Name: spatio-temporal in vivo imaging of ocular drug delivery systems using fiberoptic confocal laser microendoscopy
Uploaded: 2021-09-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy at JoVE.com

Denne forskningen ble finansiert av NTU-Northwestern Institute for Nanomedicine (NNIN) stipend tildelt (til SV) og delvis av Singapore National Research Foundation Grant AG/CIV/GC70-C/NRF/2013 /2 og Singapores helse- og biomedisinske vitenskap (HBMS) Industry Alignment Fund Pre-Positioning (IAF-PP) gir H18/01/a0/018 administrert av Agency for Science, Teknologi og forskning (A*STAR) (til AMC). Takk til medlemmer fra Duke-NUS Laboratory for Translational and Molecular Imaging (LTMI) for å legge til rette for logistikk og gjennomføring av studier og opplæring på utstyr. Spesiell takk til Ms. Wisna Novera for hennes redaksjonelle hjelp.

Alle metoder beskrevet her er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved SingHealth (Singapore). Kvinnelige C57BL/6 J-mus (6-8 uker gamle; 18-20 g) ble hentet fra InVivos, Singapore, og ligger i en temperatur og lyskontrollert vivarium av Duke-NUS Medical School, Singapore. Dyr ble behandlet i henhold til retningslinjene fra Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) uttalelse for bruk av dyr i oftalmisk og visjonsforskning.
MERK: Et flytskjema som fre...

