Name: spatio-temporal in vivo imaging of ocular drug delivery systems using fiberoptic confocal laser microendoscopy
Uploaded: 2021-09-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy at JoVE.com

Это исследование финансировалось грантом NTU-Северо-Западного института наномедицины (NNIN), присужденным (SV), и частично грантом Сингапурского национального исследовательского фонда AG / CIV / GC70-C / NRF / 2013/2 и грантом Сингапура по здравоохранению и биомедицинским наукам (HBMS) Industry Alignment Fund Pre-Positioning (IAF-PP) H18/01/a0/018, администрируемым Агентством по науке, технологиям и исследованиям (A*STAR) (для AMC). Спасибо членам Лаборатории трансляционной и молекулярной визуализации Duke-NUS (LTMI) за содействие логистике и проведению исследований и обучению на оборудовании. Особая благодарность г-же Висне Новере за ее редакционную помощь.

Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в SingHealth (Сингапур). Самки мышей C57BL/6 J (6-8 недель; 18-20 г) были получены из InVivos, Сингапур, и размещены в варии с контролируемой температурой и светом Медицинской школы Duke-NUS, Си?...

<ol>
	<li>Chaw, S. Y., Novera, W., Chacko, A. -. M., Wong, T. T. L., Venkatraman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fate+of+liposomes+after+subconjunctival+ocular+delivery.">In vivo fate of liposomes after subconjunctival ocular delivery.</a> Journal of Controlled Release. 329, 162-174 (2021).</li><li>Kuo, J. C. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+colorectal+dysplasia+using+fluorescently+labelled+lectins.">Detection of colorectal dysplasia using fluorescently labelled lectins.</a> Scientific Reports. 6 (1), 24231 (2016).</li><li>Wu, Y. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+custom+multiphoton+microscopy+platform+for+live+imaging+of+mouse+cornea+and+conjunctiva.">A custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60944 (2020).</li><li>Zhivov, A., Stachs, O., Kraak, R., Stave, J., Guthoff, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+confocal+microscopy+of+the+ocular+surface.">In vivo confocal microscopy of the ocular surface.</a> The Ocular Surface. 4 (2), 81-93 (2006).</li><li>Bassyouni, F., ElHalwany, N., Ab del Rehim, M., Neyfeh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+new+technologies+applied+in+controlled+drug+delivery+system.">Advances and new technologies applied in controlled drug delivery system.</a> Research on Chemical Intermediates. 41 (4), 2165-2200 (2015).</li><li>Sercombe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+challenges+of+liposome+assisted+drug+delivery.">Advances and challenges of liposome assisted drug delivery.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, (2015).</li><li>Koning, G. A., Storm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+drug+delivery+systems+for+the+intracellular+delivery+of+macromolecular+drugs.">Targeted drug delivery systems for the intracellular delivery of macromolecular drugs.</a> Drug Discovery Today. 8 (11), 482-483 (2003).</li><li>Metselaar, J. M., Storm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+in+the+treatment+of+inflammatory+disorders.">Liposomes in the treatment of inflammatory disorders.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 2 (3), 465-476 (2005).</li><li>Ding, B. S., Dziubla, T., Shuvaev, V. V., Muro, S., Muzykantov, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+drug+delivery+systems+that+target+the+vascular+endothelium.">Advanced drug delivery systems that target the vascular endothelium.</a> Molecular Interventions. 6 (2), 98-112 (2006).</li><li>Hua, S., Wu, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+lipid-based+nanocarriers+for+targeted+pain+therapies.">The use of lipid-based nanocarriers for targeted pain therapies.</a> Frontiers in Pharmacology. 4, 143 (2013).</li><li>Sharma, A., Sharma, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+in+drug+delivery:+Progress+and+limitations.">Liposomes in drug delivery: Progress and limitations.</a> International Journal of Pharmaceutics. 154 (2), 123-140 (1997).</li><li>Abrishami, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+characterization,+and+in+vivo+evaluation+of+nanoliposomes-encapsulated+Bevacizumab+(Avastin)+for+intravitreal+administration.">Preparation, characterization, and in vivo evaluation of nanoliposomes-encapsulated Bevacizumab (Avastin) for intravitreal administration.