Name: nuclear migration in the drosophila oocyte
Uploaded: 2021-05-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte at JoVE.com

Vi er meget taknemmelige over for Jean-Antoine Lepesant og Nicolas Tissot, som oprindeligt udviklede protokollen og delte nogle grafiske elementer i figur 3 med os. Vi takker Fanny Roland-Gosselin, der tog billeder af figur 4. Vi takker også andre laboratoriemedlemmer for nyttige diskussioner, der bidrog til forbedringen af denne teknik og Nathaniel Henneman for hans kommentarer, der hjalp med at forbedre dette manuskript. Vi anerkender ImagoSeine kernefaciliteten for instituttet Jacques Monod, medlem af Frankrig-BioImaging (ANR-10-INBS-04). Maëlys Loh støttes af et ph.d.-stipendium fra det franske forskningsministerium (MESRI). Antoine Guichet og Fred Bernard blev støttet af ARC (Grant PJA20181208148), Association des Entreprises contre le Cancer (Grant Gefluc 2020 #221366) og af et Emergence-tilskud fra IdEx Université de Paris (ANR-18-IDEX-0001).

1. Billedbehandling medium forberedelse
<ol><li>Forbered friske medier på brugsdagen. Pipette 200 μL Schneider-medium (indeholdende L-glutamin og 0,40 g/l NaHCO3 suppleret med 10% varmeinaktiveret føtal kalveserum, 100 U/mL penicillin og 100 mg/mL streptomycin).</li>
	<li>Tillæg med 30 μL insulin 10 mg/mL.</li>
	<li>Der tilsættes 4 μL varmeinaktiveret føtalkalveserum.</li>
</ol>2. Forberedelse af observationskammer
<ol><li>Med en pipettespids påføres en lille mængde silik...

<ol>
	<li>Merkle, J. A., Wittes, J., Sch&#252;pbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+between+somatic+follicle+cells+and+the+germline+patterns+the+egg+and+embryo+of+Drosophila.">Signaling between somatic follicle cells and the germline patterns the egg and embryo of Drosophila.</a> Current Topics in Developmental Biology. 140, 55-86 (2020).</li><li>Roth, S., Lynch, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetry+breaking+during+drosophila+oogenesis.">Symmetry breaking during drosophila oogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 001891 (2009).</li><li>Bernard, F., Lepesant, J. -. A., Guichet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleus+positioning+within+Drosophila+egg+chamber.">Nucleus positioning within Drosophila egg chamber.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 82, 25-33 (2017).</li><li>Koch, E. A., Spitzer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+effects+of+colchicine+on+oogenesis+in+Drosophila:+Induced+sterility+and+switch+of+potential+oocyte+to+nurse-cell+developmental+pathway.">Multiple effects of colchicine on oogenesis in Drosophila: Induced sterility and switch of potential oocyte to nurse-cell developmental pathway.</a> Cell and Tissue Research. 228 (1), 21-32 (1983).</li><li>Januschke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrosome-nucleus+complex+and+microtubule+organization+in+the+Drosophila+oocyte.">The centrosome-nucleus complex and microtubule organization in the Drosophila oocyte.</a> Development. 133, 129-139 (2006).</li><li>Tissot, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+molecular+cues+ensure+a+robust+microtubule-dependent+nuclear+positioning+in+the+Drosophila+oocyte.">Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte.</a> Nature Communications. 8, 15168 (2017).</li><li>Cetera, M., Horne-Badovinac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round+and+round+gets+you+somewhere:+collective+cell+migration+and+planar+polarity+in+elongating+Drosophila+egg+chambers.">Round and round gets you somewhere: collective cell migration and planar polarity in elongating Drosophila egg chambers.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 32, 10-15 (2015).</li><li>Hudson, A. M., Petrella, L. N., Tanaka, A. J., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mononuclear+muscle+cells+in+Drosophila+ovaries+revealed+by+GFP+protein+traps.">Mononuclear muscle cells in Drosophila ovaries revealed by GFP protein traps.</a> Developmental Biology. 314, 329-340 (2008).</li><li>Gervais, L., Claret, S., Januschke, J., Roth, S., Guichet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP5K-dependent+production+of+PIP2+sustains+microtubule+organization+to+establish+polarized+transport+in+the+Drosophila+oocyte.">PIP5K-dependent production of PIP2 sustains microtubule organization to establish polarized transport in the Drosophila oocyte.</a> Development. 135 (23), 3829-3838 (2008).</li><li>Vill&#225;nyi, Z., Debec, A., Timinszky, G., Tiri&#225;n, L., Szabad, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+persistence+of+importin-+b+explains+extended+survival+of+cells+and+zygotes+that+lack+the+encoding+gene+'+n+Villa.">Long persistence of importin- b explains extended survival of cells and zygotes that lack the encoding gene ' n Villa.</a> Mechanisms of Development. 3-4 (125), 196-206 (2008).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging.">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), (2012).</li><li>Chanet, S., Huynh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+sorting+requires+contractile+cortical+waves+in+germline+cells.">Collective cell sorting requires contractile cortical waves in germline cells.</a> Current Biology. 30 (21), 4213-4226 (2020).</li><li>Zhao, T., Graham, O. S., Raposo, A., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+microtubules+push+the+oocyte+nucleus+to+polarize+the+drosophila+dorsal-ventral+axis.">Growing microtubules push the oocyte nucleus to polarize the drosophila dorsal-ventral axis.</a> Science. 336 (6084), 999-1003 (2012).</li><li>Legent, K., Tissot, N., Guichet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+7+Oogenesis+using+fixed+and+live+imaging.">Chapter 7 Oogenesis using fixed and live imaging.</a> Drosophila Oogenesis: Methods and Protocols. 1328, 99-112 (2015).</li></ol>

