Name: spatio-temporal in vivo imaging of ocular drug delivery systems using fiberoptic confocal laser microendoscopy
Uploaded: 2021-09-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy at JoVE.com

Denna forskning finansierades av NTU-Northwestern Institute for Nanomedicine (NNIN) anslag som tilldelats (till SV) och delvis av Singapore National Research Foundation Grant AG / CIV / GC70-C / NRF / 2013/2 och Singapores hälsa och biomedicinska vetenskaper (HBMS) Industry Alignment Fund Pre-Positioning (IAF-PP) bidrag H18/01/a0/018 administreras av Agency for Science, Technology and Research (AMC). Tack till medlemmar från Duke-NUS Laboratory for Translational and Molecular Imaging (LTMI) för att underlätta logistiken och genomförandet av studierna och utbildningen på utrustning. Särskilt tack till Ms. Wisna Novera för hennes redaktionella hjälp.

Alla metoder som beskrivs här har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid SingHealth (Singapore). Kvinnliga C57BL/6 J möss (6- 8 veckor gamla; 18-20 g) erhölls från InVivos, Singapore, och inrymt i en temperatur och ljuskontrollerad vivarium av Duke-NUS Medical School, Singapore. Djur behandlades i enlighet med riktlinjerna från Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) uttalande för användning av djur i oftalmisk och visionsforskning.
OBS:...

