Name: spatio-temporal in vivo imaging of ocular drug delivery systems using fiberoptic confocal laser microendoscopy
Uploaded: 2021-09-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy at JoVE.com

Bu araştırma, NTU-Northwestern Nanomedicine Enstitüsü (NNIN) hibesi tarafından (SV'ye) ve kısmen Singapur Ulusal Araştırma Vakfı Grant AG/CIV/GC70-C/NRF/201 tarafından finanse edildi. 3/2 ve Singapur Sağlık ve Biyomedikal Bilimler (HBMS) Endüstri Uyum Fonu Ön Konumlandırma (IAF-PP) bilim ajansı tarafından yönetilen H18/01/a0/018 hibesi, Teknoloji ve Araştırma (A*STAR) (AMC'ye). Duke-NUS Çeviri ve Moleküler Görüntüleme Laboratuvarı (LTMI) üyelerine, çalışmaların ve ekipmanların lojistiğini ve yürütülmesini kolaylaştıran üyelere teşekkür ederiz. Bayan Wisna Novera'ya editöryal yardımı için özel teşekkürler.

Burada açıklanan tüm yöntemler SingHealth'teki (Singapur) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Dişi C57BL/6 J fareler (6- 8 haftalık; 18-20 g) InVivos, Singapur'dan elde edildi ve Singapur Duke-NUS Tıp Fakültesi'nin sıcaklık ve ışık kontrollü vivariumunda barındırıldı. Hayvanlar, oftalmik ve görme araştırmalarında hayvanların kullanımı için Görme ve Oftalmoloji Araştırma Derneği (ARVO) açıklamasından alınan kılavuza uygun olarak tedavi edild...

