Name: spatio-temporal in vivo imaging of ocular drug delivery systems using fiberoptic confocal laser microendoscopy
Uploaded: 2021-09-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy at JoVE.com

Questa ricerca è stata finanziata dalla sovvenzione NTU-Northwestern Institute for Nanomedicine (NNIN) assegnata (a SV) e in parte dalla sovvenzione della Singapore National Research Foundation Grant AG / CIV / GC70-C / NRF / 2013 / 2 e dalla sovvenzione Health and Biomedical Sciences (HBMS) Industry Alignment Fund Pre-Positioning (IAF-PP) di Singapore H18/01/a0/018 amministrata dall'Agenzia per la scienza, la tecnologia e la ricerca (A * STAR) (ad AMC). Grazie ai membri del Duke-NUS Laboratory for Translational and Molecular Imaging (LTMI) per aver facilitato la logistica e l'esecuzione degli studi e della formazione sulle attrezzature. Un ringraziamento speciale alla signora Wisna Novera per la sua assistenza editoriale.

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) di SingHealth (Singapore). Topi femminili C57BL / 6 J (6- 8 settimane di età; 18-20 g) sono stati ottenuti da InVivos, Singapore, e alloggiati in un vivaio a temperatura e luce controllata della Duke-NUS Medical School, Singapore. Gli animali sono stati trattati in conformità con le linee guida della dichiarazione dell'Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia (ARVO) per l'uso di animali nella ricerca ...

<ol>
	<li>Chaw, S. Y., Novera, W., Chacko, A. -. M., Wong, T. T. L., Venkatraman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fate+of+liposomes+after+subconjunctival+ocular+delivery.">In vivo fate of liposomes after subconjunctival ocular delivery.</a> Journal of Controlled Release. 329, 162-174 (2021).</li><li>Kuo, J. C. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+colorectal+dysplasia+using+fluorescently+labelled+lectins.">Detection of colorectal dysplasia using fluorescently labelled lectins.</a> Scientific Reports. 6 (1), 24231 (2016).</li><li>Wu, Y. -. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+in+drug+delivery:+Progress+and+limitations.">Liposomes in drug delivery: Progress and limitations.</a> International Journal of Pharmaceutics. 154 (2), 123-140 (1997).</li><li>Abrishami, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+characterization,+and+in+vivo+evaluation+of+nanoliposomes-encapsulated+Bevacizumab+(Avastin)+for+intravitreal+administration.">Preparation, characterization, and in vivo evaluation of nanoliposomes-encapsulated Bevacizumab (Avastin) for intravitreal administration.</a> Retina. 29 (5), 699-703 (2009).</li><li>Pleyer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+absorption+of+cyclosporine+A+from+liposomes+incorporated+into+collagen+shields.">Ocular absorption of cyclosporine A from liposomes incorporated into collagen shields.</a> Current Eye Research. 13 (3), 177-181 (1994).</li><li>Shen, Y., Tu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+ocular+pharmacokinetics+of+ganciclovir+liposomes.">Preparation and ocular pharmacokinetics of ganciclovir liposomes.</a> The AAPS Journal. 9 (3), 371-377 (2007).</li><li>Weijtens, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concentration+of+dexamethasone+in+aqueous+and+vitreous+after+subconjunctival+injection.">High concentration of dexamethasone in aqueous and vitreous after subconjunctival injection.</a> American Journal of Ophthalmology. 128 (2), 192-197 (1999).</li><li>Voss, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+injectable+drug+delivery+system+for+subconjunctival+glaucoma+treatment.">Development of a novel injectable drug delivery system for subconjunctival glaucoma treatment.</a> Journal of Controlled Release. 214, 1-11 (2015).</li><li>Giarmoukakis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+nanoparticles+for+controlled+subconjunctival+delivery+of+latanoprost+acid:+In+vitro+and+in+vivo+evaluation.+Preliminary+results.">Biodegradable nanoparticles for controlled subconjunctival delivery of latanoprost acid: In vitro and in vivo evaluation. Preliminary results.</a> Experimental Eye Research. 112, 29-36 (2013).</li><li>Shah, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal+and+subconjunctival+melphalan+for+retinoblastoma+in+transgenic+mice.">Intravitreal and subconjunctival melphalan for retinoblastoma in transgenic mice.</a> Journal of Ophthalmology. 2014, 829879 (2014).</li><li>Dastjerdi, M. H., Sadrai, Z., Saban, D. R., Zhang, Q., Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+Penetration+of+Topical+and+Subconjunctival+Bevacizumab.">Corneal Penetration of Topical and Subconjunctival Bevacizumab.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 52 (12), 8718-8723 (2011).</li><li>Ezra-Elia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+an+in+vivo+imaging+system+be+used+to+determine+localization+and+biodistribution+of+AAV5-mediated+gene+expression+following+subretinal+and+intravitreal+delivery+in+mice.">Can an in vivo imaging system be used to determine localization and biodistribution of AAV5-mediated gene expression following subretinal and intravitreal delivery in mice.</a> Experimental Eye Research. 176, 227-234 (2018).</li><li>Movila, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+endoscopic+technology+for+real-time+monitoring+of+inflammation+caused+in+experimental+periodontitis.">Intravital endoscopic technology for real-time monitoring of inflammation caused in experimental periodontitis.</a> Journal of Immunological Methods. 457, 26-29 (2018).</li><li>Vanherp, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoscopic+fibered+confocal+fluorescence+microscopy+for+longitudinal+in+vivo+assessment+of+pulmonary+fungal+infections+in+free-breathing+mice.">Bronchoscopic fibered confocal fluorescence microscopy for longitudinal in vivo assessment of pulmonary fungal infections in free-breathing mice.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3009 (2018).</li><li>Chagnon, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+intravital+endoscopic+confocal+fluorescence+microscopy+of+normal+and+acutely+injured+rat+lungs.">In vivo intravital endoscopic confocal fluorescence microscopy of normal and acutely injured rat lungs.</a> Laboratory Investigation. 90 (6), 824-834 (2010).</li><li>Yun, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+near-infrared+fluorescence+conjugation+on+the+anti-cancer+potential+of+cetuximab.">The effect of near-infrared fluorescence conjugation on the anti-cancer potential of cetuximab.</a> Laboratory Animal Research. 34 (1), 30-36 (2018).</li></ol>

