Name: spatio-temporal in vivo imaging of ocular drug delivery systems using fiberoptic confocal laser microendoscopy
Uploaded: 2021-09-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy at JoVE.com

Esta pesquisa foi financiada pelo NTU-Northwestern Institute for Nanomedicine (NNIN) granted (to SV) e em parte pela Fundação Nacional de Pesquisa de Cingapura Grant AG/CIV/GC70-C/NRF/2013/2013/2013/2013/2013/2013/2013/2013/2013/2 e Cingapura's Health and Biomedical Sciences (HBMS) Industry Alignment Fund (IAF-PP) concedeM H18/01/a0/018 administrado pela Agência de Ciência, Tecnologia e Pesquisa (A*STAR) (para AMC). Obrigado aos membros do Laboratório Duke-NUS de Imagem Translacional e Molecular (LTMI) por facilitar a logística e execução dos estudos e treinamentos em equipamentos. Agradecimentos especiais à Sra. Wisna Novera por sua assistência editorial.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da SingHealth (Cingapura). Camundongos C57BL/6 J femininos (6- 8 semanas de idade; 18-20 g) foram obtidos de InVivos, Cingapura, e alojados em um vivarium controlado pela temperatura e luz da Duke-NUS Medical School, em Cingapura. Os animais foram tratados de acordo com as diretrizes da Declaração da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) para o uso de animais em pesquisa oftalmológica e d...

<ol>
	<li>Chaw, S. Y., Novera, W., Chacko, A. -. M., Wong, T. T. L., Venkatraman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fate+of+liposomes+after+subconjunctival+ocular+delivery.">In vivo fate of liposomes after subconjunctival ocular delivery.</a> Journal of Controlled Release. 329, 162-174 (2021).</li><li>Kuo, J. C. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+colorectal+dysplasia+using+fluorescently+labelled+lectins.">Detection of colorectal dysplasia using fluorescently labelled lectins.</a> Scientific Reports. 6 (1), 24231 (2016).</li><li>Wu, Y. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+custom+multiphoton+microscopy+platform+for+live+imaging+of+mouse+cornea+and+conjunctiva.">A custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60944 (2020).</li><li>Zhivov, A., Stachs, O., Kraak, R., Stave, J., Guthoff, R. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+characterization,+and+in+vivo+evaluation+of+nanoliposomes-encapsulated+Bevacizumab+(Avastin)+for+intravitreal+administration.">Preparation, characterization, and in vivo evaluation of nanoliposomes-encapsulated Bevacizumab (Avastin) for intravitreal administration.</a> Retina. 29 (5), 699-703 (2009).</li><li>Pleyer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+absorption+of+cyclosporine+A+from+liposomes+incorporated+into+collagen+shields.">Ocular absorption of cyclosporine A from liposomes incorporated into collagen shields.</a> Current Eye Research. 13 (3), 177-181 (1994).</li><li>Shen, Y., Tu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+ocular+pharmacokinetics+of+ganciclovir+liposomes.">Preparation and ocular pharmacokinetics of ganciclovir liposomes.</a> The AAPS Journal. 9 (3), 371-377 (2007).</li><li>Weijtens, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concentration+of+dexamethasone+in+aqueous+and+vitreous+after+subconjunctival+injection.">High concentration of dexamethasone in aqueous and vitreous after subconjunctival injection.</a> American Journal of Ophthalmology. 128 (2), 192-197 (1999).</li><li>Voss, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+injectable+drug+delivery+system+for+subconjunctival+glaucoma+treatment.">Development of a novel injectable drug delivery system for subconjunctival glaucoma treatment.</a> Journal of Controlled Release. 214, 1-11 (2015).</li><li>Giarmoukakis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+nanoparticles+for+controlled+subconjunctival+delivery+of+latanoprost+acid:+In+vitro+and+in+vivo+evaluation.+Preliminary+results.">Biodegradable nanoparticles for controlled subconjunctival delivery of latanoprost acid: In vitro and in vivo evaluation. Preliminary results.</a> Experimental Eye Research. 112, 29-36 (2013).</li><li>Shah, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal+and+subconjunctival+melphalan+for+retinoblastoma+in+transgenic+mice.">Intravitreal and subconjunctival melphalan for retinoblastoma in transgenic mice.</a> Journal of Ophthalmology. 2014, 829879 (2014).</li><li>Dastjerdi, M. H., Sadrai, Z., Saban, D. R., Zhang, Q., Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+Penetration+of+Topical+and+Subconjunctival+Bevacizumab.">Corneal Penetration of Topical and Subconjunctival Bevacizumab.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 52 (12), 8718-8723 (2011).</li><li>Ezra-Elia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+an+in+vivo+imaging+system+be+used+to+determine+localization+and+biodistribution+of+AAV5-mediated+gene+expression+following+subretinal+and+intravitreal+delivery+in+mice.">Can an in vivo imaging system be used to determine localization and biodistribution of AAV5-mediated gene expression following subretinal and intravitreal delivery in mice.</a> Experimental Eye Research. 176, 227-234 (2018).</li><li>Movila, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+endoscopic+technology+for+real-time+monitoring+of+inflammation+caused+in+experimental+periodontitis.">Intravital endoscopic technology for real-time monitoring of inflammation caused in experimental periodontitis.</a> Journal of Immunological Methods. 457, 26-29 (2018).</li><li>Vanherp, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoscopic+fibered+confocal+fluorescence+microscopy+for+longitudinal+in+vivo+assessment+of+pulmonary+fungal+infections+in+free-breathing+mice.">Bronchoscopic fibered confocal fluorescence microscopy for longitudinal in vivo assessment of pulmonary fungal infections in free-breathing mice.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3009 (2018).</li><li>Chagnon, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+intravital+endoscopic+confocal+fluorescence+microscopy+of+normal+and+acutely+injured+rat+lungs.">In vivo intravital endoscopic confocal fluorescence microscopy of normal and acutely injured rat lungs.</a> Laboratory Investigation. 90 (6), 824-834 (2010).</li><li>Yun, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+near-infrared+fluorescence+conjugation+on+the+anti-cancer+potential+of+cetuximab.">The effect of near-infrared fluorescence conjugation on the anti-cancer potential of cetuximab.</a> Laboratory Animal Research. 34 (1), 30-36 (2018).</li></ol>