<ol>
	<li>Chaw, S. Y., Novera, W., Chacko, A. -. M., Wong, T. T. L., Venkatraman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fate+of+liposomes+after+subconjunctival+ocular+delivery.">In vivo fate of liposomes after subconjunctival ocular delivery.</a> Journal of Controlled Release. 329, 162-174 (2021).</li><li>Kuo, J. C. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+colorectal+dysplasia+using+fluorescently+labelled+lectins.">Detection of colorectal dysplasia using fluorescently labelled lectins.</a> Scientific Reports. 6 (1), 24231 (2016).</li><li>Wu, Y. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+custom+multiphoton+microscopy+platform+for+live+imaging+of+mouse+cornea+and+conjunctiva.">A custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60944 (2020).</li><li>Zhivov, A., Stachs, O., Kraak, R., Stave, J., Guthoff, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+confocal+microscopy+of+the+ocular+surface.">In vivo confocal microscopy of the ocular surface.</a> The Ocular Surface. 4 (2), 81-93 (2006).</li><li>Bassyouni, F., ElHalwany, N., Ab del Rehim, M., Neyfeh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+new+technologies+applied+in+controlled+drug+delivery+system.">Advances and new technologies applied in controlled drug delivery system.</a> Research on Chemical Intermediates. 41 (4), 2165-2200 (2015).</li><li>Sercombe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+challenges+of+liposome+assisted+drug+delivery.">Advances and challenges of liposome assisted drug delivery.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, (2015).</li><li>Koning, G. A., Storm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+drug+delivery+systems+for+the+intracellular+delivery+of+macromolecular+drugs.">Targeted drug delivery systems for the intracellular delivery of macromolecular drugs.</a> Drug Discovery Today. 8 (11), 482-483 (2003).</li><li>Metselaar, J. M., Storm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+in+the+treatment+of+inflammatory+disorders.">Liposomes in the treatment of inflammatory disorders.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 2 (3), 465-476 (2005).</li><li>Ding, B. S., Dziubla, T., Shuvaev, V. V., Muro, S., Muzykantov, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+drug+delivery+systems+that+target+the+vascular+endothelium.">Advanced drug delivery systems that target the vascular endothelium.</a> Molecular Interventions. 6 (2), 98-112 (2006).</li><li>Hua, S., Wu, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+lipid-based+nanocarriers+for+targeted+pain+therapies.">The use of lipid-based nanocarriers for targeted pain therapies.</a> Frontiers in Pharmacology. 4, 143 (2013).</li><li>Sharma, A., Sharma, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+in+drug+delivery:+Progress+and+limitations.">Liposomes in drug delivery: Progress and limitations.</a> International Journal of Pharmaceutics. 154 (2), 123-140 (1997).</li><li>Abrishami, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+characterization,+and+in+vivo+evaluation+of+nanoliposomes-encapsulated+Bevacizumab+(Avastin)+for+intravitreal+administration.">Preparation, characterization, and in vivo evaluation of nanoliposomes-encapsulated Bevacizumab (Avastin) for intravitreal administration.</a> Retina. 29 (5), 699-703 (2009).</li><li>Pleyer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+absorption+of+cyclosporine+A+from+liposomes+incorporated+into+collagen+shields.">Ocular absorption of cyclosporine A from liposomes incorporated into collagen shields.</a> Current Eye Research. 13 (3), 177-181 (1994).</li><li>Shen, Y., Tu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+ocular+pharmacokinetics+of+ganciclovir+liposomes.">Preparation and ocular pharmacokinetics of ganciclovir liposomes.</a> The AAPS Journal. 9 (3), 371-377 (2007).</li><li>Weijtens, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concentration+of+dexamethasone+in+aqueous+and+vitreous+after+subconjunctival+injection.">High concentration of dexamethasone in aqueous and vitreous after subconjunctival injection.</a> American Journal of Ophthalmology. 128 (2), 192-197 (1999).</li><li>Voss, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+injectable+drug+delivery+system+for+subconjunctival+glaucoma+treatment.">Development of a novel injectable drug delivery system for subconjunctival glaucoma treatment.</a> Journal of Controlled Release. 214, 1-11 (2015).</li><li>Giarmoukakis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+nanoparticles+for+controlled+subconjunctival+delivery+of+latanoprost+acid:+In+vitro+and+in+vivo+evaluation.+Preliminary+results.">Biodegradable nanoparticles for controlled subconjunctival delivery of latanoprost acid: In vitro and in vivo evaluation. Preliminary results.</a> Experimental Eye Research. 112, 29-36 (2013).</li><li>Shah, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal+and+subconjunctival+melphalan+for+retinoblastoma+in+transgenic+mice.">Intravitreal and subconjunctival melphalan for retinoblastoma in transgenic mice.</a> Journal of Ophthalmology. 2014, 829879 (2014).</li><li>Dastjerdi, M. H., Sadrai, Z., Saban, D. R., Zhang, Q., Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+Penetration+of+Topical+and+Subconjunctival+Bevacizumab.">Corneal Penetration of Topical and Subconjunctival Bevacizumab.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 52 (12), 8718-8723 (2011).</li><li>Ezra-Elia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+an+in+vivo+imaging+system+be+used+to+determine+localization+and+biodistribution+of+AAV5-mediated+gene+expression+following+subretinal+and+intravitreal+delivery+in+mice.">Can an in vivo imaging system be used to determine localization and biodistribution of AAV5-mediated gene expression following subretinal and intravitreal delivery in mice.</a> Experimental Eye Research. 176, 227-234 (2018).</li><li>Movila, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+endoscopic+technology+for+real-time+monitoring+of+inflammation+caused+in+experimental+periodontitis.">Intravital endoscopic technology for real-time monitoring of inflammation caused in experimental periodontitis.</a> Journal of Immunological Methods. 457, 26-29 (2018).</li><li>Vanherp, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoscopic+fibered+confocal+fluorescence+microscopy+for+longitudinal+in+vivo+assessment+of+pulmonary+fungal+infections+in+free-breathing+mice.">Bronchoscopic fibered confocal fluorescence microscopy for longitudinal in vivo assessment of pulmonary fungal infections in free-breathing mice.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3009 (2018).</li><li>Chagnon, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+intravital+endoscopic+confocal+fluorescence+microscopy+of+normal+and+acutely+injured+rat+lungs.">In vivo intravital endoscopic confocal fluorescence microscopy of normal and acutely injured rat lungs.</a> Laboratory Investigation. 90 (6), 824-834 (2010).</li><li>Yun, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+near-infrared+fluorescence+conjugation+on+the+anti-cancer+potential+of+cetuximab.">The effect of near-infrared fluorescence conjugation on the anti-cancer potential of cetuximab.</a> Laboratory Animal Research. 34 (1), 30-36 (2018).</li></ol>

Sonuçlardan da anlaşılır gibi CLM, gözdeki lipozomların oküler dağılımını görüntüleyen basit ve uygulanabilir bir yöntem sağlar. Daha önce clm'nin fare gözü içindeki çeşitli lipozomal formülasyonların zaman içinde lokalizasyonunu karakterize etmek için kullanıldığını göstermiştik1. İstilacı olmayan uygulamalar için CLM, lipozomların aynı hayvandan göze nasıl dağıtıldığı hakkında bilgi için ön oküler yüzeyin gerçek zamanlı görüntülenmesini iz...