<ol>
	<li>Chaw, S. Y., Novera, W., Chacko, A. -. M., Wong, T. T. L., Venkatraman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fate+of+liposomes+after+subconjunctival+ocular+delivery.">In vivo fate of liposomes after subconjunctival ocular delivery.</a> Journal of Controlled Release. 329, 162-174 (2021).</li><li>Kuo, J. C. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+colorectal+dysplasia+using+fluorescently+labelled+lectins.">Detection of colorectal dysplasia using fluorescently labelled lectins.</a> Scientific Reports. 6 (1), 24231 (2016).</li><li>Wu, Y. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+custom+multiphoton+microscopy+platform+for+live+imaging+of+mouse+cornea+and+conjunctiva.">A custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60944 (2020).</li><li>Zhivov, A., Stachs, O., Kraak, R., Stave, J., Guthoff, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+confocal+microscopy+of+the+ocular+surface.">In vivo confocal microscopy of the ocular surface.</a> The Ocular Surface. 4 (2), 81-93 (2006).</li><li>Bassyouni, F., ElHalwany, N., Ab del Rehim, M., Neyfeh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+new+technologies+applied+in+controlled+drug+delivery+system.">Advances and new technologies applied in controlled drug delivery system.</a> Research on Chemical Intermediates. 41 (4), 2165-2200 (2015).</li><li>Sercombe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+challenges+of+liposome+assisted+drug+delivery.">Advances and challenges of liposome assisted drug delivery.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, (2015).</li><li>Koning, G. A., Storm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+drug+delivery+systems+for+the+intracellular+delivery+of+macromolecular+drugs.">Targeted drug delivery systems for the intracellular delivery of macromolecular drugs.</a> Drug Discovery Today. 8 (11), 482-483 (2003).</li><li>Metselaar, J. M., Storm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+in+the+treatment+of+inflammatory+disorders.">Liposomes in the treatment of inflammatory disorders.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 2 (3), 465-476 (2005).</li><li>Ding, B. S., Dziubla, T., Shuvaev, V. V., Muro, S., Muzykantov, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+drug+delivery+systems+that+target+the+vascular+endothelium.">Advanced drug delivery systems that target the vascular endothelium.</a> Molecular Interventions. 6 (2), 98-112 (2006).</li><li>Hua, S., Wu, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+lipid-based+nanocarriers+for+targeted+pain+therapies.">The use of lipid-based nanocarriers for targeted pain therapies.</a> Frontiers in Pharmacology. 4, 143 (2013).</li><li>Sharma, A., Sharma, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+in+drug+delivery:+Progress+and+limitations.">Liposomes in drug delivery: Progress and limitations.</a> International Journal of Pharmaceutics. 154 (2), 123-140 (1997).</li><li>Abrishami, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+characterization,+and+in+vivo+evaluation+of+nanoliposomes-encapsulated+Bevacizumab+(Avastin)+for+intravitreal+administration.">Preparation, characterization, and in vivo evaluation of nanoliposomes-encapsulated Bevacizumab (Avastin) for intravitreal administration.</a> Retina. 29 (5), 699-703 (2009).</li><li>Pleyer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+absorption+of+cyclosporine+A+from+liposomes+incorporated+into+collagen+shields.">Ocular absorption of cyclosporine A from liposomes incorporated into collagen shields.</a> Current Eye Research. 13 (3), 177-181 (1994).</li><li>Shen, Y., Tu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+ocular+pharmacokinetics+of+ganciclovir+liposomes.">Preparation and ocular pharmacokinetics of ganciclovir liposomes.</a> The AAPS Journal. 9 (3), 371-377 (2007).</li><li>Weijtens, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concentration+of+dexamethasone+in+aqueous+and+vitreous+after+subconjunctival+injection.">High concentration of dexamethasone in aqueous and vitreous after subconjunctival injection.</a> American Journal of Ophthalmology. 128 (2), 192-197 (1999).</li><li>Voss, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+injectable+drug+delivery+system+for+subconjunctival+glaucoma+treatment.">Development of a novel injectable drug delivery system for subconjunctival glaucoma treatment.</a> Journal of Controlled Release. 214, 1-11 (2015).</li><li>Giarmoukakis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+nanoparticles+for+controlled+subconjunctival+delivery+of+latanoprost+acid:+In+vitro+and+in+vivo+evaluation.+Preliminary+results.">Biodegradable nanoparticles for controlled subconjunctival delivery of latanoprost acid: In vitro and in vivo evaluation. Preliminary results.</a> Experimental Eye Research. 112, 29-36 (2013).</li><li>Shah, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal+and+subconjunctival+melphalan+for+retinoblastoma+in+transgenic+mice.">Intravitreal and subconjunctival melphalan for retinoblastoma in transgenic mice.</a> Journal of Ophthalmology. 2014, 829879 (2014).</li><li>Dastjerdi, M. H., Sadrai, Z., Saban, D. R., Zhang, Q., Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+Penetration+of+Topical+and+Subconjunctival+Bevacizumab.">Corneal Penetration of Topical and Subconjunctival Bevacizumab.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 52 (12), 8718-8723 (2011).</li><li>Ezra-Elia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+an+in+vivo+imaging+system+be+used+to+determine+localization+and+biodistribution+of+AAV5-mediated+gene+expression+following+subretinal+and+intravitreal+delivery+in+mice.">Can an in vivo imaging system be used to determine localization and biodistribution of AAV5-mediated gene expression following subretinal and intravitreal delivery in mice.</a> Experimental Eye Research. 176, 227-234 (2018).</li><li>Movila, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+endoscopic+technology+for+real-time+monitoring+of+inflammation+caused+in+experimental+periodontitis.">Intravital endoscopic technology for real-time monitoring of inflammation caused in experimental periodontitis.</a> Journal of Immunological Methods. 457, 26-29 (2018).</li><li>Vanherp, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoscopic+fibered+confocal+fluorescence+microscopy+for+longitudinal+in+vivo+assessment+of+pulmonary+fungal+infections+in+free-breathing+mice.">Bronchoscopic fibered confocal fluorescence microscopy for longitudinal in vivo assessment of pulmonary fungal infections in free-breathing mice.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3009 (2018).</li><li>Chagnon, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+intravital+endoscopic+confocal+fluorescence+microscopy+of+normal+and+acutely+injured+rat+lungs.">In vivo intravital endoscopic confocal fluorescence microscopy of normal and acutely injured rat lungs.</a> Laboratory Investigation. 90 (6), 824-834 (2010).</li><li>Yun, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+near-infrared+fluorescence+conjugation+on+the+anti-cancer+potential+of+cetuximab.">The effect of near-infrared fluorescence conjugation on the anti-cancer potential of cetuximab.</a> Laboratory Animal Research. 34 (1), 30-36 (2018).</li></ol>