<ol>
	<li>Chaw, S. Y., Novera, W., Chacko, A. -. M., Wong, T. T. L., Venkatraman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fate+of+liposomes+after+subconjunctival+ocular+delivery.">In vivo fate of liposomes after subconjunctival ocular delivery.</a> Journal of Controlled Release. 329, 162-174 (2021).</li><li>Kuo, J. C. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+colorectal+dysplasia+using+fluorescently+labelled+lectins.">Detection of colorectal dysplasia using fluorescently labelled lectins.</a> Scientific Reports. 6 (1), 24231 (2016).</li><li>Wu, Y. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+custom+multiphoton+microscopy+platform+for+live+imaging+of+mouse+cornea+and+conjunctiva.">A custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60944 (2020).</li><li>Zhivov, A., Stachs, O., Kraak, R., Stave, J., Guthoff, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+confocal+microscopy+of+the+ocular+surface.">In vivo confocal microscopy of the ocular surface.</a> The Ocular Surface. 4 (2), 81-93 (2006).</li><li>Bassyouni, F., ElHalwany, N., Ab del Rehim, M., Neyfeh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+new+technologies+applied+in+controlled+drug+delivery+system.">Advances and new technologies applied in controlled drug delivery system.</a> Research on Chemical Intermediates. 41 (4), 2165-2200 (2015).</li><li>Sercombe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+challenges+of+liposome+assisted+drug+delivery.">Advances and challenges of liposome assisted drug delivery.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, (2015).</li><li>Koning, G. A., Storm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+drug+delivery+systems+for+the+intracellular+delivery+of+macromolecular+drugs.">Targeted drug delivery systems for the intracellular delivery of macromolecular drugs.</a> Drug Discovery Today. 8 (11), 482-483 (2003).</li><li>Metselaar, J. M., Storm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+in+the+treatment+of+inflammatory+disorders.">Liposomes in the treatment of inflammatory disorders.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 2 (3), 465-476 (2005).</li><li>Ding, B. S., Dziubla, T., Shuvaev, V. V., Muro, S., Muzykantov, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+drug+delivery+systems+that+target+the+vascular+endothelium.">Advanced drug delivery systems that target the vascular endothelium.</a> Molecular Interventions. 6 (2), 98-112 (2006).</li><li>Hua, S., Wu, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+lipid-based+nanocarriers+for+targeted+pain+therapies.">The use of lipid-based nanocarriers for targeted pain therapies.</a> Frontiers in Pharmacology. 4, 143 (2013).</li><li>Sharma, A., Sharma, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+in+drug+delivery:+Progress+and+limitations.">Liposomes in drug delivery: Progress and limitations.</a> International Journal of Pharmaceutics. 154 (2), 123-140 (1997).</li><li>Abrishami, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+characterization,+and+in+vivo+evaluation+of+nanoliposomes-encapsulated+Bevacizumab+(Avastin)+for+intravitreal+administration.">Preparation, characterization, and in vivo evaluation of nanoliposomes-encapsulated Bevacizumab (Avastin) for intravitreal administration.</a> Retina. 29 (5), 699-703 (2009).</li><li>Pleyer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+absorption+of+cyclosporine+A+from+liposomes+incorporated+into+collagen+shields.">Ocular absorption of cyclosporine A from liposomes incorporated into collagen shields.</a> Current Eye Research. 13 (3), 177-181 (1994).</li><li>Shen, Y., Tu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+ocular+pharmacokinetics+of+ganciclovir+liposomes.">Preparation and ocular pharmacokinetics of ganciclovir liposomes.</a> The AAPS Journal. 9 (3), 371-377 (2007).</li><li>Weijtens, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concentration+of+dexamethasone+in+aqueous+and+vitreous+after+subconjunctival+injection.">High concentration of dexamethasone in aqueous and vitreous after subconjunctival injection.</a> American Journal of Ophthalmology. 128 (2), 192-197 (1999).</li><li>Voss, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+injectable+drug+delivery+system+for+subconjunctival+glaucoma+treatment.">Development of a novel injectable drug delivery system for subconjunctival glaucoma treatment.</a> Journal of Controlled Release. 214, 1-11 (2015).</li><li>Giarmoukakis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+nanoparticles+for+controlled+subconjunctival+delivery+of+latanoprost+acid:+In+vitro+and+in+vivo+evaluation.+Preliminary+results.">Biodegradable nanoparticles for controlled subconjunctival delivery of latanoprost acid: In vitro and in vivo evaluation. Preliminary results.</a> Experimental Eye Research. 112, 29-36 (2013).</li><li>Shah, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal+and+subconjunctival+melphalan+for+retinoblastoma+in+transgenic+mice.">Intravitreal and subconjunctival melphalan for retinoblastoma in transgenic mice.</a> Journal of Ophthalmology. 2014, 829879 (2014).</li><li>Dastjerdi, M. H., Sadrai, Z., Saban, D. R., Zhang, Q., Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+Penetration+of+Topical+and+Subconjunctival+Bevacizumab.">Corneal Penetration of Topical and Subconjunctival Bevacizumab.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 52 (12), 8718-8723 (2011).</li><li>Ezra-Elia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+an+in+vivo+imaging+system+be+used+to+determine+localization+and+biodistribution+of+AAV5-mediated+gene+expression+following+subretinal+and+intravitreal+delivery+in+mice.">Can an in vivo imaging system be used to determine localization and biodistribution of AAV5-mediated gene expression following subretinal and intravitreal delivery in mice.</a> Experimental Eye Research. 176, 227-234 (2018).</li><li>Movila, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+endoscopic+technology+for+real-time+monitoring+of+inflammation+caused+in+experimental+periodontitis.">Intravital endoscopic technology for real-time monitoring of inflammation caused in experimental periodontitis.</a> Journal of Immunological Methods. 457, 26-29 (2018).</li><li>Vanherp, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoscopic+fibered+confocal+fluorescence+microscopy+for+longitudinal+in+vivo+assessment+of+pulmonary+fungal+infections+in+free-breathing+mice.">Bronchoscopic fibered confocal fluorescence microscopy for longitudinal in vivo assessment of pulmonary fungal infections in free-breathing mice.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3009 (2018).</li><li>Chagnon, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+intravital+endoscopic+confocal+fluorescence+microscopy+of+normal+and+acutely+injured+rat+lungs.">In vivo intravital endoscopic confocal fluorescence microscopy of normal and acutely injured rat lungs.</a> Laboratory Investigation. 90 (6), 824-834 (2010).</li><li>Yun, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+near-infrared+fluorescence+conjugation+on+the+anti-cancer+potential+of+cetuximab.">The effect of near-infrared fluorescence conjugation on the anti-cancer potential of cetuximab.</a> Laboratory Animal Research. 34 (1), 30-36 (2018).</li></ol>