Como mostrado nos resultados, o CLM fornece um método simples e viável para a imagem da distribuição ocular de lipossomos no olho. Anteriormente, demonstramos o uso de CLM para caracterizar a localização de várias formulações liposômicas dentro do olho do rato ao longo do tempo1. Para aplicações não invasivas, o CLM permite imagens em tempo real da superfície ocular anterior para obter insights sobre como os lipossomos são distribuídos no olho do mesmo animal. Isso torna o CLM adeq...

A liberação de sangue, a distribuição de tecidos e a ocupação-alvo de drogas em sistemas vivos são pilares para a compreensão da disposição in vivo de drogas. Em modelos animais pré-clínicos, esses parâmetros são tipicamente avaliados por amostragem frequente de sangue e tecido em determinados pontos de tempo após a administração de medicamentos. No entanto, esses procedimentos são geralmente invasivos, muitas vezes incluem medidas de não sobrevivência, e exigem grandes coortes de animais para alimentação estatística. Pode haver custo extra e tempo incorridos, juntamente com preocupações éticas para o uso excessivo de animais. Como resultado, a imagem não invasiva está rapidamente se tornando um passo integral em estudos de biodistribuções. A microendoscopia a laser confocal (CLM1,2) é adequada para aplicações oculares para imagem não invasiva da distribuição espátula-temporal da terapêutica aos olhos de animais vivos com alta sensibilidade e alta resolução1,3,4.
A CLM tem o potencial de facilitar a triagem robusta de sistemas de entrega de medicamentos oculares (DDS), como lipossomos, antes da quantificação abrangente do DDS e da biodisponibilidade de medicamentos. Os lipossomos são atraentes por sua flexibilidade em ajustar suas propriedades físico-químicas e biofísicas5,6,7,8,9,10,11 para encapsular uma grande variedade de carga terapêutica e controlar o local tecidual de liberação de drogas e duração da ação. Lipossomos têm sido usados em aplicações oculares para a entrega de grandes moléculas, como o anticorpo monoclonal bevacizumab12, e pequenas moléculas como ciclosporina13 e ganciclovir14. Lipossomos carregados de drogas têm meias-vidas biológicas mais longas e efeitos terapêuticos prolongados em comparação com formulações não liposômicas de "droga livre". No entanto, a distribuição de drogas no tecido ocular é tipicamente extrapolada das concentrações de drogas em componentes fluidos do olho (ou seja, sangue, humor aquoso e humor vítreo15,16,17). Como o destino inicial in vivo da carga de droga carregada é definido pelas propriedades do próprio nanocarrier, a imagem CLM dos lipossomos fluorescentes pode servir como um substituto para a droga revelar o direcionamento tecidual e os tempos de residência do tecido in situ. Além disso, evidências visuais de entrega com CLM podem orientar o re-projeto do DDS, avaliar os benefícios terapêuticos da droga e talvez até prever eventos biológicos adversos (por exemplo, toxicidade tecidual devido à localização indesejável do DDS por períodos prolongados de tempo).
Aqui, um procedimento passo-a-passo é detalhado sobre como estudar a biodistribução ocular de lipossomos em ratos vivos com um sistema CLM de banda dupla. Este sistema CLM específico pode detectar fluorescência de duas cores (com lasers de excitação verde e vermelho a 488 nm e 660 nm) em tempo real, com uma frequência de 8 quadros/s. Ao colocar fisicamente a sonda de detecção no olho, o protocolo demonstra a aquisição de imagens e a análise de lipossomos verde-fluorescentes sobre a administração subconjuntiva em camundongos pré-injetados por via intravenosa (IV) com 2% de corante Evans Blue (EB). O corante EB ajuda a visualizar as estruturas vascularizadas no canal de fluorescência vermelha. Mostramos