Name: spatio-temporal in vivo imaging of ocular drug delivery systems using fiberoptic confocal laser microendoscopy
Uploaded: 2021-09-27T14:00:00
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Esta investigación fue financiada por la subvención del NTU-Northwestern Institute for Nanomedicine (NNIN) otorgada (a SV) y en parte por la subvención AG/CIV/GC70-C/NRF/2013/2 de Singapur y la subvención H18/01/018 del Fondo de Alineación de la Industria de Ciencias Biomédicas y de la Salud (HBMS) de Singapur (IAF-PP) H18/01/a0/018 administrada por la Agencia de Ciencia, Tecnología e Investigación (A*STAR) (a AMC). Gracias a los miembros del Duke-NUS Laboratory for Translational and Molecular Imaging (LTMI) por facilitar la logística y ejecución de los estudios y la formación sobre equipos. Un agradecimiento especial a la Sra. Wisna Novera por su asistencia editorial.

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en SingHealth (Singapur). Los ratones hembra C57BL / 6 J (6-8 semanas de edad; 18-20 g) se obtuvieron de InVivos, Singapur, y se alojaron en un vivero de temperatura y luz controlada de la Escuela de Medicina Duke-NUS, Singapur. Los animales fueron tratados de acuerdo con las directrices de la declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) para el uso de animales...

<ol>
	<li>Chaw, S. Y., Novera, W., Chacko, A. -. M., Wong, T. T. L., Venkatraman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fate+of+liposomes+after+subconjunctival+ocular+delivery.">In vivo fate of liposomes after subconjunctival ocular delivery.</a> Journal of Controlled Release. 329, 162-174 (2021).</li><li>Kuo, J. C. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+colorectal+dysplasia+using+fluorescently+labelled+lectins.">Detection of colorectal dysplasia using fluorescently labelled lectins.</a> Scientific Reports. 6 (1), 24231 (2016).</li><li>Wu, Y. -. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+in+drug+delivery:+Progress+and+limitations.">Liposomes in drug delivery: Progress and limitations.</a> International Journal of Pharmaceutics. 154 (2), 123-140 (1997).</li><li>Abrishami, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+characterization,+and+in+vivo+evaluation+of+nanoliposomes-encapsulated+Bevacizumab+(Avastin)+for+intravitreal+administration.">Preparation, characterization, and in vivo evaluation of nanoliposomes-encapsulated Bevacizumab (Avastin) for intravitreal administration.</a> Retina. 29 (5), 699-703 (2009).</li><li>Pleyer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+absorption+of+cyclosporine+A+from+liposomes+incorporated+into+collagen+shields.">Ocular absorption of cyclosporine A from liposomes incorporated into collagen shields.</a> Current Eye Research. 13 (3), 177-181 (1994).</li><li>Shen, Y., Tu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+ocular+pharmacokinetics+of+ganciclovir+liposomes.">Preparation and ocular pharmacokinetics of ganciclovir liposomes.</a> The AAPS Journal. 9 (3), 371-377 (2007).</li><li>Weijtens, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concentration+of+dexamethasone+in+aqueous+and+vitreous+after+subconjunctival+injection.">High concentration of dexamethasone in aqueous and vitreous after subconjunctival injection.</a> American Journal of Ophthalmology. 128 (2), 192-197 (1999).</li><li>Voss, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+injectable+drug+delivery+system+for+subconjunctival+glaucoma+treatment.">Development of a novel injectable drug delivery system for subconjunctival glaucoma treatment.</a> Journal of Controlled Release. 214, 1-11 (2015).</li><li>Giarmoukakis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+nanoparticles+for+controlled+subconjunctival+delivery+of+latanoprost+acid:+In+vitro+and+in+vivo+evaluation.+Preliminary+results.">Biodegradable nanoparticles for controlled subconjunctival delivery of latanoprost acid: In vitro and in vivo evaluation. Preliminary results.</a> Experimental Eye Research. 112, 29-36 (2013).</li><li>Shah, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal+and+subconjunctival+melphalan+for+retinoblastoma+in+transgenic+mice.">Intravitreal and subconjunctival melphalan for retinoblastoma in transgenic mice.</a> Journal of Ophthalmology. 2014, 829879 (2014).</li><li>Dastjerdi, M. H., Sadrai, Z., Saban, D. R., Zhang, Q., Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+Penetration+of+Topical+and+Subconjunctival+Bevacizumab.">Corneal Penetration of Topical and Subconjunctival Bevacizumab.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 52 (12), 8718-8723 (2011).</li><li>Ezra-Elia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+an+in+vivo+imaging+system+be+used+to+determine+localization+and+biodistribution+of+AAV5-mediated+gene+expression+following+subretinal+and+intravitreal+delivery+in+mice.">Can an in vivo imaging system be used to determine localization and biodistribution of AAV5-mediated gene expression following subretinal and intravitreal delivery in mice.</a> Experimental Eye Research. 176, 227-234 (2018).</li><li>Movila, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+endoscopic+technology+for+real-time+monitoring+of+inflammation+caused+in+experimental+periodontitis.">Intravital endoscopic technology for real-time monitoring of inflammation caused in experimental periodontitis.</a> Journal of Immunological Methods. 457, 26-29 (2018).</li><li>Vanherp, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoscopic+fibered+confocal+fluorescence+microscopy+for+longitudinal+in+vivo+assessment+of+pulmonary+fungal+infections+in+free-breathing+mice.">Bronchoscopic fibered confocal fluorescence microscopy for longitudinal in vivo assessment of pulmonary fungal infections in free-breathing mice.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3009 (2018).</li><li>Chagnon, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+intravital+endoscopic+confocal+fluorescence+microscopy+of+normal+and+acutely+injured+rat+lungs.">In vivo intravital endoscopic confocal fluorescence microscopy of normal and acutely injured rat lungs.</a> Laboratory Investigation. 90 (6), 824-834 (2010).</li><li>Yun, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+near-infrared+fluorescence+conjugation+on+the+anti-cancer+potential+of+cetuximab.">The effect of near-infrared fluorescence conjugation on the anti-cancer potential of cetuximab.</a> Laboratory Animal Research. 34 (1), 30-36 (2018).</li></ol>