Canlı sistemlerde ilaçların kan klirensi, doku dağılımı ve hedef doluluğu in vivo ilaç eğilimini anlamanın temel direğidir. Preklinik hayvan modellerinde, bu parametreler tipik olarak ilaç uygulama sonrası belirli zaman noktalarında sık kan ve doku örneklemesi ile değerlendirilir. Bununla birlikte, bu prosedürler genellikle istilacıdır, genellikle hayatta kalma dışı ölçümleri içerir ve istatistiksel güçlenme için büyük hayvan kohortları gerektirir. Hayvanların aşırı kullanımı için etik kaygıların yanı sıra ekstra maliyet ve zaman olabilir. Sonuç olarak, non-invaziv görüntüleme hızla biyodistributions çalışmalarında ayrılmaz bir adım haline gelmektedir. Konfokal lazer miksoskopi (CLM1,2), yüksek hassasiyetli ve yüksek çözünürlüklü canlı hayvanların gözünde terapötiklerin mekansal-zamansal dağılımını invaziv olmayan bir şekilde görüntüleyen oküler uygulamalar için çok uygundur1,3,4.
CLM, DDS'nin kapsamlı ölçülmesi ve ilaç biyoyararlanımdan önce lipozomlar gibi oküler ilaç dağıtım sistemlerinin (DDS) sağlam taramasını kolaylaştırma potansiyeline sahiptir. Lipozomlar, çok çeşitli terapötik kargoları kapsüllemek ve ilaç salınımının doku bölgesini ve etki süresini kontrol etmek için fizikokimyasal ve biyofiziksel özelliklerini ayarlamadaki esneklikleri için çekicidir. Lipozomlar, monoklonal antikor bevacizumab12 gibi büyük moleküllerin ve siklosporin13 ve ganciclovir14 gibi küçük moleküllerin teslimi için oküler uygulamalarda kullanılmıştır. İlaç yüklü lipozomlar, lipozomal olmayan "serbest ilaç" formülasyonlarına kıyasla daha uzun biyolojik yarı ömürlere ve uzun süreli terapötik etkilere sahiptir. Bununla birlikte, oküler dokudaki ilaç dağılımı tipik olarak gözün sıvı bileşenlerindeki ilaç konsantrasyonlarından (yani kan, sulu mizah ve vitreus mizahı15,16,17) tahmin edilir. Yüklü ilaç kargosunun ilk in vivo kaderi nanokarrierin özellikleri ile tanımlandığı için, floresan lipozomların CLM görüntülemesi, ilacın doku hedeflemesini ve yerinde doku ikamet sürelerini ortaya çıkarmak için bir taşıyıcı görevi görebilirsiniz. Ayrıca, CLM ile doğumun görsel kanıtları DDS'nin yeniden tasarlanmasını yönlendirebilir, ilacın terapötik faydalarını değerlendirebilir ve hatta belki de olumsuz biyolojik olayları tahmin edebilir (örneğin, DDS'nin uzun süre istenmeyen lokalizasyonuna bağlı doku toksisitesi).
Burada, çift bantlı CLM sistemine sahip canlı farelerde lipozomların oküler biyodistribasyonunun nasıl incelenerek incelenerek adım adım bir prosedür detaylandırılır. Bu özel CLM sistemi, iki renkli floresanları (488 nm ve 660 nm'de yeşil ve kırmızı heyecan lazerleri ile) gerçek zamanlı olarak, 8 kare /s frekansta algılayabilir. Algılama probunun göze fiziksel olarak yerleştirilmesiyle protokol, %2 Evans Blue (EB) boyası ile intravenöz (IV) önceden enjekte edilen farelerde subkonjonktival uygulama üzerine yeşil floresan lipozomların görüntü alımını ve analizini göstermektedir. EB boyası kırmızı floresan kanalındaki damarlı yapıların görselleştirilmesine yardımcı olur. Fosfolipid POPC'den (yani, 1-palmitoyl-2-oleoyl-glisero-3-fosfokolin) oluşan ve floresan etiketli fosfolipid Fl-DHPE (örneğin, N-(floresan-5-tiyokarbamoyl)-1,2-dihexa-decanoylsn-glisero-3-fosfotianolamin) % 95 POPC: % 5 Fl-DHPE (Şekil 1B) ). CLM, EB lekeli oküler doku sınırlarının tanımlaması ile yeşil floresan etiketli lipozomları 15 μm eksenel ve 3,30 μm yanal çözünürlükte yakalayabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.08 &#181;m polycarbonate filter</td>
			<td>Whatman, USA</td>
			<td>110604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Fisherbrand, Ireland</td>
			<td>09-720-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution</td>
			<td>Alcon, Singapore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Glass Syringe</td>
			<td>Hamilton, USA</td>
			<td>65460-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti, USA</td>
			<td>850457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 G needle (Hamilton, 0.5&#8221; PT4)</td>
			<td>Hamilton, USA</td>
			<td>7803-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm)</td>
			<td>WPI, USA</td>
			<td>ATC 2000 &#38; 61800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5)</td>
			<td>Mauna Kea Technologies, France</td>
			<td></td>
			<td>Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 &#181;m x 500 &#181;m, axial resolution: 15 &#181;m, lateral resolution: 3.3 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>472476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers #5, Dumostar</td>
			<td>WPI, USA</td>
			<td>500233</td>
			<td>11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans Blue</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>E2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fusidic acid eye drop</td>
			<td>LEO Pharma, Denmark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Malvern Panalytical, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>179337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Extruder</td>
			<td>Avanti, USA</td>
			<td>610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE)</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>F362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope System with table clamp stand</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td>SZ51 &#38; SZ2-STU3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatio-temporal in vivo imaging of ocular drug delivery systems using fiberoptic confocal laser microendoscopy