</a> Retina. 29 (5), 699-703 (2009).</li><li>Pleyer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+absorption+of+cyclosporine+A+from+liposomes+incorporated+into+collagen+shields.">Ocular absorption of cyclosporine A from liposomes incorporated into collagen shields.</a> Current Eye Research. 13 (3), 177-181 (1994).</li><li>Shen, Y., Tu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+ocular+pharmacokinetics+of+ganciclovir+liposomes.">Preparation and ocular pharmacokinetics of ganciclovir liposomes.</a> The AAPS Journal. 9 (3), 371-377 (2007).</li><li>Weijtens, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concentration+of+dexamethasone+in+aqueous+and+vitreous+after+subconjunctival+injection.">High concentration of dexamethasone in aqueous and vitreous after subconjunctival injection.</a> American Journal of Ophthalmology. 128 (2), 192-197 (1999).</li><li>Voss, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+injectable+drug+delivery+system+for+subconjunctival+glaucoma+treatment.">Development of a novel injectable drug delivery system for subconjunctival glaucoma treatment.</a> Journal of Controlled Release. 214, 1-11 (2015).</li><li>Giarmoukakis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+nanoparticles+for+controlled+subconjunctival+delivery+of+latanoprost+acid:+In+vitro+and+in+vivo+evaluation.+Preliminary+results.">Biodegradable nanoparticles for controlled subconjunctival delivery of latanoprost acid: In vitro and in vivo evaluation. Preliminary results.</a> Experimental Eye Research. 112, 29-36 (2013).</li><li>Shah, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal+and+subconjunctival+melphalan+for+retinoblastoma+in+transgenic+mice.">Intravitreal and subconjunctival melphalan for retinoblastoma in transgenic mice.</a> Journal of Ophthalmology. 2014, 829879 (2014).</li><li>Dastjerdi, M. H., Sadrai, Z., Saban, D. R., Zhang, Q., Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+Penetration+of+Topical+and+Subconjunctival+Bevacizumab.">Corneal Penetration of Topical and Subconjunctival Bevacizumab.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 52 (12), 8718-8723 (2011).</li><li>Ezra-Elia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+an+in+vivo+imaging+system+be+used+to+determine+localization+and+biodistribution+of+AAV5-mediated+gene+expression+following+subretinal+and+intravitreal+delivery+in+mice.">Can an in vivo imaging system be used to determine localization and biodistribution of AAV5-mediated gene expression following subretinal and intravitreal delivery in mice.</a> Experimental Eye Research. 176, 227-234 (2018).</li><li>Movila, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+endoscopic+technology+for+real-time+monitoring+of+inflammation+caused+in+experimental+periodontitis.">Intravital endoscopic technology for real-time monitoring of inflammation caused in experimental periodontitis.</a> Journal of Immunological Methods. 457, 26-29 (2018).</li><li>Vanherp, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoscopic+fibered+confocal+fluorescence+microscopy+for+longitudinal+in+vivo+assessment+of+pulmonary+fungal+infections+in+free-breathing+mice.">Bronchoscopic fibered confocal fluorescence microscopy for longitudinal in vivo assessment of pulmonary fungal infections in free-breathing mice.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3009 (2018).</li><li>Chagnon, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+intravital+endoscopic+confocal+fluorescence+microscopy+of+normal+and+acutely+injured+rat+lungs.">In vivo intravital endoscopic confocal fluorescence microscopy of normal and acutely injured rat lungs.</a> Laboratory Investigation. 90 (6), 824-834 (2010).</li><li>Yun, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+near-infrared+fluorescence+conjugation+on+the+anti-cancer+potential+of+cetuximab.">The effect of near-infrared fluorescence conjugation on the anti-cancer potential of cetuximab.</a> Laboratory Animal Research. 34 (1), 30-36 (2018).</li></ol>

Как показано из результатов, CLM предоставляет простой и осуществимый метод для изображения глазного распределения липосом в глазу. Ранее мы продемонстрировали использование CLM для характеристики локализации различных липосомальных составов в глазу мыши с течением времени1</...