Andre protokoller beskriver, hvordan man forbereder og kultur Drosophila æg kamre ex vivo for live-imaging assay12,13. Nyheden i denne protokol er brugen af et billedkammer konstrueret ved hjælp af en udhulet aluminium dias, en coverlip, og en O2/ CO2 gennemtrængelig membran. Den største fordel ved dette set-up er at begrænse bevægelsen i Z uden at lægge pres på prøven. Således kan oocyten stadig bevæge sig frit, og derfo...

I flere år har Drosophila oocyte vist sig som et modelsystem til at studere nuklear migration. Den Drosophila oocyt udvikler sig i en flercellet struktur kaldet ægget kammer. Æggekamre omfatter 16 kimceller (15 sygeplejerskeceller og oocytten) omgivet af et epitellag af follikulære somatiske celler. Udviklingen af æggekammeret er blevet opdelt i 14 faser (figur 1A), hvor oocyten vil vokse og akkumulere reserver, der er nødvendige for embryoets tidlige udvikling. Under udviklingen, ved mikrotubule reorganisering og asymmetrisk transport af moderlige determinanter, polariserer oocyten langs de antero-dorsale og dorso-ventrale akser. Disse akser bestemmer embryoets efterfølgende polaritetsakser og den voksne som følge af befrugtningen af denne oocyt1. Under oogenesis, vedtager kernen en asymmetrisk position i oocyt. I fase 6 er kernen centreret i cellen. Efter endnu ikke identificeret signal, der udsendes af de bageste follikulære celler, som modtages af oocytten, migrerer kernen mod krydset mellem de forreste og laterale plasmamembraner i fase 7 (Figur 1B)2,3. Denne asymmetriske position er nødvendig for at fremkalde bestemmelsen af dorso-ventral aksen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62688/62688fig1v2.jpg"> Figur 1: Drosophila melanogaster ægkamre. Ovariolen består af at udvikle ægkamre på forskellige stadier. Modning øges langs antero-posterior aksen med germarium på den forreste spids (venstre), hvor kim stamcellen ligger og den ældre fase på den bageste spids (højre). (B) Z-projektion af levende æg kammer ved spinding disk confocal mikroskopi på trin 6 af oogenesis (venstre), hvor kernen er centreret i oocytten. Kernen vil migrere for at indtage en asymmetrisk position på trin 7 (til højre) i kontakt med den forreste plasmamembran (mellem oocytten og sygeplejerskecellen) og den laterale plasmamembran (mellem oocytten og follikulære celler). Denne position vil fremkalde bestemmelsen af dorsalsiden og dermed ægkammerets dorso-ventrale akse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62688/62688fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
I mange årtier er denne nukleare migration blevet undersøgt på fast væv ved immunostaining. Denne fremgangsmåde har især gjort det muligt at påvise , at denne proces afhænger af et tæt netværk af mikrotubuli4,5. For nylig har vi udviklet en protokol, der tilbyder betingelser, der er kompatible med live billeddannelse af oocyten i flere timer, hvilket gør det muligt at studere denne proces dynamisk6.
Derfor har vi for første gang været i stand til at beskrive, at kernen har præference- og karakteristiske baner under dens migration, en langs den forreste plasmamembran (APM) og en anden langs den laterale plasmamembran (LPM) af oocytten (Figur 2). Disse seneste resultater understreger betydningen af protokoller om live-billeddannelse, når man studerer dynamiske processer såsom nuklear migration.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62688/62688fig02.jpg"> Figur 2: Skematisk repræsentation af kernens forskellige overflytningsstier. På trin 6 af oogenesen er oocytten en stor celle med en central kerne. På dette stadium indstilles den antero-bageste polaritetsakse med en bageste/lateral plasmamembran af oocyten i kontakt med follikulære celler, og den forreste plasmamembran (i gult) er i kontakt med sygeplejerskecellerne2. Vi har tidligere rapporteret, at kernen kunne migrere enten langs den forreste plasmamembran (APM), langs den laterale plasmamembran (LPM) eller gennem cytoplasmaet (STAD, direkte til den antero-dorsale cortex)6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62688/62688fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Oocytkernemigrationen er et fænomen på ca. 3 timerog 6, og indtil videre er den begivenhed, der udløser starten på den faktiske migration, ukendt. Starten af migrationen kan også forsinkes af proteinmutanter, der bruges til at studere denne mekanisme. Disse ukendte variabler motiverede os til at erhverve billeder over lange perioder (10-12 timer). Det er derfor vigtigt at sikre, at oocytterne forbliver i live. Efterhånden som ægkammeret udvikler sig, forlænges det langs antero-posterior-aksen fra en sfærisk til en elliptisk form. Denne forlængelse er drevet af rotationen af follikulære celler, som forekommer fra fase 1 til fase 8, vinkelret på antero-posterior aksen7. Derudover omgiver en rørformet kappe af muskler med pulsatile ejendom æggekamrene. Dens fysiologiske funktion er at skubbe de udviklende follikler mod ovidukten kontinuerligt8. For at begrænse de bevægelser, der fremkalder svingninger i æggekamrene efter deres dissektion, har vi designet et observationsmikrokammer på 150 μm i højden (figur 3A). Denne højde er marginalt højere end størrelsen af en follikel på trin 10 og 11. Den begrænser prøvens lodrette bevægelser betydeligt, samtidig med at æggekammerets rotation bevares, hvilket resulterer i begrænsede fejl i follikeludviklingen. Vi udfører derefter live billeddannelse i 12 timer på dissekeret ægkamre ved multi-position time-lapse erhvervelser ved hjælp af en spinning-disk confocal mikroskop. Her beskriver vi vores protokol for at studere oocytkernens migration mellem fase 6 og 7.