולשמור על עכבר מסומם על כרית חימום.לאחר מכן, לקצץ את השפם ליד העין כדי להיות מוזרק. להחדיר טיפה של 0.5% proxymetacaine פתרון הידרוכלוריד ישירות על העין. לאחר מכן, לטעון מזרק זכוכית 10 מיקרוליטר מצויד מחט 32-מד עם ליפוזומים פלואורסצנטיים ולוודא כי בועות האוויר אינם נוכחים במזרק.באמצעות פינצטה, להרים את הלחמית ולהזריק לאט ליפוזומים לתוך החלל התת-ימי, ולאחר מכן למשוך את המחט לאט, מניעת זרימה חזרה. ודא היווצרות של bleb מלא ליפוזומים פלואורסצנטיים. תן טיפת חומצה פוסיטית של 1% על העין ונטר את העכבר עד שהוא חוזר להכרה.הפעל את מערכת CLM. חבר את הגשוש למערכת CLM. בחר את שדה התצוגה ואת המיקום עבור קבצי הרכישה בשלב זה.התאם את עוצמת הלייזר כדי להבטיח שזיהוי הפלואורסצנטיות עבור פלואורסצ'ין DHPE נמצא בטווח הליניארי, ושמור על העוצמה עקבית להשוואה בין תמונות שצולמו בנקודות זמן שונות. לאחר חימום המערכת למשך 15 דקות, כייל את המערכת בהתאם להוראות היצרן באמצעות ערכת הכיול המכילה את פתרונות הניקוי, השטיפה והפלואורו-4 לכל לייזר. בקצרה, התחל לכייל על ידי טבילת הקצה במשך חמש שניות כל אחד בבקבוקון הניקוי, ולאחר מכן בבקבוקון השטיפה.השאירו את הקצה באוויר להקלטת רקע כדי לנרמל את ערכי הרקע מהגשושיות סיבים שונים, ולהבטיח אחידות תמונה. שוב, לטבול את הקצה במשך חמש שניות בבקבוקון ניקוי, ולאחר מכן בקבוקון שטיפה. לאחר מכן, לטבול את הקצה בקבוקון המכיל פלואורו-4 488-ננומטר במשך חמש שניות כדי לנרמל את ערכי האות.חזור על טבילת הקצה במשך חמש שניות בבקבוקון הניקוי ואחריו בקבוקון השטיפה. שמור את הקצה בבקבוקון השטיפה עד שאות הפלואורסצנטיות שנרשם בשלב הקודם ייעלם. לאחר מכן, העבר את הקצה בבקבוקון המכיל פלואורו-4 660 ננומטר כדי לנרמל ערכי אות מסיבים שונים בגשוש.לאחר הכיול, ודא שהערך קטן מ- 100 עבור הרקע של הגשושית. אחרת, בצע ניקוי חוזר ונשנה של הבדיקה עם אפליקטור קצה כותנה. הפעל את בקר הטמפרטורה של בעלי החיים עם כרית חימום מחוברת, והתאם את הטמפרטורה ל-37 מעלות צלזיוס.לאחר כיסוי כרית החימום עם וילון כירורגי, לתקן את חרוט האף על כרית החימום. לאחר הרגעת העכבר באמצעות 5% איזופלוריין בתא אינדוקציה, להעביר את העכבר לקונוס האף ולשמור על העכבר מסומם על כרית חימום. לאחר מכן, להחדיר טיפה של הרדמה 0.5% proxymetacaine הידרוכלוריד פתרון על העין.כדי לשטוף את פני השטח העין ולהימנע התגבשות של העדשה, לשמור על העיניים משומן על ידי הפלת כמה טיפות מלוחים. לאחר מכן, סובב והתאם את עפעפי המיקרוסקופ כדי להציג את עין העכבר ארגונומית במוקד הישיר בהגדלה של פי 0.67. הפעל את הלייזר והנח את הגשוש כמו עט ישירות על אזור העיניים כדי להיות בתמונה.לאחר מכן, התחל להקליט רכישה כדי לבחון את הפלואורסצנטיות בעין באזור העניין. הפסק את ההקלטה כאשר כל האזורים מסומנים בדגל ומסומנים לפי מפת העין כדי לדעת את מיקום הבדיקה המדויק במסגרת המדויקת. קבצי הרכישה יישמרו באופן אוטומטי כקבצי וידאו במיקום שנבחר בעבר.