Som framgår av resultaten ger CLM en enkel och genomförbar metod för att avbilda okulär fördelning av liposomer i ögat. Vi har tidigare visat användningen av CLM för att karakterisera lokalisering av olika liposomal formuleringar inom mus öga över tid1. För icke-invasiva applikationer tillåter CLM realtidsavbildning av den främre okulära ytan för insikter om hur liposomer fördelas i ögat från samma djur. Detta gör CLM lämplig för förskärmning nanocarrier/ DDS före mer omfat...

Blodfrigång, vävnadsfördelning och målbeläggning av droger i levande system är pelare för att förstå in vivo läkemedelsdisposition. I prekliniska djurmodeller bedöms dessa parametrar vanligtvis genom frekvent blod- och vävnadsprovtagning vid vissa tidpunkter efter läkemedelsadministration. Dessa förfaranden är dock i allmänhet invasiva, inkluderar ofta mätningar som inte är överlevnad och kräver stora djurkohorter för statistisk kraftkraft. Det kan finnas extra kostnader och tid, tillsammans med etiska farhågor för överdriven användning av djur. Som ett resultat av detta håller icke-invasiv avbildning snabbt på att bli ett integrerat steg i biodistributionsstudier. Konfokal lasermikroskopi (CLM1,2) är väl lämpad för okulära tillämpningar för att icke-invasivt avbilda spatio-temporal distributionen av terapier i ögonen på levande djur med hög känslighet och hög upplösning1,3,4.
CLM har potential att underlätta robust screening av okulära drug delivery system (DDS), såsom liposomer, före omfattande kvantifiering av DDS och läkemedelsbiotillgänglighet. Liposomer är attraktiva för sin flexibilitet i att justera sina fysikalisk-kemiska och biofysiska egenskaper5,6,7,8,9,10,11 för att kapsla in ett stort antal terapeutiska laster och kontrollera vävnadsstället för läkemedelsfrisättning och verkningstid. Liposomer har använts i okulära tillämpningar för leverans av stora molekyler, såsom monoklonal antikropp bevacizumab12, och små molekyler som cyklosporin13 och ganciclovir14. Läkemedelsbelastade liposomer har längre biologiska halveringstider och långvariga terapeutiska effekter jämfört med icke-liposomala "fria läkemedel" formuleringar. Läkemedelsfördelningen i okulär vävnad extrapoleras dock vanligtvis från läkemedelskoncentrationer i flytande komponenter i ögat (dvs. blod, vattenhaltig humor och glasaktig humor15,16,17). Som den första in vivo ödet av den lastade läkemedelslasten definieras av egenskaperna hos nanocarrier själv, CLM imaging av fluorescerande liposomer kan fungera som en surrogat för drogen att avslöja vävnad inriktning och in situ vävnad bostadstider. Dessutom kan visuella bevis på leverans med CLM styra DDS-omdesign, utvärdera terapeutiska fördelar med läkemedlet och kanske till och med förutsäga negativa biologiska händelser (t.ex. vävnadstoxicitet på grund av oönskad lokalisering av DDS under utdragna tidsperioder).
Häri beskrivs en steg-för-steg-procedur om hur man studerar okulär biodistribution av liposomer hos levande möss med ett DUBBELbands CLM-system. Detta specifika CLM-system kan detektera tvåfärgsfluorescens (med gröna och röda excitationslasrar vid 488 nm och 660 nm) i realtid, med en frekvens på 8 bilder/s. Genom att fysiskt placera detektionssonden på ögat, protokollet visar bild förvärv och analys av grön-fluorescerande liposomer på subkonjunktiv administrering i möss pre-injiceras intravenöst (IV) med 2% Evans Blue (EB) färgämne. EB-färgämne hjälper till att visualisera de vaskulära strukturerna i den röda fluorescenskanalen. Vi visar representativa resultat från en studie som bedömer 100 nm neutrala liposomer bestående av fosfolipid POPC (dvs. 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfocholin) och dopad med fluorescein-taggad fosfolipid Fl-DHPE (dvs. N-(fluorescein-5-tiocarbamoyl)-1,2-dihexa-decanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamin) i ett förhållande av 95% ). CLM kan fånga de gröna fluorescein-märkta liposomerna vid 15 μm axiell och 3,30 μm lateral upplösning genom avgränsning av EB-färgade okulär vävnadsgränser.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.08 &#181;m polycarbonate filter</td>
			<td>Whatman, USA</td>
			<td>110604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Fisherbrand, Ireland</td>
			<td>09-720-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution</td>
			<td>Alcon, Singapore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Glass Syringe</td>
			<td>Hamilton, USA</td>
			<td>65460-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti, USA</td>
			<td>850457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 G needle (Hamilton, 0.5&#8221; PT4)</td>
			<td>Hamilton, USA</td>
			<td>7803-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm)</td>
			<td>WPI, USA</td>
			<td>ATC 2000 &#38; 61800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5)</td>
			<td>Mauna Kea Technologies, France</td>
			<td></td>
			<td>Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 &#181;m x 500 &#181;m, axial resolution: 15 &#181;m, lateral resolution: 3.3 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>472476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers #5, Dumostar</td>
			<td>WPI, USA</td>
			<td>500233</td>
			<td>11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans Blue</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>E2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fusidic acid eye drop</td>
			<td>LEO Pharma, Denmark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Malvern Panalytical, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>179337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Extruder</td>
			<td>Avanti, USA</td>
			<td>610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE)</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>F362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope System with table clamp stand</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td>SZ51 &#38; SZ2-STU3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatio-temporal in vivo imaging of ocular drug delivery systems using fiberoptic confocal laser microendoscopy