Som vist fra resultatene, gir CLM en enkel og gjennomførbar metode for å avbilde okulær fordeling av liposomer i øyet. Vi har tidligere demonstrert bruken av CLM for å karakterisere lokaliseringen av ulike liposomale formuleringer i museøyet over tid1. For ikke-invasive applikasjoner tillater CLM sanntidsavbildning av den fremre okulære overflaten for innsikt i hvordan liposomer fordeles i øyet fra samme dyr. Dette gjør CLM egnet for pre-screen nanocarrier /DDS før mer omfattende kvantif...

Blodklarering, vevsfordeling og målbelegg for legemidler i levende systemer er pilarer for å forstå in vivo narkotika disposisjon. I prekliniske dyremodeller vurderes disse parametrene vanligvis ved hyppig blod- og vevsprøvetaking på bestemte tidspunkter etter legemiddeladministrasjon. Imidlertid er disse prosedyrene generelt invasive, inkluderer ofte ikke-overlevelsesmålinger, og nødvendiggjør store dyrekohorter for statistisk kraft. Det kan være ekstra kostnader og tid påløpt, sammen med etiske bekymringer for overdreven bruk av dyr. Som et resultat blir ikke-invasiv avbildning raskt et integrert skritt i biodistribusjonsstudier. Confocal lasermikroendoskopi (CLM1,2) er velegnet for okulære applikasjoner for ikke-invasivt bilde den romlige-temporale fordelingen av terapeutiske stoffer i øynene til levende dyr med høy følsomhet og høy oppløsning1,3,4.
CLM har potensial til å legge til rette for robust screening av okulære legemiddelleveringssystemer (DDS), som liposomer, før omfattende kvantifisering av DDS og legemiddelbiotilgjengelighet. Liposomer er attraktive for deres fleksibilitet i å justere sine fysisk-kjemiske og biofysiske egenskaper5,6,7,8,9,10,11 for å innkapsle et stort utvalg av terapeutisk last og kontrollere vevsstedet for legemiddelfrigjøring og virkningsvarighet. Liposomer har blitt brukt i okulære applikasjoner for levering av store molekyler, som det monoklonale antistoffet bevacizumab12, og små molekyler som ciklosporin13 og ganciclovir14. Legemiddelbelastede liposomer har lengre biologiske halveringstider og langvarige terapeutiske effekter sammenlignet med ikke-liposomale "frie legemiddel" formuleringer. Imidlertid er narkotikafordeling i okulært vev vanligvis ekstrapolert fra legemiddelkonsentrasjoner i flytende komponenter i øyet (dvs. blod, vandig humor og glasslegemet humor15,16,17). Som den første in vivo skjebnen til den ladde narkotika lasten er definert av egenskapene til nanocarrier selv, CLM avbildning av fluorescerende liposomer kan tjene som en surrogat for stoffet for å avsløre vev målretting og in situ vev oppholdstider. Videre kan visuelle bevis på levering med CLM styre DDS-re-design, evaluere terapeutiske fordeler ved stoffet, og kanskje til og med forutsi negative biologiske hendelser (f.eks. vevstoksisitet på grunn av uønsket lokalisering av DDS i lengre perioder).
Heri er en trinnvis prosedyre detaljert om hvordan du studerer okulær biodistribusjon av liposomer hos levende mus med et dual-band CLM-system. Dette spesifikke CLM-systemet kan oppdage tofarget fluorescens (med grønne og røde eksitasjonslasere på 488 nm og 660 nm) i sanntid, med en frekvens på 8 bilder/s. Ved å fysisk plassere deteksjonssonden på øyet, demonstrerer protokollen bildeanskaffelse og analyse av grønn-fluorescerende liposomer ved underleverandøradministrasjon hos mus pre-injisert intravenøst (IV) med 2% Evans Blue (EB) fargestoff. EB-fargestoff bidrar til å visualisere de vaskulære strukturene i den røde fluorescenskanalen. Vi viser representative resultater fra en studie som vurderer 100 nm nøytrale liposomer sammensatt av fosfolipid POPC (dvs. 1-palmitoyl-2-oleoyl-glysero-3-fosfocholine) og dopet med fluoresceinmerket fosfolipid Fl-DHPE (dvs. N-(fluorescein-5-tiocarbamoyl)-1,2-dihexa-decanoylsn-glysero-3-fosfoetanolamin) med et forhold på 95% POPC: 5% Fl-DHPE (Figur 1B ). CLM er i stand til å fange de grønne fluorescein-taggede liposomene ved 15 μm aksial og 3,30 μm lateral oppløsning ved avgrensning av EB-farget okulære vevsgrenser.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.08 &#181;m polycarbonate filter</td>
			<td>Whatman, USA</td>
			<td>110604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Fisherbrand, Ireland</td>
			<td>09-720-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution</td>
			<td>Alcon, Singapore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Glass Syringe</td>
			<td>Hamilton, USA</td>
			<td>65460-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti, USA</td>
			<td>850457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 G needle (Hamilton, 0.5&#8221; PT4)</td>
			<td>Hamilton, USA</td>
			<td>7803-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm)</td>
			<td>WPI, USA</td>
			<td>ATC 2000 &#38; 61800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5)</td>
			<td>Mauna Kea Technologies, France</td>
			<td></td>
			<td>Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 &#181;m x 500 &#181;m, axial resolution: 15 &#181;m, lateral resolution: 3.3 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>472476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers #5, Dumostar</td>
			<td>WPI, USA</td>
			<td>500233</td>
			<td>11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans Blue</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>E2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fusidic acid eye drop</td>
			<td>LEO Pharma, Denmark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Malvern Panalytical, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>179337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Extruder</td>
			<td>Avanti, USA</td>
			<td>610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE)</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>F362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope System with table clamp stand</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td>SZ51 &#38; SZ2-STU3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatio-temporal in vivo imaging of ocular drug delivery systems using fiberoptic confocal laser microendoscopy