resultados representativos de um estudo que avalia lipossomos neutros de 100 nm compostos do POPC fosfolipídeo (ou seja, 1-palmitoyl-2-oleoyl-glicero-3-fosfocholina) e dopados com fluorescemina-tagged Fl-DHPE (i.e., N-(fluoresceína-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexa-decanoylsn-gliceo-3-fosfoethanolamina) a uma proporção de 95% de POPC: 5% Fl-DHPE (Figura 1B ). O CLM é capaz de capturar os lipossomos marcados por fluoresceína verde a 15 μm axial e 3,30 μm de resolução lateral por delineamento das fronteiras do tecido ocular manchados pelo EB.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.08 &#181;m polycarbonate filter</td>
			<td>Whatman, USA</td>
			<td>110604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Fisherbrand, Ireland</td>
			<td>09-720-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution</td>
			<td>Alcon, Singapore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Glass Syringe</td>
			<td>Hamilton, USA</td>
			<td>65460-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti, USA</td>
			<td>850457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 G needle (Hamilton, 0.5&#8221; PT4)</td>
			<td>Hamilton, USA</td>
			<td>7803-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm)</td>
			<td>WPI, USA</td>
			<td>ATC 2000 &#38; 61800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5)</td>
			<td>Mauna Kea Technologies, France</td>
			<td></td>
			<td>Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 &#181;m x 500 &#181;m, axial resolution: 15 &#181;m, lateral resolution: 3.3 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>472476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers #5, Dumostar</td>
			<td>WPI, USA</td>
			<td>500233</td>
			<td>11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans Blue</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>E2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fusidic acid eye drop</td>
			<td>LEO Pharma, Denmark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Malvern Panalytical, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>179337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Extruder</td>
			<td>Avanti, USA</td>
			<td>610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE)</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>F362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope System with table clamp stand</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td>SZ51 &#38; SZ2-STU3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatio-temporal in vivo imaging of ocular drug delivery systems using fiberoptic confocal laser microendoscopy

A injeção subconjuntiva é uma rota atraente para administrar drogas oculares devido ao fácil acesso trans-ecleral que contorna barreiras oculares anteriores, como a córnea e a conjuntiva. Embora os efeitos terapêuticos e a farmacocinética dos medicamentos após a injeção subconjuntível tenham sido descritos em alguns estudos, muito poucos avaliam a distribuição ocular de medicamentos ou sistemas de entrega de medicamentos (DDS). Este último é fundamental para a otimização do design intraocular de DDS e biodisponibilidade de medicamentos para alcançar a localização ocular desejada e duração da ação (por exemplo, aguda versus prolongada). Este estudo estabelece o uso de microendoscopia a laser confocal (CLM) para estudar qualitativamente a distribuição ocular de lipossomos fluorescentes em tempo real em camundongos vivos após injeção subconjuntiva. Sendo projetado para inspeção visual in vivo de tecidos no nível microscópico, esta também é a primeira descrição completa do método de imagem CLM para estudar a distribuição espátula-temporal de injetáveis no olho após injeção subconjunta.