Como se muestra en los resultados, CLM proporciona un método simple y factible para obtener imágenes de la distribución ocular de los liposomas en el ojo. Anteriormente demostramos el uso de CLM para caracterizar la localización de diversas formulaciones liposomales dentro del ojo de ratón a lo largo del tiempo1. Para aplicaciones no invasivas, CLM permite obtener imágenes en tiempo real de la superficie ocular anterior para obtener información sobre cómo se distribuyen los liposomas en el...

El aclaramiento sanguíneo, la distribución tisular y la ocupación objetivo de los medicamentos en los sistemas vivos son pilares para comprender la disposición in vivo de los medicamentos. En modelos animales preclínicos, estos parámetros generalmente se evalúan mediante muestreos frecuentes de sangre y tejidos en puntos de tiempo particulares después de la administración del medicamento. Sin embargo, estos procedimientos son generalmente invasivos, a menudo incluyen mediciones de no supervivencia y requieren grandes cohortes de animales para la potencia estadística. Puede haber costos y tiempo adicionales incurridos, junto con preocupaciones éticas por el uso excesivo de animales. Como resultado, las imágenes no invasivas se están convirtiendo rápidamente en un paso integral en los estudios de biodistribuciones. La microendoscopía láser confocal (CLM1,2) es adecuada para aplicaciones oculares para obtener imágenes no invasivas de la distribución espacio-temporal de la terapéutica en los ojos de animales vivos con alta sensibilidad y alta resolución1,3,4.
CLM tiene el potencial de facilitar la detección robusta de los sistemas oculares de administración de fármacos (DDS), como los liposomas, antes de la cuantificación integral del DDS y la biodisponibilidad del fármaco. Los liposomas son atractivos por su flexibilidad para ajustar sus propiedades fisicoquímicas y biofísicas5,6,7,8,9,10,11 para encapsular una gran variedad de carga terapéutica y controlar el sitio tisular de liberación del fármaco y la duración de la acción. Los liposomas se han utilizado en aplicaciones oculares para la entrega de moléculas grandes, como el anticuerpo monoclonal bevacizumab12, y moléculas pequeñas como ciclosporina13 y ganciclovir14. Los liposomas cargados de fármacos tienen vidas medias biológicas más largas y efectos terapéuticos prolongados en comparación con las formulaciones de "fármacos libres" no liposomales. Sin embargo, la distribución de fármacos en el tejido ocular se extrapola típicamente a partir de las concentraciones de fármacos en los componentes fluidos del ojo (es decir, sangre, humor acuoso y humor vítreo15,16,17). Como el destino inicial in vivo de la carga de medicamentos cargada se define por las propiedades del propio nanoportador, las imágenes CLM de los liposomas fluorescentes pueden servir como sustitutos para que el medicamento revele la orientación del tejido y los tiempos de residencia del tejido in situ. Además, la evidencia visual de la administración con CLM puede dirigir el rediseño de DDS, evaluar los beneficios terapéuticos del fármaco y tal vez incluso predecir eventos biológicos adversos (por ejemplo, toxicidad tisular debido a la localización indeseable de DDS durante períodos prolongados de tiempo).
Aquí, se detalla un procedimiento paso a paso sobre cómo estudiar la biodistribución ocular de liposomas en ratones vivos con un sistema CLM de doble banda. Este sistema CLM específico puede detectar fluorescencia bicolor (con láseres de excitación verde y rojo a 488 nm y 660 nm) en tiempo real, con una frecuencia de 8 fotogramas/s. Al colocar físicamente la sonda de detección en el ojo, el protocolo demuestra la adquisición de imágenes y el análisis de liposomas verde-fluorescentes tras la administración subconjuntival en ratones preinyectados por vía intravenosa (IV) con colorante Azul evans (EB) al 2%. El tinte EB ayuda a visualizar las