Очищение крови, распределение тканей и целевое заполнение лекарств в живых системах являются столпами для понимания диспозиции лекарств in vivo. В доклинических моделях на животных эти параметры обычно оцениваются путем частого забора крови и тканей в определенные моменты времени после введения препарата. Тем не менее, эти процедуры, как правило, являются инвазивными, часто включают измерения невыявляемости и требуют больших когорт животных для статистического питания. Могут возникнуть дополнительные расходы и время, а также этические проблемы чрезмерного использования животных. В результате неинвазивная визуализация быстро становится неотъемлемым шагом в исследованиях биораспределения. Конфокальная лазерная микроэндоскопия (CLM1,2) хорошо подходит для глазных применений для неинвазивного изображения пространственно-временного распределения терапевтических средств в глазах живых животных с высокой чувствительностью и высоким разрешением1,3,4.
CLM обладает потенциалом для облегчения надежного скрининга систем доставки глазных лекарств (DDS), таких как липосомы, до всесторонней количественной оценки DDS и биодоступности лекарств. Липосомы привлекательны своей гибкостью в настройке своих физико-химических и биофизических свойств5,6,7,8,9,10,11 для инкапсуляции большого разнообразия терапевтического груза и контроля тканевого места высвобождения лекарственного средства и продолжительности действия. Липосомы использовались в глазных приложениях для доставки больших молекул, таких как моноклональное антитело бевацизумаб12, и малых молекул, таких как циклоспорин13 и ганцикловир14. Липосомы, нагруженные лекарственными средствами, имеют более длительные биологические периоды полураспада и длительные терапевтические эффекты по сравнению с нелипосомными составами «свободных лекарств». Однако распределение лекарственного средства в глазной ткани обычно экстраполируется из концентраций лекарственного средства в жидких компонентах глаза (т.е. крови, водной влаге и стекловидном теле15,16,17). Поскольку первоначальная судьба in vivo загруженного лекарственного груза определяется свойствами самого нанонесущего, CLM-визуализация флуоресцентных липосом может служить суррогатом для лекарственного средства, чтобы выявить нацеливание на ткань и время пребывания ткани in situ. Кроме того, визуальные доказательства доставки с CLM могут направлять редизайн DDS, оценивать терапевтические преимущества препарата и, возможно, даже прогнозировать неблагоприятные биологические события (например, токсичность тканей из-за нежелательной локализации DDS в течение длительных периодов времени).
Здесь подробно описана пошаговая процедура изучения глазного биораспределения липосом у живых мышей с двухдиапазонной системой CLM. Эта специальная система CLM может обнаруживать двухцветную флуоресценцию (с зелеными и красными лазерами возбуждения при 488 нм и 660 нм) в режиме реального времени с частотой 8 кадров / с. Физически помещая зонд обнаружения на глаз, протокол демонстрирует получение и анализ изображений зелено-флуоресцентных липосом при субконъюнктивальном введении у мышей, предварительно введенных внутривенно (IV) с 2% красителем Evans Blue (EB). Краситель EB помогает визуализировать васкуляризованные структуры в красном флуоресцентном канале. Мы показываем репрезентативные результаты исследования, оценивающего 100 нм нейтральных липосом, состоящих из фосфолипида POPC (т.е. 1-пальмитоил-2-олеоил-глицеро-3-фосфохолина) и легированных флуоресцеин-меченым фосфолипидом Fl-DHPE (т.е. N-(флуоресцеин-5-тиокарбамоил)-1,2-дигекса-деканоилсн-глицеро-3-фосфоэтаноламин) в соотношении 95% POPC: 5% Fl-DHPE (Рисунок 1B ). CLM способен захватывать зеленые флуоресцеин-меченые липосомы с осевым разрешением 15 мкм и боковым разрешением 3,30 мкм путем очерчивания границ глазной ткани, окрашенной EB.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.08 &#181;m polycarbonate filter</td>
			<td>Whatman, USA</td>
			<td>110604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Fisherbrand, Ireland</td>
			<td>09-720-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution</td>
			<td>Alcon, Singapore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Glass Syringe</td>
			<td>Hamilton, USA</td>
			<td>65460-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti, USA</td>
			<td>850457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 G needle (Hamilton, 0.5&#8221; PT4)</td>
			<td>Hamilton, USA</td>
			<td>7803-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm)</td>
			<td>WPI, USA</td>
			<td>ATC 2000 &#38; 61800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5)</td>
			<td>Mauna Kea Technologies, France</td>
			<td></td>
			<td>Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 &#181;m x 500 &#181;m, axial resolution: 15 &#181;m, lateral resolution: 3.3 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>472476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers #5, Dumostar</td>
			<td>WPI, USA</td>
			<td>500233</td>
			<td>11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans Blue</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>E2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fusidic acid eye drop</td>
			<td>LEO Pharma, Denmark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Malvern Panalytical, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>179337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Extruder</td>
			<td>Avanti, USA</td>
			<td>610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE)</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>F362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope System with table clamp stand</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td>SZ51 &#38; SZ2-STU3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatio-temporal in vivo imaging of ocular drug delivery systems using fiberoptic confocal laser microendoscopy