O protocolo demonstra a utilidade da CLM para avaliar a distribuição ocular esposo-temporal de lipossomos fluorescentes verdes administrados através de injeção subconjuntival. Para fazer uso da capacidade de cor dupla (comprimentos de onda de excitação de 488 nm e 660 nm) do sistema CLM, lipossomos POPC neutros de 100 nm a serem injetados foram dopados com 5% de Fl-DHPE (dados de composição e caracterização são mostrados na Figura 1B), e o EB foi injetado IV para identificar marc...

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Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

Apresentamos um protocolo para o uso de microendoscopia a laser confocal (CLM) para estudar não invasivamente a distribuição espátula-temporal de lipossomos no olho após injeção subconjunta.

Espólio-Temporal Em Vivo Imagem de Sistemas de Entrega de Drogas Oculares usando Microendoscopia a laser confocal de fibra óptica

Subconjunctival injection is an attractive route to administer ocular drugs due to easy trans-scleral access that bypasses anterior ocular barriers, such ...

Este protocolo facilita a triagem de novas formulações para entender melhor como as modificações afetam seus tempos de residência tecidual, o que é fundamental na concepção de um sistema de entrega de medicamentos ideal. Esta técnica não é invasiva e permite imagens em tempo real, o que reduz o uso excessivo de animais para amostragem. Os sistemas de entrega de medicamentos podem ser redesenhados para imagens e aplicações terapêuticas, simplesmente incluindo a droga terapêutica e a moiety de imagem em um nano-portador.Isso tem aplicações úteis tanto no tratamento do câncer quanto da doença infecciosa. Demonstrando o procedimento será Rasha Msallam, pesquisadora sênior do meu laboratório. Para começar, duas horas antes da injeção subconjuntival, injete o mouse por via intravenosa via cauda com 2,5 miligramas por quilograma de azul Evans, ou EB. Depois de sedar o mouse com 5% de isoflurane, transfira o mouse para um cone de nariz e mantenha o rato sedado em uma almofada de aquecimento.Em seguida, corte os bigodes perto do olho para serem injetados. Incutir uma queda de 0,5% de solução de cloridrato de proxymetacaína diretamente no olho. Em seguida, carregue uma seringa de vidro de 10 microliter equipada com uma agulha de calibre 32 com lipossomos fluorescentes e certifique-se de que as bolhas de ar não estejam presentes na seringa.Usando uma pinça, levante a conjuntiva e injete lentamente lipossomos no espaço subconjuntivo, em seguida, retire a agulha lentamente, impedindo o fluxo de volta. Certifique-se da formação de bleb preenchido com lipossomos fluorescentes. Administre uma gota de ácido fusitic de 1% no olho e monitore o mouse até que ele recupere a consciência.Ligue o sistema CLM. Conecte a sonda ao sistema CLM. Escolha o campo de exibição e o local para os arquivos de aquisição neste momento.Ajuste a intensidade do laser para garantir que a detecção de fluorescência para fluoresceína DHPE esteja na faixa linear, e mantenha a intensidade consistente para comparação entre imagens tiradas em diferentes pontos de tempo. Depois que o sistema for aquecido por 15 minutos, calibrar o sistema de acordo com as instruções do fabricante usando o kit de calibração contendo as soluções de limpeza, lavagem e fluoro-4 para cada laser. Brevemente, comece a calibrar imergindo a ponta por cinco segundos cada um no frasco de limpeza e, em seguida, no frasco de lavagem.Deixe a ponta no ar para gravação de fundo para normalizar os valores de fundo das sondas diferentes fibras, garantindo uniformidade de imagem. Novamente, mergulhe a ponta por cinco segundos no frasco de limpeza e, em seguida, no frasco de lavagem. Em seguida, mergulhe a ponta no frasco contendo fluoro-4 488-nanômetro por cinco segundos para normalizar os valores do sinal.Repita a imersão da ponta por cinco segundos no frasco de limpeza seguido do frasco de lavagem. Mantenha a ponta no frasco de lavagem até que o sinal de fluorescência registrado na etapa anterior desapareça. Em seguida, transfira a ponta no frasco contendo fluoro-4 660 nanômetros para normalizar os valores do sinal de diferentes fibras da sonda.Após a calibração, certifique-se de que o valor seja inferior a 100 para o fundo da sonda. Caso contrário, realize a limpeza repetida da sonda com um aplicador de ponta de algodão. Ligue o controlador de temperatura animal com uma almofada de aquecimento anexada e ajuste a temperatura para 37 graus Celsius.Depois de cobrir a almofada