Subkonjunktiv injektion är en attraktiv väg att administrera okulära läkemedel på grund av enkel trans-scleral tillgång som kringgår främre okulär barriärer, såsom hornhinnan och bindhinnan. Medan terapeutiska effekter och farmakokinetik av läkemedlen vid subkonjunktiv injektion har beskrivits i vissa studier, mycket få bedöma okulär distribution av läkemedel eller drug delivery system (DDS). Den senare är avgörande för optimering av intraokulära DDS design och läkemedelsbiotillgänglighet för att uppnå önskad okulär lokalisering och varaktighet av åtgärden (t.ex. akut kontra. långvarig). Denna studie fastställer användningen av fiberoptic confocal laser mikroendoscopy (CLM) för att kvalitativt studera okulär fördelning av fluorescerande liposomer i realtid i levande möss efter sub-conjunctival injektion. Detta är utformat för in vivo visuell inspektion av vävnader på mikroskopisk nivå, detta är också den första fullständiga beskrivningen av CLM-avbildningsmetoden för att studera spatio-temporal fördelning av injicerbara i ögat efter subkonjunktiv injektion.

Protokollet visar nyttan av CLM att bedöma spatio-temporal okulär distribution av gröna fluorescerande liposomer administreras genom subkonjunktival injektion. För att utnyttja dubbelfärgsförmågan (488 nm och 660 nm excitation våglängder) i CLM-systemet, 100 nm neutral POPC liposomer som ska injiceras dopades med 5% Fl-DHPE (komposition och karakteriseringsdata visas i figur 1B), och EB injicerades IV för att identifiera landmärken i ögat. Förekomsten av ett tunt lager av episcl...