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62688/62688fig3v3.jpg"> Figur 3: Skematisk repræsentation af observationskammeret. (B) (Nederste visning) En coverlip, der blokerer brønden, forsegles til rutsjebanen med siliciumfedt. (C) (Øverste visning) Dissekerede ovarioler udvikler sig i et billeddiagnostikmedium, der er dækket af en gaspermeabel membran. Halocarbonolie bruges til at stabilisere membranen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62688/62688fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
For at følge den nukleare migration og præcist vurdere baner i oocytten er der behov for markører for både den nukleare kuvert og plasmamembranen. Med dette mål er der valgt to transgener, der har et højt signal/ støjforhold og ikke falmer i løbet af live billeddannelse. For at mærke plasmamembranen anbefales det at bruge en P[ubi-PH-RFP], der koder pleckstrin-homologidomænet (PH) på human phospholipase C ∂1 (PLC∂1), der er fusioneret med RFP. Dette PH-domæne binder sig til fosforikidET PI(4,5)P2 fordelt langs plasmamembranen i oocyten9. For den nukleare ramme viser P[PPT-un1]Fs(2)Ket-GFP proteinfældestammen, hvor GFP indsættes i genet, der omslutter Drosophila ß-importin, et homogent og intenst signal10. Unge fluer (1-2 dage gamle) er placeret i friske hætteglas, der indeholder tørgær 24-48 timer før æggestokkene dissektion.
Til denne live-imaging analyse, en 1 mm tykt stykke aluminium, som er ikke-reaktivt for prøven, er blevet skåret i dimensionerne af en mikroskopi dias. Det har et hul med en diameter på 16 mm i midten af rutsjebanen, der er blevet modboret til 0,85 mm. Denne kontrabore har et hul med en diameter på yderligere 6 mm med en dybde på 150 μm (Figur 3A). En coverlip limes med silikonefedt (inert til prøven) i bunden af aluminiumskammeret (Figur 3B). Efter at prøverne er placeret i den mediumfyldte brønd, placeres en membran, der kan gennemtrænges med O2/CO2-udveksling, over mediet og omgivet af halocarbonolie (Figur 3C).
Til dissektion anbefales det at bruge pincet i rustfrit stål med en spidsdimension på 0,05 x 0,02 mm og nåle med en diameter på 0,20 mm til adskillelse af ovariolerne (Figur 4B, C). De migrerende kerner er afbildet på en roterende disk konfokale inverteret mikroskop CSU-X1 udstyret med et kamera. Billeder med flere positioner blev anskaffet ved tidsforskydning hvert 15. minut ved 24 °C. Et interval på 15 min. gør det muligt at udføre erhvervelser med flere positioner med begrænset fotobleaching af fluorescerende proteiner og fototoksicitet for prøverne. Desuden ville et kortere interval ikke give meget mere informative data til at følge de nukleare baner. Filmene behandles og analyseres via Fiji software11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthetize CO2 pad</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>789060</td>
			<td>Anesthetize flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip (24x50 mm)</td>
			<td>Knittel Glass</td>
			<td>VD12450Y100A</td>
			<td>Observation-chamber preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Dumont #5</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K342.1</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel needles</td>
			<td>Entosphinx</td>
			<td>20</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated fetal calf serum</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>F7524</td>
			<td>Imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin solution bovine pancreas</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>10516 - 5ml</td>
			<td>Imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/Streptomycin solution</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P0781</td>
			<td>Imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permeable membrane</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11521746</td>
			<td>Observation-chamber preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider Medium</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P04-91500</td>
			<td>Imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon grease</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>335148</td>
			<td>Observation-chamber preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disk confocal</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td>Nuclear migration observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltalef oil 10S</td>
			<td>VWR</td>
			<td>24627 - 188</td>
			<td>Observation-chamber preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nuclear migration in the drosophila oocyte