de aquecimento com uma cortina cirúrgica, fixar o cone do nariz na almofada de aquecimento. Depois de sedar o rato usando 5% de isoflurane em uma câmara de indução, transfira o mouse para o cone do nariz e mantenha o mouse sedado em uma almofada de aquecimento. Em seguida, incutir uma gota de solução de hidrocloreto de hidrocloreto de hidrocloreto de proxymetacaína de 0,5% para o olho.Para lavar a superfície ocular e evitar a cristalização da lente, mantenha os olhos lubrificados soltando algumas gotas salinas. Em seguida, gire e ajuste a ocular do microscópio para ver o olho do mouse ergonomicamente no foco direto em 0,67 vezes a ampliação. Ligue o laser e coloque a sonda como uma caneta diretamente na região dos olhos a ser imagen.Em seguida, comece a registrar a aquisição para observar a fluorescência no olho na região de interesse. Pare a gravação quando todas as regiões estiverem sinalizadas e rotuladas de acordo com o mapa dos olhos para saber a localização exata da sonda no quadro exato. Os arquivos de aquisição serão salvos automaticamente como arquivos de vídeo no local escolhido anteriormente.A imagem de fluorescência revelou diferenciação distinta entre as regiões de esclera e córnea. A alta vascularização da episclera e conjuntiva fez com que a região da esclera manchasse o vermelho com EB. A córnea, que não tem vasculatura, parecia negra. A fluorescência de contraste de limbus e esclera foi observada em sete dias de estudo.Os camundongos de controle injetados por corante fluoresceína confirmaram a especificidade da fluorescência derivada de liposomos. As intensidades de fluorescência foram altas no primeiro e terceiro dias. A fluorescência verde proxiou a redução lipossosome nas regiões de limbus e esclera ao longo do tempo.As diferenças nos sinais de fluorescência do dia pós-injeção, do dia 1º ao terceiro dia, nas regiões de limbus temporais e membros superiores, não foram significativas, indicando preferência de lipossomos neutros à região do limbus, particularmente na periferia da córnea. Para as regiões temporais e superiores no primeiro dia pós-injeção, a fluorescência na esclera foi seis vezes maior do que no limbus. No terceiro e sétimo dia, os lipossomos foram significativamente reduzidos na esclera nas regiões temporais e superiores, atribuídas aos mecanismos de liberação ocular.A menor quantidade de fluorescência foi detectada nas regiões nasais e inferiores, devido à distância do local da injeção. É importante rotular as molduras de manchas de acordo com o mapa dos olhos antes que a gravação seja interrompida. Mantenha a intensidade do laser consistente e defina o valor máximo de fundo para comparação adequada em diferentes experimentos.Após a identificação de formulações de chumbo, estudos farmacocinéticos abrangentes e biodistribuição em animais podem ser conduzidos para estudar a biodisponibilidade da droga e validar a eficácia terapêutica de suas formulações.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

De alta resolução de fibra óptica para Microendoscopy In situ Celular imagem

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Bioengenharia

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Vídeo taxa de microscopia de varredura confocal e Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Espaço-Temporal Manipulação de Atividade GTPase Pequeno em nível subcelular e em escala de tempo de segundos em células vivas

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Andaimes auto-relato para cultura de células 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Modelos e Métodos para avaliar Transporte de Drug Delivery Systems através das barreiras celulares

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

A técnica de livre-Label para a imagem espaço-temporal do Secreções única célula

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

Multimodal Imaging and Platform microendoscopy Espectroscopia de fibra pacote para não-invasiva,<em&gt; In Vivo</em&gt; Análise Tissue

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Fabricação e entrega da droga Aplicações de seda Nanopartículas

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

Avaliação global da eficácia e segurança de entrega de droga Placenta-alvo usando três métodos complementares

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Preparando proteínas que produzem células sintéticas usando extratos bacterianos livres de células, liposomos e transferência de emulsão

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...