Come mostrato dai risultati, CLM fornisce un metodo semplice e fattibile per visualizzare la distribuzione oculare dei liposomi nell'occhio. In precedenza abbiamo dimostrato l'uso della LMC per caratterizzare la localizzazione di varie formulazioni liposomiali all'interno dell'occhio del topo nel tempo1. Per le applicazioni non invasive, CLM consente l'imaging in tempo reale della superficie oculare anteriore per approfondimenti su come i liposomi sono distribuiti nell'occhio dallo stesso animale....

La clearance del sangue, la distribuzione dei tessuti e l'occupazione target dei farmaci nei sistemi viventi sono pilastri per comprendere la disposizione dei farmaci in vivo. Nei modelli animali preclinici, questi parametri sono tipicamente valutati mediante frequenti campionamenti di sangue e tessuti in particolari momenti successivi alla somministrazione del farmaco. Tuttavia, queste procedure sono generalmente invasive, spesso includono misurazioni di non sopravvivenza e richiedono grandi coorti di animali per l'alimentazione statistica. Potrebbero esserci costi e tempi aggiuntivi sostenuti, insieme a preoccupazioni etiche per l'uso eccessivo di animali. Di conseguenza, l'imaging non invasivo sta rapidamente diventando un passo fondamentale negli studi di biodistribuzione. La microscopia laser confocale (CLM1,2) è adatta per applicazioni oculari per l'immagine non invasiva della distribuzione spazio-temporale delle terapie negli occhi di animali vivi ad alta sensibilità e alta risoluzione1,3,4.
Il CLM ha il potenziale per facilitare uno screening robusto dei sistemi di somministrazione oculare dei farmaci (DDS), come i liposomi, prima della quantificazione completa della DDS e della biodisponibilità dei farmaci. I liposomi sono attraenti per la loro flessibilità nel sintonizzare le loro proprietà fisico-chimiche e biofisiche5,6,7,8,9,10,11 per incapsulare una grande varietà di carico terapeutico e controllare il sito tissutale di rilascio del farmaco e la durata dell'azione. I liposomi sono stati utilizzati in applicazioni oculari per la somministrazione di grandi molecole, come l'anticorpo monoclonale bevacizumab12, e piccole molecole come la ciclosporina13 e il ganciclovir14. I liposomi caricati con farmaci hanno emivite biologiche più lunghe ed effetti terapeutici prolungati rispetto alle formulazioni "free drug" non liposomiali. Tuttavia, la distribuzione del farmaco nel tessuto oculare è tipicamente estrapolata dalle concentrazioni di farmaco nei componenti fluidi dell'occhio (cioè sangue, umore acqueo e umore vitreo15,16,17). Poiché il destino iniziale in vivo del carico di farmaci caricato è definito dalle proprietà del nanovettore stesso, l'imaging CLM dei liposomi fluorescenti può servire come surrogato del farmaco per rivelare il targeting dei tessuti e i tempi di permanenza dei tessuti in situ. Inoltre, l'evidenza visiva della somministrazione con CLM può guidare la riprogettazione della DDS, valutare i benefici terapeutici del farmaco e forse anche prevedere eventi biologici avversi (ad esempio, tossicità tissutale dovuta alla localizzazione indesiderata della DDS per periodi di tempo prolungati).
Qui, una procedura passo-passo è dettagliata su come studiare la biodistribuzione oculare dei liposomi in topi vivi con un sistema CLM a doppia banda. Questo specifico sistema CLM è in grado di rilevare la fluorescenza bicolore (con laser di eccitazione verde e rosso a 488 nm e 660 nm) in tempo reale, con una frequenza di 8 fotogrammi/s. Posizionando fisicamente la sonda di rilevamento sull'occhio, il protocollo dimostra l'acquisizione e l'analisi delle immagini dei liposomi verde-fluorescenti dopo somministrazione subcongiuntivale in topi pre-iniettati per via endovenosa (IV) con colorante Evans Blue (EB) al 2%. Il colorante EB aiuta a visualizzare le strutture vascolarizzate nel canale