Subkonjunktival injeksjon er en attraktiv rute for å administrere okulære legemidler på grunn av enkel trans-scleral tilgang som omgår fremre okulære barrierer, som hornhinnen og konjunktivene. Mens terapeutiske effekter og farmakokinetikk av legemidler ved subkonjunktival injeksjon har blitt beskrevet i noen studier, svært få vurdere okulær distribusjon av narkotika eller narkotika levering systemer (DDS). Sistnevnte er kritisk for optimalisering av intraokulær DDS-design og legemiddelbiotilgjengelighet for å oppnå ønsket okulær lokalisering og virkningsvarighet (f.eks. akutt versus langvarig). Denne studien fastslår bruken av fiberoptisk konfomisk lasermikroendoskopi (CLM) for å kvalitativt studere okulær fordeling av fluorescerende liposomer i sanntid hos levende mus etter subkonjunktiv injeksjon. Å være designet for in vivo visuell inspeksjon av vev på mikroskopisk nivå, er dette også den første fullstendige beskrivelsen av CLM-avbildningsmetoden for å studere romlig-temporal fordeling av injeksjoner i øyet etter subkonjunktival injeksjon.

Protokollen demonstrerer nytten av CLM for å vurdere den romlige-temporale okulære fordelingen av grønne fluorescerende liposomer administrert gjennom subkonjunktival injeksjon. For å benytte seg av den doble fargekapasiteten (488 nm og 660 nm eksitasjonsbølgelengder) av CLM-systemet, ble 100 nm nøytrale POPC-liposomer som skulle injiseres dopet med 5% Fl-DHPE (komposisjons- og karakteriseringsdata vises i figur 1B), og EB ble injisert IV for å identifisere landemerker i øyet. Tilste...