הדמיית הפלואורסצנטיות חשפה הבחנה ברורה בין אזורי הסקלרה והקרנית. כלי דם גבוהים של האפיסקלרה והלחמית גרמו לאזור הסקלרה להכתים אדום עם EB. הקרנית, שחסרה כלי דם, נראתה שחורה. הפלואורסצנטיות הניגודית של לימבוס וסקלרה נצפתה במחקר בן שבעה ימים.עכברי בקרה מוזרקים בצבע פלואורסצ'ין אישרו את הספציפיות של פלואורסצנטיות שמקורה בליפוזום. עוצמות הפלואורסצנטיות היו גבוהות ביום הראשון והשלישי. פלואורסצנטיות ירוקה סייעה להפחתת הליפוזום באזורי הלימבוס והסקלרה לאורך זמן.ההבדלים באותות הפלואורסצנטיות מהיום הראשון לאחר ההזרקה ליום השלישי בלימבוס הזמני ובאזורי לימבו מעולה לא היו משמעותיים, מה שמצביע על העדפה של ליפוזומים ניטרליים לאזור הלימבוס, במיוחד הפריפריה הקרנית. עבור האזורים הזמניים והנעלים ביום הראשון שלאחר ההזרקה, הפלואורסצנטיות בסקלרה הייתה גבוהה פי שישה מאשר בלימבוס. ביום השלישי והשביעי, ליפוזומים צומצמו באופן משמעותי בסקלרה באזורים הזמניים והעליון, המיוחסים למנגנוני פינוי עינית.הכמות הנמוכה ביותר של פלואורסצנטיות זוהתה באזורי האף והנחותות, בשל המרחק מאתר ההזרקה. חשוב לתייג את מסגרות הכתמים לפי מפת העיניים לפני הפסקת ההקלטה. שמור על עקביות עוצמת הלייזר והגדר את ערך הרקע המרבי להשוואה נכונה בין ניסויים שונים.לאחר זיהוי של ניסוחים עופרת, פרמקוקינטית מקיפה ומחקרים biodistribution בבעלי חיים ניתן לערוך כדי ללמוד את הזמינות הביולוגית של התרופה, ולאמת את היעילות הטיפולית של ניסוחים שלהם.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

רזולוציה גבוהה סיבים אופטיים עבור Microendoscopy באתרו נייד הדמיה

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

וידאו קצב סריקה מיקרוסקופית Confocal ו Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

במרחב ובזמן מניפולציה של פעילות GTPase קטן ברמת subcellular ועל לוח זמנים של שניות בתאים חיים

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

פיגומים דיווח עצמי לתרבית תאים 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

מודלים ושיטות להערכת תחבורה של ליפידיות פני מחסומים נייד

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

טכניקה ללא תווית להדמית החלל-הזמן של פרשות תא בודדת

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

הדמיה מולטימודליות וספקטרוסקופיה סיבים צרור פלטפורמת Microendoscopy עבור לא פולשני,<em&gt; In vivo</em&gt; בדיקת רקמות

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

יישומי ייצור משלוח סמים של חלקיקי משי

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

הערכה מקיפה של היעילות והבטיחות של משלוח סמים, ממוקדות השליה באמצעות שלוש שיטות משלימות

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

הכנת חלבון הפקת תאים סינתטיים באמצעות שולפת תא חינם בקטריאלי, ליפוזומים והעברת אמולסיה

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...