di fluorescenza rossa. Mostriamo risultati rappresentativi da uno studio che valuta i liposomi neutri a 100 nm composti dal fosfolipide POPC (cioè 1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina) e drogati con fosfolipide Fl-DHPE marcato con fluoresceina (cioè N-(fluoresceina-5-tiocarbamoil)-1,2-diesa-decanoil-glicero-glicero-3-fosfoetanolammina) con un rapporto del 95% POPC: 5% Fl-DHPE (Figura 1B ). CLM è in grado di catturare i liposomi verdi marcati con fluoresceina a 15 μm assiale e 3,30 μm di risoluzione laterale delineando i confini del tessuto oculare colorato con EB.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.08 &#181;m polycarbonate filter</td>
			<td>Whatman, USA</td>
			<td>110604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Fisherbrand, Ireland</td>
			<td>09-720-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution</td>
			<td>Alcon, Singapore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Glass Syringe</td>
			<td>Hamilton, USA</td>
			<td>65460-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti, USA</td>
			<td>850457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 G needle (Hamilton, 0.5&#8221; PT4)</td>
			<td>Hamilton, USA</td>
			<td>7803-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm)</td>
			<td>WPI, USA</td>
			<td>ATC 2000 &#38; 61800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5)</td>
			<td>Mauna Kea Technologies, France</td>
			<td></td>
			<td>Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 &#181;m x 500 &#181;m, axial resolution: 15 &#181;m, lateral resolution: 3.3 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>472476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers #5, Dumostar</td>
			<td>WPI, USA</td>
			<td>500233</td>
			<td>11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans Blue</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>E2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fusidic acid eye drop</td>
			<td>LEO Pharma, Denmark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Malvern Panalytical, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>179337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Extruder</td>
			<td>Avanti, USA</td>
			<td>610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE)</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>F362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope System with table clamp stand</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td>SZ51 &#38; SZ2-STU3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatio-temporal in vivo imaging of ocular drug delivery systems using fiberoptic confocal laser microendoscopy

L'iniezione subcongiuntivale è una via interessante per somministrare farmaci oculari a causa del facile accesso trans-sclerale che bypassa le barriere oculari anteriori, come la cornea e la congiuntiva. Mentre gli effetti terapeutici e la farmacocinetica dei farmaci dopo iniezione subcongiuntivale sono stati descritti in alcuni studi, pochissimi valutano la distribuzione oculare dei farmaci o dei sistemi di somministrazione dei farmaci (DDS). Quest'ultimo è fondamentale per l'ottimizzazione della progettazione della DDS intraoculare e della biodisponibilità del farmaco per ottenere la localizzazione oculare desiderata e la durata dell'azione (ad esempio, acuta contro prolungata). Questo studio stabilisce l'uso della microscopia laser confocale a fibre ottiche (CLM) per studiare qualitativamente la distribuzione oculare dei liposomi fluorescenti in tempo reale in topi vivi dopo iniezione sub-congiuntivale. Essendo progettato per l'ispezione visiva in vivo dei tessuti a livello microscopico, questa è anche la prima descrizione completa del metodo di imaging CLM per studiare la distribuzione spazio-temporale degli iniettabili nell'occhio dopo iniezione subcongiuntivale.