estructuras vascularizadas en el canal de fluorescencia roja. Mostramos resultados representativos de un estudio que evaluó liposomas neutros de 100 nm compuestos por el fosfolípido POPC (es decir, 1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina) y dopados con fosfolípido fl-DHPE marcado con fluoresceína (es decir, N-(fluoresceína-5-tiocarbamoil)-1,2-dihexa-decanoilsn-glicero-3-fosfoetanolamina) en una proporción de 95% POPC: 5% Fl-DHPE (Figura 1B ). CLM es capaz de capturar los liposomas marcados con fluoresceína verde a una resolución axial de 15 μm y lateral de 3,30 μm mediante la delineación de los límites del tejido ocular teñido con EB.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.08 &#181;m polycarbonate filter</td>
			<td>Whatman, USA</td>
			<td>110604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Fisherbrand, Ireland</td>
			<td>09-720-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution</td>
			<td>Alcon, Singapore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Glass Syringe</td>
			<td>Hamilton, USA</td>
			<td>65460-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti, USA</td>
			<td>850457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 G needle (Hamilton, 0.5&#8221; PT4)</td>
			<td>Hamilton, USA</td>
			<td>7803-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm)</td>
			<td>WPI, USA</td>
			<td>ATC 2000 &#38; 61800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5)</td>
			<td>Mauna Kea Technologies, France</td>
			<td></td>
			<td>Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 &#181;m x 500 &#181;m, axial resolution: 15 &#181;m, lateral resolution: 3.3 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>472476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers #5, Dumostar</td>
			<td>WPI, USA</td>
			<td>500233</td>
			<td>11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans Blue</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>E2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fusidic acid eye drop</td>
			<td>LEO Pharma, Denmark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Malvern Panalytical, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>179337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Extruder</td>
			<td>Avanti, USA</td>
			<td>610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE)</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>F362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope System with table clamp stand</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td>SZ51 &#38; SZ2-STU3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatio-temporal in vivo imaging of ocular drug delivery systems using fiberoptic confocal laser microendoscopy

La inyección subconjuntival es una vía atractiva para administrar fármacos oculares debido al fácil acceso transescleral que evita las barreras oculares anteriores, como la córnea y la conjuntiva. Si bien los efectos terapéuticos y la farmacocinética de los fármacos tras la inyección subconjuntival se han descrito en algunos estudios, muy pocos evalúan la distribución ocular de los fármacos o los sistemas de administración de fármacos (DDS). Este último es crítico para la optimización del diseño de DDS intraocular y la biodisponibilidad del fármaco para lograr la localización ocular deseada y la duración de la acción (por ejemplo, aguda versus prolongada). Este estudio establece el uso de la microendoscopía láser confocal de fibra óptica (LMC) para estudiar cualitativamente la distribución ocular de liposomas fluorescentes en tiempo real en ratones vivos después de la inyección subconjuntival. Al estar diseñado para la inspección visual in vivo de tejidos a nivel microscópico, esta es también la primera descripción completa del método de imágenes CLM para estudiar la distribución espacio-temporal de inyectables en el ojo después de la inyección subconjuntival.