Watch this Scientific Journal Video about Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy at JoVE.com

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

Vi presenterar ett protokoll för användning av fiberoptic confocal laser mikroendoscopy (CLM) att icke-invasivt studera spatio-temporal distribution av liposomer i ögat efter subkonjunktiva injektion.

Spatio-Temporal In Vivo Imaging av okulära drug delivery system med fiberoptisk konfokrisk lasermikroskopi

Subconjunctival injection is an attractive route to administer ocular drugs due to easy trans-scleral access that bypasses anterior ocular barriers, such ...

Detta protokoll underlättar screening av nya formuleringar för att bättre förstå hur modifieringar påverkar deras vävnadsresidenstider, vilket är avgörande för att utforma ett optimalt drug delivery-system. Denna teknik är icke-invasiv och möjliggör realtidsavbildning, vilket minskar överdriven användning av djur för provtagning. Drug delivery system kan omformas för avbildning och terapeutiska tillämpningar genom att helt enkelt inkludera det terapeutiska läkemedlet och imaging moiety i en nanobärare.Detta har användbara tillämpningar vid både behandling av cancer och infektionssjukdomar. Rasha Msallam, en senior forskare från mitt laboratorium, visar proceduren. Till att börja med, två timmar före subkonjunktiv injektion, injicera musen intravenöst via svans med 2,5 milligram per kilo Evans blå, eller EB. Efter att ha sederat musen med 5%isofluran, överför musen till en noskon och behåll sederad mus på en värmeplatta.Trimma sedan morrhåren nära ögat som ska injiceras. Ingjut en droppe på 0,5%proxymetacainehydrokloridlösning direkt på ögat. Ladda sedan en 10-mikroliter glasspruta utrustad med en 32-gauge nål med fluorescerande liposomer och se till att luftbubblorna inte finns i sprutan.Använd en pincett, lyft bindhinnan och injicera långsamt liposomer i subkonjunktivalutrymmet och dra sedan tillbaka nålen långsamt och förhindra ryggflöde. Se till att bleb bildas fylld med fluorescerande liposomer. Administrera en 1% fusitic syra droppe på ögat och övervaka musen tills den återfår medvetandet.Slå på CLM-systemet. Anslut sonden till CLM-systemet. Välj synfält och plats för anskaffningsfilerna i det här läget.Justera laserintensiteten för att säkerställa att fluorescensdetekteringen för fluorescein DHPE ligger i det linjära intervallet och håll intensiteten konsekvent för jämförelse mellan bilder tagna vid olika tidpunkter. När systemet har värmts upp i 15 minuter kalibrerar du systemet enligt tillverkarens instruktioner med hjälp av kalibreringssatsen som innehåller rengörings-, skölj- och fluor-4-lösningarna för varje laser. Börja kalipulera genom att doppa spetsen i fem sekunder vardera i rengöringsflaskan och sedan i sköljningsflaskan.Lämna spetsen i luften för bakgrundsinspelning för att normalisera bakgrundsvärdena från sondernas olika fibrer, vilket säkerställer bildens enhetlighet. Sänk återigen ned spetsen i fem sekunder i rengöringsflaskan och sedan i sköljningsflaskan. Sänk sedan ned spetsen i injektionsflaskan som innehåller fluor-4 488 nanometer i fem sekunder för att normalisera signalvärdena.Upprepa spetsens nedsänkning i fem sekunder i rengöringsflaskan följt av sköljningsflaskan. Håll spetsen i sköljflaskan tills fluorescenssignalen som registrerats i föregående steg försvinner. Överför sedan spetsen i injektionsflaskan som innehåller fluor-4 660-nanometer för att normalisera signalvärden från olika fibrer i sonden.Efter kalibrering, se till att värdet är mindre än 100 för sondens bakgrund. Annars utför du upprepad rengöring av sonden med en bomullsspetsapplikator. Slå på djurtemperaturregulatorn med en ansluten värmedyna och justera temperaturen till 37 grader Celsius.Efter att ha täckt värmedynan med ett kirurgiskt draperi, fixera noskonen på värmeplattan. Efter att ha sederat musen med 5% isofluran i en