Il protocollo dimostra l'utilità della LMC per valutare la distribuzione oculare spazio-temporale dei liposomi fluorescenti verdi somministrati attraverso l'iniezione subcongiuntivale. Per sfruttare la capacità a doppio colore (lunghezze d'onda di eccitazione di 488 nm e 660 nm) del sistema CLM, i liposomi POPC neutri da 100 nm da iniettare sono stati drogati con il 5% di Fl-DHPE (i dati di composizione e caratterizzazione sono mostrati nella Figura 1B) e EB è stato iniettato IV per ident...

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Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

Presentiamo un protocollo per l'utilizzo della microscopia laser confocale a fibre ottiche (CLM) per studiare in modo non invasivo la distribuzione spazio-temporale dei liposomi nell'occhio dopo iniezione subcongiuntivale.

Imaging in vivo spazio-temporale di sistemi di somministrazione di farmaci oculari mediante microscopia laser confocale a fibre ottiche

Subconjunctival injection is an attractive route to administer ocular drugs due to easy trans-scleral access that bypasses anterior ocular barriers, such ...

Questo protocollo facilita lo screening di nuove formulazioni per comprendere meglio come le modifiche influenzano i loro tempi di permanenza dei tessuti, che è fondamentale nella progettazione di un sistema ottimale di somministrazione di farmaci. Questa tecnica non è invasiva e consente l'imaging in tempo reale, che riduce l'uso eccessivo di animali per il campionamento. I sistemi di somministrazione dei farmaci possono essere riprogettati per l'imaging e le applicazioni terapeutiche semplicemente includendo il farmaco terapeutico e la porzione di imaging in un unico nano-vettore.Questo ha applicazioni utili sia nel trattamento del cancro che delle malattie infettive. A dimostrare la procedura sarà Rasha Msallam, un ricercatore senior del mio laboratorio. Per cominciare, due ore prima dell'iniezione subcongiuntivale, iniettare il topo per via endovenosa tramite la coda con 2,5 milligrammi per chilogrammo di blu evans o EB. Dopo aver sedato il mouse con il 5% di isoflurano, trasferire il mouse su un cono nasale e mantenere il mouse sedato su una piastra riscaldante.Quindi, tagliare i baffi vicino all'occhio da iniettare. Instillare una goccia di soluzione di proxymetacaina cloridrato allo 0,5% direttamente sull'occhio. Quindi, caricare una siringa di vetro da 10 microlitri dotata di un ago calibro 32 con liposomi fluorescenti e assicurarsi che le bolle d'aria non siano presenti nella siringa.Usando una pinzetta, sollevare la congiuntiva e iniettare lentamente i liposomi nello spazio subcongiuntivale, quindi prelevare lentamente l'ago, impedendo il riflusso. Garantire la formazione di bleb pieni di liposomi fluorescenti. Somministrare una goccia di acido fusitico all'1% sull'occhio e monitorare il mouse fino a quando non riprende conoscenza.Accendere il sistema CLM. Collegare la sonda al sistema CLM. Scegli il campo visivo e la posizione per i file di acquisizione a questo punto.Regolare l'intensità del laser per garantire che il rilevamento della fluorescenza per la fluoresceina DHPE sia nell'intervallo lineare e mantenere l'intensità coerente per il confronto tra le immagini scattate in diversi punti temporali. Dopo che il sistema è stato riscaldato per 15 minuti, calibrare il sistema secondo le istruzioni del produttore utilizzando il kit di calibrazione contenente le soluzioni di pulizia, risciacquo e fluoro-4 per ciascun laser. In breve, iniziare a calibrare immergendo la punta per cinque secondi ciascuno nel flaconcino detergente e quindi nel flaconcino di risciacquo.Lasciare la punta in aria per la registrazione in background per normalizzare i valori di sfondo dalle diverse fibre delle sonde, garantendo l'uniformità dell'immagine. Ancora una volta, immergere la punta per cinque secondi nel flaconcino detergente e quindi nel flaconcino di risciacquo. Quindi, immergere la punta nel flaconcino contenente fluoro-4 488 nanometri per cinque secondi per normalizzare i valori del segnale.Ripetere l'immersione della punta per cinque secondi nel