Субконъюнктивальная инъекция является привлекательным способом введения глазных препаратов из-за легкого транссклерального доступа, который обходит передние глазные барьеры, такие как роговица и конъюнктива. В то время как терапевтические эффекты и фармакокинетика лекарств при субконъюнктивальной инъекции были описаны в некоторых исследованиях, очень немногие оценивают глазное распределение лекарств или системы доставки лекарств (DDS). Последнее имеет решающее значение для оптимизации внутриглазной конструкции DDS и биодоступности препарата для достижения желаемой глазной локализации и продолжительности действия (например, острого и пролонгированного). Данное исследование устанавливает использование волоконно-оптической конфокальной лазерной микроэндоскопии (CLM) для качественного изучения глазного распределения флуоресцентных липосом в режиме реального времени у живых мышей после субконъюнктивальной инъекции. Будучи разработанным для визуального осмотра тканей in vivo на микроскопическом уровне, это также первое полное описание метода визуализации CLM для изучения пространственно-временного распределения инъекционных препаратов в глазу после субконъюнктивальной инъекции.

Протокол демонстрирует полезность CLM для оценки пространственно-временного глазного распределения зеленых флуоресцентных липосом, вводимых через субконъюнктивальную инъекцию. Чтобы использовать двухцветную способность (длины волн возбуждения 488 нм и 660 нм) системы CLM, 100 нм нейтральн?...

Watch this Scientific Journal Video about Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy at JoVE.com

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

Представлен протокол применения фиброоптической конфокальной лазерной микроскопии (КМЛМ) для неинвазивного изучения пространственно-временного распределения липосом в глазу после субконъюнктивальной инъекции.

Пространственно-временная визуализация in vivo систем доставки глазных лекарств с использованием волоконно-оптической конфокальной лазерной микроскопии

Subconjunctival injection is an attractive route to administer ocular drugs due to easy trans-scleral access that bypasses anterior ocular barriers, such ...