Subkonjonktival enjeksiyon, kornea ve konjonktiva gibi ön oküler bariyerleri atlayan kolay trans-skleral erişim nedeniyle oküler ilaçları uygulamak için çekici bir yoldur. Subkonjonktival enjeksiyon üzerine ilaçların terapötik etkileri ve farmakokinetiği bazı çalışmalarda tanımlanmış olmakla birlikte, çok azı ilaçların veya ilaç dağıtım sistemlerinin (DDS) oküler dağılımını değerlendirmemektedir. İkincisi, istenen oküler lokalizasyonu ve etki süresini (örneğin, akut ve uzun süreli) elde etmek için göz içi DDS tasarımının ve ilaç biyoyararlanımının optimizasyonu için kritik öneme sahiptir. Bu çalışma, floresan lipozomların konjonktival enjeksiyondan sonra canlı farelerde gerçek zamanlı olarak oküler dağılımını niteliksel olarak incelemek için fiberoptik konfokal lazer mikroendoskopi (CLM) kullanımını ortaya çıkarmaktadır. Mikroskobik düzeyde dokuların in vivo görsel muayenesi için tasarlanan bu, aynı zamanda subkonjonktival enjeksiyondan sonra gözdeki enjekte edilebilirlerin mekano-zamansal dağılımını incelemek için CLM görüntüleme yönteminin ilk tam açıklamasıdır.

Protokol, subkonjonktival enjeksiyon yoluyla uygulanan yeşil floresan lipozomların mekano-zamansal oküler dağılımını değerlendirmek için CLM'nin yararını göstermektedir. CLM sisteminin çift renkli yeteneğinden (488 nm ve 660 nm ekscitasyon dalga boyları) yararlanmak için, enjekte edilecek 100 nm nötr POPC lipozomlarına% 5 Fl-DHPE (kompozisyon ve karakterizasyon verileri Şekil 1B'de gösterilmiştir) ve EB'ye gözdeki yer işaretlerini tanımlamak için IV enjekte edildi. ...

Watch this Scientific Journal Video about Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy at JoVE.com

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

Subkonjonktival enjeksiyondan sonra gözdeki lipozomların mekansal-zamansal dağılımını invaziv olmayan bir şekilde incelemek için fiberoptik konfokal lazer miksanoskopi (CLM) kullanımı için bir protokol sunuyoruz.

Fiberoptik Konfokal Lazer Mikroendoskopi Kullanılarak Oküler İlaç Dağıtım Sistemlerinin Spatio-Temporal In Vivo Görüntülemesi

Subconjunctival injection is an attractive route to administer ocular drugs due to easy trans-scleral access that bypasses anterior ocular barriers, such ...