flaconcino detergente seguito dal flaconcino di risciacquo. Tenere la punta nel flaconcino di risciacquo fino a quando il segnale di fluorescenza registrato nel passaggio precedente scompare. Quindi, trasferire la punta nel flaconcino contenente fluoro-4 660 nanometri per normalizzare i valori del segnale da diverse fibre nella sonda.Dopo la calibrazione, assicurarsi che il valore sia inferiore a 100 per lo sfondo della sonda. Altrimenti, eseguire la pulizia ripetuta della sonda con un applicatore di punta di cotone. Accendere il regolatore di temperatura animale con una piastra riscaldante collegata e regolare la temperatura a 37 gradi Celsius.Dopo aver coperto la piastra riscaldante con un telo chirurgico, fissare il cono del naso sulla piastra riscaldante. Dopo aver sedato il mouse utilizzando il 5% di isoflurano in una camera di induzione, trasferire il mouse al cono del naso e mantenere il mouse sedato su una piastra riscaldante. Quindi, instillare una goccia di soluzione anestetica di proxymetacaina cloridrato allo 0,5% sull'occhio.Per lavare la superficie oculare ed evitare la cristallizzazione della lente, mantenere gli occhi lubrificati facendo cadere alcune gocce saline. Quindi, ruotare e regolare l'oculare del microscopio per visualizzare l'occhio del mouse in modo ergonomico nella messa a fuoco diretta a 0,67 volte l'ingrandimento. Accendere il laser e posizionare la sonda come una penna direttamente sulla regione dell'occhio da visualizzare.Quindi, inizia a registrare l'acquisizione per osservare la fluorescenza nell'occhio nella regione di interesse. Interrompere la registrazione quando tutte le regioni sono contrassegnate ed etichettate in base alla mappa oculare per conoscere l'esatta posizione della sonda nella cornice esatta. I file di acquisizione verranno salvati automaticamente come file video nella posizione precedentemente scelta.L'imaging a fluorescenza ha rivelato una netta differenziazione tra le regioni della sclera e della cornea. L'elevata vascolarizzazione dell'episclera e della congiuntiva ha causato la colorazione rossa della regione sclerale con EB. La cornea, che manca di vascolarizzazione, appariva nera. La fluorescenza di contrasto di limbus e sclera è stata osservata in uno studio di sette giorni.I topi di controllo iniettati con colorante fluoresceina hanno confermato la specificità della fluorescenza derivata dai liposomi. Le intensità di fluorescenza erano elevate il primo e il terzo giorno. La fluorescenza verde ha rappresentato nel tempo la riduzione del liposoma nelle regioni limbus e sclera.Le differenze nei segnali di fluorescenza dal primo giorno post-iniezione al terzo giorno nelle regioni del limbus temporale e del limbus superiore non erano significative, indicando la preferenza dei liposomi neutri per la regione del limbus, in particolare la periferia corneale. Per le regioni temporali e superiori al primo giorno post-iniezione, la fluorescenza nella sclera era sei volte superiore rispetto al limbus. Entro il terzo e il settimo giorno, i liposomi erano significativamente ridotti nella sclera nelle regioni temporali e superiori, attribuiti ai meccanismi di clearance oculare.La quantità più bassa di fluorescenza è stata rilevata nelle regioni nasali e inferiori, a causa della distanza dal sito di iniezione. È importante etichettare i fotogrammi fleck in base alla mappa oculare prima che la registrazione venga interrotta. Mantieni costante l'intensità del laser e definisci il valore di sfondo massimo per un confronto corretto tra diversi esperimenti.Dopo l'identificazione delle formulazioni di piombo, possono essere condotti studi completi di farmacocinetica e biodistribuzione negli animali per studiare la biodisponibilità del farmaco e convalidare l'efficacia terapeutica delle loro formulazioni.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

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Ad alta risoluzione in fibra ottica per Microendoscopy In situ Cellular Imaging

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Ricerca

Bioingegneria

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