El protocolo demuestra la utilidad de CLM para evaluar la distribución ocular espacio-temporal de liposomas fluorescentes verdes administrados a través de inyección subconjuntival. Para hacer uso de la capacidad de doble color (longitudes de onda de excitación de 488 nm y 660 nm) del sistema CLM, los liposomas POPC neutros de 100 nm que se inyectaron se doparon con 5% de Fl-DHPE (los datos de composición y caracterización se muestran en la Figura 1B), y EB se inyectó IV para identific...

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Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

Presentamos un protocolo para el uso de la microendoscopía láser confocal de fibra óptica (LMC) para estudiar de forma no invasiva la distribución espacio-temporal de los liposomas en el ojo tras la inyección subconjuntival.

Imágenes espacio-temporales in vivo de sistemas oculares de administración de fármacos mediante microendoscopía láser confocal de fibra óptica

Subconjunctival injection is an attractive route to administer ocular drugs due to easy trans-scleral access that bypasses anterior ocular barriers, such ...

Este protocolo facilita la detección de nuevas formulaciones para comprender mejor cómo las modificaciones afectan sus tiempos de residencia en los tejidos, lo cual es fundamental para diseñar un sistema óptimo de administración de fármacos. Esta técnica no es invasiva y permite la obtención de imágenes en tiempo real, lo que reduce el uso excesivo de animales para el muestreo. Los sistemas de administración de fármacos se pueden rediseñar para aplicaciones terapéuticas y de imágenes simplemente incluyendo el fármaco terapéutico y la fracción de imágenes en un nanoportador.Esto tiene aplicaciones útiles tanto en el tratamiento del cáncer como en las enfermedades infecciosas. Demostrando el procedimiento estará Rasha Msallam, investigadora principal de mi laboratorio. Para empezar, dos horas antes de la inyección subconjuntival, inyecte al ratón por vía intravenosa a través de la cola con 2,5 miligramos por kilogramo de azul de Evans o EB. Después de sedar el ratón con 5% de isoflurano, transfiera el ratón a un cono nasal y mantenga el ratón sedado en una almohadilla térmica.Luego, recorte los bigotes cerca del ojo para inyectarse. Instila una gota de solución de clorhidrato de proxymetacaína al 0,5% directamente en el ojo. A continuación, cargue una jeringa de vidrio de 10 microlitros equipada con una aguja de calibre 32 con liposomas fluorescentes y asegúrese de que las burbujas de aire no estén presentes en la jeringa.Con una pinza, levante la conjuntiva e inyecte lentamente liposomas en el espacio subconjuntival, luego retire la aguja lentamente, evitando el flujo de regreso. Asegurar la formación de ampollas llenas de liposomas fluorescentes. Administre una gota de ácido fusítico al 1% en el ojo y controle al ratón hasta que recupere la conciencia.Encienda el sistema CLM. Conecte la sonda al sistema CLM. Elija el campo de visión y la ubicación de los archivos de adquisición en este punto.Ajuste la intensidad del láser para asegurarse de que la detección de fluorescencia para fluoresceína DHPE esté en el rango lineal y mantenga la intensidad consistente para la comparación entre imágenes tomadas en diferentes puntos de tiempo. Después de calentar el sistema durante 15 minutos, calibre el sistema de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando el kit de calibración que contiene las soluciones de limpieza, enjuague y fluoro-4 para cada láser. Brevemente, comience a calibrar sumergiendo la punta durante cinco segundos cada uno en el vial de limpieza y luego en el vial de enjuague.Deje la punta en el aire para la grabación de fondo para normalizar los valores de fondo de las diferentes fibras de las sondas, asegurando la uniformidad de la imagen. Nuevamente, sumerja la punta durante cinco segundos en el vial de limpieza y luego en el vial de enjuague. A continuación, sumerja la punta en el vial que contiene fluoro-4 de 488 nanómetros durante cinco segundos para normalizar los valores de la señal.Repita la inmersión de la punta durante cinco segundos en el vial de limpieza seguido del vial de enjuague. Mantenga la punta en el vial de enjuague hasta que desaparezca la señal de fluorescencia registrada en el paso anterior. Luego, transfiera la punta en el vial que contiene fluoro-4 de 660 nanómetros para normalizar los valores de señal de diferentes fibras en la sonda.Después de la calibración, asegúrese de que el valor sea inferior a 100 para el fondo de la sonda. De lo contrario, realice una limpieza repetida de la sonda con un aplicador de punta de algodón. Encienda el controlador de temperatura animal con una almohadilla térmica conectada y ajuste la temperatura a 37 grados centígrados.Después de cubrir la almohadilla