Этот протокол облегчает скрининг новых составов, чтобы лучше понять, как модификации влияют на время их пребывания в тканях, что имеет решающее значение для разработки оптимальной системы доставки лекарств. Этот метод является неинвазивным и позволяет получать изображения в режиме реального времени, что уменьшает чрезмерное использование животных для отбора проб. Системы доставки лекарств могут быть переработаны для визуализации и терапевтических применений путем простого включения терапевтического препарата и фрагмента визуализации в один наноноситель.Это имеет полезные применения как в лечении рака, так и в инфекционных заболеваниях. Продемонстрировать процедуру будет Раша Мсаллам, старший научный сотрудник моей лаборатории. Для начала, за два часа до субконъюнктивальной инъекции, введите мыши внутривенно через хвост с 2,5 миллиграммами на килограмм эвансовского синего, или ЭБ. После седации мыши 5% изофлураном перенесите мышь на носовой конус и выдержите седативную мышь на грелке.Затем обрежьте усы возле глаза, чтобы сделать инъекцию. Закапывают каплей 0,5% раствора проксиметакаина гидрохлорида непосредственно на глаз. Затем загрузите 10-микролитровый стеклянный шприц, оснащенный иглой 32-го калибра с флуоресцентными липосомами, и убедитесь, что пузырьки воздуха не присутствуют в шприце.Используя пинцет, поднимите конъюнктиву и медленно вводите липосомы в субконъюнктивальное пространство, затем медленно вынимайте иглу, предотвращая обратный поток. Обеспечивают образование блеба, заполненного флуоресцентными липосомами. Введите каплю 1% фузистой кислоты на глаз и следите за мышью, пока она не придет в сознание.Включите систему CLM. Подключите зонд к системе CLM. Выберите поле зрения и расположение для файлов сбора на этом этапе.Отрегулируйте интенсивность лазера, чтобы гарантировать, что обнаружение флуоресценции для флуоресцеина DHPE находится в линейном диапазоне, и сохраняйте интенсивность последовательной для сравнения между изображениями, сделанными в разные моменты времени. После того, как система прогреется в течение 15 минут, откалибруйте систему в соответствии с инструкциями производителя с помощью калибровочного комплекта, содержащего растворы для очистки, ополаскивания и фтор-4 для каждого лазера. Вкратце, начните калибровку, погружая наконечник на пять секунд каждый в очищающий флакон, а затем во флакон для полоскания.Оставьте наконечник в воздухе для фоновой записи, чтобы нормализовать фоновые значения от зондов различными волокнами, обеспечивая однородность изображения. Снова погрузите наконечник на пять секунд в очищающий флакон, а затем во флакон для полоскания. Далее погружают наконечник во флакон, содержащий фтор-4 488-нанометр, на пять секунд для нормализации значений сигнала.Повторите погружение наконечника на пять секунд в очищающий флакон с последующим промывочным флаконом. Держите наконечник во флаконе для промывки до тех пор, пока сигнал флуоресценции, записанный на предыдущем этапе, не исчезнет. Затем перенесите наконечник во флакон, содержащий фтор-4 660-нанометр для нормализации значений сигнала от разных волокон в зонде.После калибровки убедитесь, что значение фона зонда меньше 100. В противном случае выполните повторную очистку зонда с помощью аппликатора хлопкового наконечника. Включите регулятор температуры животных с прикрепленной грелкой и отрегулируйте температуру до 37 градусов по Цельсию.После покрытия грелки хирургической драпировкой закрепите носовой конус на грелке. После седации мыши с использованием 5% изофлурана в индукционной камере перенесите мышь к носовому конусу и выдерживайте седативную мышь на грелке. Затем закапывают в глаз каплю анестетика 0,5% раствора проксиметакаина гидрохлорида.Чтобы промыть глазную поверхность и избежать кристаллизации хрусталика, держите глаза смазанными, опуская несколько солевых капель. Затем поверните и отрегулируйте окуляр микроскопа, чтобы эргономично рассмотреть глаз мыши в прямом фокусе с увеличением в 0,67 раза. Включите лазер и поместите зонд, как ручку, непосредственно на область глаз для получения изображения.Затем начните записывать приобретение, чтобы наблюдать флуоресценцию в глазу в интересующей области. Остановите запись, когда все области будут помечены и помечены в соответствии с картой глаз, чтобы узнать точное местоположение зонда в точном кадре. Файлы получения будут автоматически сохранены как видеофайлы в ранее выбранном расположении.Флуоресцентная визуализация выявила четкую дифференциацию между областями склеры и роговицы. Высокая васкуляризация эписклер и конъюнктивы привела к тому, что область склеры окрашивалась в красный цвет с EB. Роговица, которой не хватает сосудистой системы, оказалась черной. Контрастная флуоресценция лимбуса и склеры наблюдалась в семидневном исследовании.Контрольные мыши, которым вводили флуоресцеиновый краситель, подтвердили специфичность флуоресценции, полученной из липосом. Интенсивность флуоресценции была высокой в первый и третий дни. Зеленая флуоресценция со временем способствовала уменьшению липосом в областях лимбуса и склеры.Различия в флуоресцентных сигналах с первого по третий день после инъекции в областях височного лимбуса и верхнего лимбуса не были значительными, что указывает на предпочтение нейтральных липосом области лимбуса, особенно периферии роговицы. Для височной и верхней областей в первый день после инъекции флуоресценция в склерах была в шесть раз выше, чем в лимбе. К третьему и седьмому дню липосомы были значительно снижены в склере в височной и верхней областях, что объясняется механизмами глазного клиренса.Наименьшее количество флуоресценции было обнаружено в носовой и нижней областях, из-за расстояния от места инъекции. Важно пометить рамки пятен в соответствии с картой глаз до остановки записи. Поддерживайте постоянную интенсивность лазера и определите максимальное фоновое значение для правильного сравнения в различных экспериментах.После идентификации свинцовых составов могут быть проведены комплексные фармакокинетические и биораспределения на животных для изучения биодоступности препарата и подтверждения терапевтической эффективности их составов.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Высокое разрешение Волоконно-оптические Microendoscopy для На месте Сотовые изображений

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Видео-курс сканирующей конфокальной микроскопии и Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Пространственно-временные манипуляции малых активность ГТФ на субклеточном уровне, и на шкале времени секунды в живых клетках

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Строительные леса Self-отчетности для 3-Dimensional культуре клеток

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Модели и методы для оценки Перевозка системам по наркотикам Доставка по клеточные барьеры

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Метку без Методика пространственно-временных изображений из одной клетки секрета

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

Мультимодальные и обработки изображений Спектроскопия Волоконно-расслоение Microendoscopy Платформа для неинвазивного,<em&gt; В Vivo</em&gt; Анализ тканей

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Производство и поставка снадобья Применение шелкового наночастицами

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

Всеобъемлющая оценка эффективности и безопасности препарата плаценты целевой доставки с помощью трех взаимодополняющих методов

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Подготовка белка Производство синтетических клеток с использованием клеток бесплатные бактериальные экстракты, липосомы и эмульсии передачи

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...