Bu protokol, değişikliklerin doku ikamet sürelerini nasıl etkilediğini daha iyi anlamak için yeni formülasyonların taranmasını kolaylaştırır, bu da en uygun ilaç dağıtım sisteminin tasarlanmasında kritik öneme sahiptir. Bu teknik noninvazivdir ve hayvanların örnekleme için aşırı kullanımını azaltan gerçek zamanlı görüntülemeye izin verir. İlaç dağıtım sistemleri, sadece terapötik ilaç ve görüntüleme moiety'si bir nano taşıyıcıya dahil edilerek görüntüleme ve terapötik uygulamalar için yeniden tasarlanabilir.Bu hem kanser tedavisinde hem de bulaşıcı hastalık tedavisinde yararlı uygulamalara sahiptir. Prosedürü gösteren rasha Msallam olacak, laboratuvarımdan kıdemli bir araştırma görevlisi. Başlangıç olarak, subkonjonktival enjeksiyondan iki saat önce, fareyi kuyruk yoluyla, evans mavisi veya EB kilogramı başına 2,5 miligram ile intravenöz olarak enjekte edin. Fareyi% 5 izofluran ile sakinleştirdikten sonra, fareyi bir burun konisine aktarın ve bir ısıtma yastığı üzerinde sakinleştirilmiş fareyi koruyun.Daha sonra, enjekte edilecek gözün yanındaki bıyıkları kesin. % 0.5 proxymetacaine hidroklorür çözeltisini doğrudan göze aşılayın. Daha sonra, floresan lipozomlu 32 kalibrelik bir iğne ile donatılmış 10 mikrolitre cam şırınga yükleyin ve hava kabarcıklarının şırıngada bulunmadığından emin olun.Bir cımbız kullanarak konjonktivayı kaldırın ve lipozomları yavaşça subkonjonktival alana enjekte edin, ardından iğneyi yavaşça geri çekerek geri akışı önleyin. Floresan lipozomlarla dolu bleb oluşumunu sağlayın. Göze% 1 fusitik asit damlası uygulayın ve fareyi kendine gelene kadar izleyin.CLM sistemini aç. Sondayı CLM sistemine bağlayın. Bu noktada, edinme dosyalarının görüş alanını ve konumunu seçin.Floresan DHPE için floresan algılamasının doğrusal aralıkta olduğundan emin olmak için lazer yoğunluğunu ayarlayın ve farklı zaman noktalarında çekilen görüntüler arasında karşılaştırma için yoğunluğu tutarlı tutun. Sistem 15 dakika ısındıktan sonra, her lazer için temizleme, durulama ve floro-4 çözeltilerini içeren kalibrasyon kitini kullanarak sistemi üreticinin talimatlarına göre kalibre edin. Kısaca, ucu temizleme şişesinde ve ardından durulama şişesinde beş saniye boyunca batırarak kalibre etmeye başlayın.Arka plan kaydının problardaki arka plan değerlerini farklı liflerden normalleştirmesi için ucu havada bırakın ve görüntü homojenliği sağlayın. Yine, ucu temizleme şişesinde beş saniye ve ardından durulama şişesinde daldırin. Ardından, sinyal değerlerini normalleştirmek için ucu floro-4 488 nanometre içeren şişeye beş saniye daldırın.Uç daldırma işlemi beş saniye boyunca temizleme şişesinde ve ardından durulama şişesinde tekrarlayın. Bir önceki adımda kaydedilen floresan sinyali kaybolana kadar ucu durulama şişesinde tutun. Ardından, probdaki farklı liflerden gelen sinyal değerlerini normalleştirmek için ucu floro-4 660 nanometre içeren şişeye aktarın.Kalibrasyondan sonra, probun arka planı için değerin 100'den az olduğundan emin olun. Aksi takdirde, probun pamuk ucu aplikatörü ile tekrar tekrar temizlenmesini gerçekleştirin. Hayvan sıcaklığı kontrol cihazını bağlı bir ısıtma yastığı ile kapatın ve sıcaklığı 37 santigrat dereceye ayarlayın.Isıtma yastığını cerrahi bir örtü ile kaplattıktan sonra, burun konisini ısıtma yastığına sabitleyin. Bir indüksiyon odasında% 5 izofluran kullanarak fareyi sakinleştirdikten sonra, fareyi burun konisine aktarın ve sakinleştirilmiş fareyi bir ısıtma yastığı üzerinde saklayın. Daha sonra, göze bir damla anestezik% 0.5 proxymetacaine hidroklorür çözeltisi aşılayın.Oküler yüzeyi yıkamak ve lensin kristalleşmesini önlemek için, birkaç tuzlu su damlası bırakarak gözleri