térmica con una cortina quirúrgica, fije el cono nasal en la almohadilla térmica. Después de sedar el ratón con 5% de isoflurano en una cámara de inducción, transfiera el ratón al cono de la nariz y mantenga el ratón sedado en una almohadilla térmica. Luego, inscriba una gota de solución anestésica de clorhidrato de proxymetacaína al 0,5% en el ojo.Para lavar la superficie ocular y evitar la cristalización del cristalino, mantenga los ojos lubricados dejando caer unas gotas de solución salina. Luego, gire y ajuste el ocular del microscopio para ver el ojo del mouse ergonómicamente en el enfoque directo a un aumento de 0.67 veces. Encienda el láser y coloque la sonda como un bolígrafo directamente sobre la región del ojo para obtener la imagen.Luego, comience a registrar la adquisición para observar la fluorescencia en el ojo en la región de interés. Detenga la grabación cuando todas las regiones estén marcadas y etiquetadas de acuerdo con el mapa ocular para conocer la ubicación exacta de la sonda en el marco exacto. Los archivos de adquisición se guardarán automáticamente como archivos de vídeo en la ubicación previamente elegida.Las imágenes de fluorescencia revelaron una clara diferenciación entre las regiones de la esclerótica y la córnea. La alta vascularización de la epiesclera y la conjuntiva hizo que la región de la esclerótica se tiñera de rojo con EB. La córnea, que carece de vasculatura, parecía negra. La fluorescencia contrastante del limbo y la esclerótica se observó en un estudio de siete días.Los ratones de control inyectados con colorante de fluoresceína confirmaron la especificidad de la fluorescencia derivada de liposomas. Las intensidades de fluorescencia fueron altas en el primer y tercer día. La fluorescencia verde representó la reducción de liposomas en las regiones del limbo y la esclerótica a lo largo del tiempo.Las diferencias en las señales de fluorescencia del día uno al día tres después de la inyección en las regiones del limbo temporal y del limbo superior no fueron significativas, lo que indica la preferencia de los liposomas neutros a la región del limbo, particularmente la periferia corneal. Para las regiones temporal y superior en el primer día posterior a la inyección, la fluorescencia en la esclerótica fue seis veces mayor que en el limbo. En el tercer y séptimo día, los liposomas se redujeron significativamente en la esclerótica en las regiones temporal y superior, atribuidos a los mecanismos de aclaramiento ocular.La menor cantidad de fluorescencia se detectó en las regiones nasal e inferior, debido a la distancia desde el sitio de inyección. Es importante etiquetar los fotogramas de manchas de acuerdo con el mapa ocular antes de detener la grabación. Mantenga la intensidad del láser consistente y defina el valor de fondo máximo para una comparación adecuada entre diferentes experimentos.Tras la identificación de las formulaciones de plomo, se pueden realizar estudios farmacocinéticos y de biodistribución exhaustivos en animales para estudiar la biodisponibilidad del fármaco y validar la eficacia terapéutica de sus formulaciones.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

De alta resolución de fibra óptica para Microendoscopy In situ Celular imágenes

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Investigación

Bioingeniería

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Video-velocidad de barrido y microscopía confocal Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Espacio-Temporal de manipulación de la actividad GTPasa pequeña en el nivel subcelular y en escala de tiempo de segundos en las células vivas

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Los andamios de autoinforme para el 3-Dimensional Cultivo Celular

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Modelos y métodos para evaluar el transporte de Drug Delivery Systems a través de barreras celulares

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Una técnica-Label libre para el Imaging espacio-temporal de las secreciones sola célula

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

Multimodal de imágenes y la Plataforma Microendoscopy Espectroscopia de fibra paquete para no invasiva,<em&gt; En Vivo</em&gt; Análisis de Tejidos

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Fabricación y entrega de medicamentos Aplicaciones de seda nanopartículas

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

Evaluación integral de la efectividad y seguridad de la entrega de drogas orientada a Placenta utilizando tres métodos complementarios

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Preparación de células sintéticas productoras de proteínas mediante extractos bacterianos libres de células, liposomas y transferencia de emulsión

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...