Watch this Scientific Journal Video about Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy at JoVE.com

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

Vi presenterer en protokoll for bruk av fiberoptisk konfokal lasermikroendoskopi (CLM) for ikke-invasivt å studere den romlige-temporale fordelingen av liposomer i øyet etter subkonjunktiv injeksjon.

Spatio-Temporal In Vivo Imaging av okulære legemiddelleveringssystemer ved hjelp av fiberoptisk konfomisk lasermikroendoskopi

Subconjunctival injection is an attractive route to administer ocular drugs due to easy trans-scleral access that bypasses anterior ocular barriers, such ...

Denne protokollen legger til rette for screening av nye formuleringer for bedre å forstå hvordan modifikasjoner påvirker vevsboligtidene deres, noe som er avgjørende for å designe et optimalt legemiddelleveringssystem. Denne teknikken er ikke-invasiv og tillater sanntidsavbildning, noe som reduserer overdreven bruk av dyr til prøvetaking. Legemiddelleveringssystemer kan redesignes for avbildning og terapeutiske anvendelser ved ganske enkelt å inkludere det terapeutiske stoffet og avbildningsmoiety i en nanobærer.Dette har nyttige anvendelser i både behandling av kreft og smittsomme sykdommer. Å demonstrere prosedyren vil være Rasha Msallam, en seniorforsker fra laboratoriet mitt. Til å begynne med, to timer før subkonjunktiv injeksjon, injiser musen intravenøst via hale med 2,5 milligram per kilo Evans blå, eller EB. Etter å ha beroliget musen med 5% isofluran, overfør musen til en nesekegle og vedlikehold bedøvet mus på en varmepute.Trim deretter whiskers nær øyet som skal injiseres. Innpod en dråpe på 0,5% proxymetacaine hydrokloridoppløsning direkte på øyet. Deretter laster du en 10-mikroliter glasssprøyte utstyrt med en 32-gauge nål med fluorescerende liposomer og sørger for at luftboblene ikke er til stede i sprøyten.Bruk en pinsett, løft konjunktivene og injiser liposomer sakte i underleveranserommet, trekk deretter nålen sakte tilbake og forhindre tilbakestrømning. Sørg for dannelse av bleb fylt med fluorescerende liposomer. Administrer en 1% fusitisk syredråpe på øyet og overvåk musen til den gjenvinner bevisstheten.Slå på CLM-systemet. Koble sonden til CLM-systemet. Velg synsfelt og plassering for anskaffelsesfilene på dette tidspunktet.Juster laserintensiteten for å sikre at fluorescensdeteksjonen for fluorescein DHPE er i det lineære området, og hold intensiteten konsistent for sammenligning mellom bilder tatt på forskjellige tidspunkter. Når systemet er varmet opp i 15 minutter, kalibrerer du systemet i henhold til produsentens instruksjoner ved hjelp av kalibreringssettet som inneholder rense-, skylle- og fluor-4-løsningene for hver laser. Kort sagt, begynn å kalibrere ved å nedsenke spissen i fem sekunder hver i rensende hetteglass, og deretter i skylle hetteglasset.La spissen være i luften for bakgrunnsopptak for å normalisere bakgrunnsverdiene fra sondene forskjellige fibre, noe som sikrer bilde ensartethet. Igjen, senk spissen i fem sekunder i rensende hetteglass, og deretter i skylle hetteglasset. Senk deretter spissen ned i hetteglasset som inneholder fluor-4 488-nanometer i fem sekunder for å normalisere signalverdiene.Gjenta tuppens nedsenking i fem sekunder i hetteglasset med rensing etterfulgt av skylle hetteglasset. Hold spissen i skyllehette hetteglasset til fluorescenssignalet som er registrert i forrige trinn, forsvinner. Overfør deretter spissen i hetteglasset som inneholder fluor-4 660-nanometer for å normalisere signalverdier fra forskjellige fibre i sonden.Etter kalibrering må du sørge for at verdien er mindre enn 100 for sondens bakgrunn. Ellers utfør gjentatt rengjøring av sonden med en bomullsspissapplikator. Slå på dyretemperaturregulatoren med en vedlagt varmepute, og juster temperaturen til 37 grader Celsius.Etter