yağlayın. Ardından, fare gözünü 0,67 kat büyütmede doğrudan odakta ergonomik olarak görüntülemek için mikroskobun göz merceği döndürün ve ayarlayın. Lazeri açın ve probu görüntülenecek göz bölgesine bir kalem gibi yerleştirin.Ardından, ilgi çekici bölgedeki gözdeki floresanları gözlemlemek için kayıt edinimine başlayın. Tüm bölgeler işaretlendiğinde ve tam çerçevedeki prob konumunu tam olarak bilmek için göz haritasına göre etiketlendiğinde kaydı durdurun. Edinme dosyaları, daha önce seçilen konumda video dosyaları olarak otomatik olarak kaydedilir.Floresan görüntüleme sklera ve kornea bölgeleri arasında belirgin bir farklılaşma olduğunu ortaya koydu. Episklera ve konjonktivanın yüksek vaskülerizasyonu sklera bölgesinin EB ile kırmızıya boyanmasını neden oldu. Vaskülat eksikliği olan kornea siyah görünüyordu. Yedi günlük çalışmada limbus ve skleranın kontrast floresanları gözlendi.Floresan boya enjekte kontrol fareleri lipozom türevli floresan özgüllüğünü doğruladı. Floresan yoğunlukları birinci ve üçüncü günlerde yüksekti. Yeşil floresan zamanla limbus ve sklera bölgelerindeki lipozom azalmasını proxied.Temporal limbus ve üstün limbus bölgelerinde enjeksiyon sonrası birinci günden üçüncü güne kadar floresan sinyallerindeki farklılıklar önemli değildi, bu da nötr lipozomların limbus bölgesine, özellikle kornea çevresine tercih edildiğini gösteriyordu. Enjeksiyon sonrası ilk gün zamansal ve üstün bölgeler için, skleradaki floresan limbüsten altı kat daha yüksekti. Üçüncü ve yedinci gün, lipozomlar zamansal ve üstün bölgelerdeki sklerada önemli ölçüde azaldı, oküler boşluk mekanizmalarına atfedildi.Enjeksiyon bölgesinden uzaklık nedeniyle en düşük floresan miktarı burun ve alt bölgelerde tespit edildi. Kayıt durdurulmadan önce fleck çerçevelerini göz haritasına göre etiketlemek önemlidir. Lazer yoğunluğunu tutarlı tutun ve farklı denemelerde uygun karşılaştırma için maksimum arka plan değerini tanımlayın.Kurşun formülasyonlarının tanımlanmasından sonra, ilacın biyoyararlanimini incelemek ve formülasyonlarının terapötik etkinliğini doğrulamak için hayvanlarda kapsamlı farmakokinetik ve biyodistribasyon çalışmaları yapılabilir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Yüksek çözünürlüklü Fiber-optik Mikroendoskopi In situ Hücresel Görüntüleme

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Video-rate Tarama Konfokal Mikroskop ve Mikroendoskopi

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Yaşayan hücreler içinde Subselüler Düzeyinde ve Seconds Zaman ölçeği üzerinde Küçük GTPaz Faaliyet uzay-zamansal Manipülasyon

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

3-Boyutlu Hücre Kültürü için Self-raporlama iskeleleri

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Modelleri ve Hücresel Engeller Arasında İlaç Taşıyıcı Sistemlerin Transport Değerlendirmesinde Yöntemleri

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Tek Hücre Salgıları uzay-zamansal Görüntüleme için bir etiket içermeyen Tekniği

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

Multimodal Görüntüleme ve Non-invaziv için Spektroskopisi Fiber paket Mikroendoskopi Platformu,<em&gt; İn Vivo</em&gt; Doku Analizi

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

İpek Nanopartiküller imalatı ve İlaç Dağıtım Uygulamaları

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

Kapsamlı değerlendirme etkinliği ve güvenliği üç tamamlayıcı yöntemlerle plasenta hedefli ilaç dağıtım

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Hücre Serbest Bakteriyel Özler, Lipozomlar ve Emülsiyon Transferi Kullanarak Protein Üreten Sentetik Hücreler Hazırlama

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...