induktionskammare, överför musen till noskonen och behåll den sederade musen på en värmeplatta. Ingjut sedan en droppe bedövningsmedel 0,5%proxymetacaine hydrokloridlösning på ögat.För att tvätta okulärytan och undvika kristallisering av linsen, håll ögonen smorda genom att släppa några saltlösningsdroppar. Rotera sedan och justera mikroskopets okular för att se musögat ergonomiskt i direktfokus vid 0,67 gånger förstoringen. Slå på lasern och placera sonden som en penna direkt på ögonområdet som ska avbildas.Börja sedan registrera förvärv för att observera fluorescensen i ögat på den intressanta regionen. Stoppa inspelningen när alla regioner är flaggade och märkta enligt ögonkartan för att veta den exakta avsökningsplatsen vid den exakta ramen. Förvärvsfilerna sparas automatiskt som videofiler på den plats som tidigare valts.Fluorescence imaging visade distinkt differentiering mellan sclera och hornhinnan regioner. Hög vascularization av episclera och bindhinnan orsakade sclera regionen att fläcka rött med EB. Hornhinnan, som saknar vaskulatur, verkade svart. Kontrast fluorescence av limbus och sclera observerades i sju dagars studie.Fluorescein färgin-injicerade kontroll möss bekräftade specificiteten hos liposom-härledda fluorescens. Fluorescensintensiteterna var höga på första och tredje dagen. Grön fluorescens proxied liposom minskning i limbus och sclera regioner över tiden.Skillnaderna i fluorescenssignalerna från post-injection dag ett till dag tre vid temporala limbus och överlägsen limbus regioner var inte betydande, vilket anger preferens av neutrala liposomer till regionen limbus, särskilt hornhinnans periferi. För de tidsmässiga och överlägsna regionerna på dag ett efter injektionen var fluorescens i sclera sex gånger högre än i limbus. Vid den tredje och sjunde dagen minskade liposomer avsevärt i sclera i de tidsmässiga och överlägsna regionerna, tillskrivs okulär clearance mekanismer.Den lägsta mängden fluorescens upptäcktes i de nasala och sämre regionerna, på grund av avståndet från injektionsstället. Det är viktigt att märka fleck-ramarna enligt ögonkartan innan inspelningen stoppas. Håll laserintensiteten konsekvent och definiera det maximala bakgrundsvärdet för korrekt jämförelse mellan olika experiment.Efter identifiering av blyformuleringar kan omfattande farmakokinetiska och biodistributionsstudier på djur genomföras för att studera läkemedlets biotillgänglighet och validera den terapeutiska effekten av deras formuleringar.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Högupplöst Fiberoptiska Microendoscopy för På plats Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Video-rate Scanning konfokalmikroskopi och Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Tid och rum Manipulering av små GTPas aktivitet på Subcellulär nivå och Tidsplan sekunder i levande celler

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Självrapporterings Ställningar för 3-dimensionell cellodling

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Modeller och metoder för att utvärdera Transport av Drug Delivery System Across Cellular Hinder

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

En etikett-fri teknik för spatiotemporala avbildning av en enda cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

Multimodal Imaging och spektroskopi Fiber-bunt Microendoscopy plattformen för icke-invasiv,<em&gt; In Vivo</em&gt; Vävnadsanalys

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Tillverkning och Drug Delivery Tillämpningar av Silk Nanopartiklar

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

Omfattande utvärdering av effektiviteten och säkerheten av Placenta-Targeted Drug Delivery med tre kompletterande metoder

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Förbereda proteinproducerande syntetiska celler med cellfria bakterieextrakt, liposomer och emulsion överföring

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...