å ha dekket varmeputen med en kirurgisk gardin, fest nesekjeglen på varmeputen. Etter å ha beroliget musen ved hjelp av 5% isofluran i et induksjonskammer, overfør musen til nesekjeglen og vedlikehold den bedøvede musen på en varmepute. Sett deretter en dråpe bedøvelsesmiddel 0,5% proxymetacaine hydrokloridoppløsning på øyet.For å vaske okulær overflate og unngå krystallisering av linsen, hold øynene smurt ved å slippe noen saltvannsdråper. Roter deretter og juster mikroskopets okular for å se museøyet ergonomisk i direkte fokus ved 0,67 ganger forstørrelse. Slå på laseren og plasser sonden som en penn direkte på øyeområdet som skal avbildes.Begynn deretter å registrere oppkjøp for å observere fluorescensen i øyet i interesseområdet. Stopp opptaket når alle regioner er flagget og merket i henhold til øyekartet for å vite den nøyaktige sondeplasseringen ved den nøyaktige rammen. Oppkjøpsfilene lagres automatisk som videofiler på plasseringen som tidligere ble valgt.Fluorescensavbildningen viste tydelig differensiering mellom sclera- og hornhinneområdene. Høy vaskularisering av episclera og konjunktiver fikk sclera-regionen til å flekke rødt med EB. Hornhinnen, som mangler vaskulatur, virket svart. Kontrastfluorescensen av limbus og sclera ble observert i syv-dagers studie.Fluorescein fargestoff-injiserte kontrollmus bekreftet spesifisiteten av liposom-avledet fluorescens. Fluorescensintensitetene var høye første og tredje dag. Grønn fluorescens proxied liposomet reduksjon i limbus og sclera regioner over tid.Forskjellene i fluorescenssignalene fra postinjeksjon dag en til dag tre ved temporal limbus og overlegne limbusregioner var ikke signifikante, noe som indikerer preferanse av nøytrale liposomer til limbussområdet, spesielt hornhinnen periferi. For de tidsmessige og overlegne områdene på postinjeksjonsdagen en, var fluorescensen i sclera seks ganger høyere enn i limbusen. Ved den tredje og syvende dagen ble liposomer betydelig redusert i sclera i de tidsmessige og overlegne områdene, tilskrevet okulære klaringsmekanismer.Den laveste mengden fluorescens ble oppdaget i nese- og dårligere områder, på grunn av avstanden fra injeksjonsstedet. Det er viktig å merke fleckrammene i henhold til øyekartet før opptaket stoppes. Hold laserintensiteten konsekvent, og definer den maksimale bakgrunnsverdien for riktig sammenligning på tvers av forskjellige eksperimenter.Etter identifisering av blyformuleringer kan omfattende farmakokinetiske og biodistribusjonsstudier hos dyr utføres for å studere stoffets biotilgjengelighet, og validere den terapeutiske effekten av formuleringene.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase aktivitet på subcellulære nivå og på Tidsskala sekunder i levende celler

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Egenrapportering Stillaser for 3-dimensjonal Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Modeller og metoder for å vurdere transport av Drug Delivery Systems Across Cellular Barrierer

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

En etikett-fri teknikk for rom-tid-Imaging av enkeltcelle Sekret

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

Multimodal Imaging og spektroskopi Fiber-bundle Microendoscopy plattform for ikke-invasiv,<em&gt; I Vivo</em&gt; Vevet analyse

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Produksjon og levering av legemidler Anvendelser av Silk Nanopartikler

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

Omfattende evaluering av effektiviteten og sikkerheten til morkaken målrettede narkotika-leveranser med tre komplementære metoder

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Forbereder proteinproduserende syntetiske celler ved hjelp av cellefrie bakterielle ekstrakter, liposomer og emulsjonsoverføring

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...