Levende cellebilleddannelse er især nødvendig for at forstå de cellulære og molekylære mekanismer, der regulerer organelle bevægelser, cytoskeleton omlejringer eller polaritetsmønstre i cellerne. Når man studerer oocytkernepositionering, er live-imaging teknikker afgørende for at fange de dynamiske begivenheder i denne proces. Drosophila ægkammeret er en flercellet struktur og et fremragende modelsystem til at studere dette fænomen på grund af dets store størrelse og tilgængelighed af adskillige genetiske værktøjer. Under Drosophila mid-oogenesis migrerer kernen fra en central position i oocytten for at vedtage en asymmetrisk position medieret af mikrotubule-genererede kræfter. Denne migration og placering af kernen er nødvendig for at bestemme embryoets polaritetsakser og den efterfølgende voksne flue. Et karakteristisk træk ved denne migration er, at den forekommer i tre dimensioner (3D), hvilket skaber en nødvendighed for levende billeddannelse. For at studere de mekanismer, der regulerer nuklear migration, har vi således udviklet en protokol til at dyrke de dissekerede ægkamre og udføre live billeddannelse i 12 timer ved time-lapse-erhvervelser ved hjælp af spinding-disk konfokal mikroskopi. Samlet set giver vores forhold os mulighed for at bevare Drosophila ægkamre i live i lang tid, hvilket gør det muligt at visualisere færdiggørelsen af nuklear migration i et stort antal prøver i 3D.

Før overflytningen er kernen dynamisk og svinger rundt om en central position i en periode, der defineres som præmigrering. Disse små bevægelser afspejler en balance mellem at skubbe og trække kræfter, der opretholder ligevægt i midten af oocyten. Ved at kvantificere kernernes baner har vi vist, at APM- og LPM-forløbene havde lignende proportioner. Vi definerer arten af banen ved den første kontakt mellem kernen og plasmamembranen6. Kernen når således enten APM eller LPM, før den glide...

Watch this Scientific Journal Video about Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte at JoVE.com

Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte

I Drosophilagennemgår oocytkernen mikrotubuleafhængig migration under oogenesis. Her beskriver vi en protokol, der blev udviklet til at følge migrationen ved at udføre live billeddannelse på ægkamre ex-vivo. Vores procedure opretholder ægkamre i live i 12 timer for at erhverve multi-position 3D time-lapse film ved hjælp af spinning-disk confocal mikroskopi.

Nuklear migration i Drosophila Oocyte

Live cell imaging is particularly necessary to understand the cellular and molecular mechanisms that regulate organelle movements, cytoskeleton ...

Denne teknik gør det muligt at observere lange biologiske processer i dissekeret Drosophila ægkamre, såsom oocyt nukleare migration, ved hjælp af levende billeddannelse mikroskopi. Denne protokol beskriver, hvordan man opretholder de dissekerede ægkamre i live i 12 timer for at udføre levende billeddiagnostisk mikroskopi. Til at begynde med pipetter 200 mikroliter Schneider Medium og supplerer med 30 mikroliter på 10 milligram pr. milliliter insulin, og tilsæt derefter fire mikroliter varmeinaktiveret føtal kalveserum.Brug en pipettespids til at påføre en lille mængde silikonefedt rundt om hullet på undersiden af den punkterede rutsjebane. Placer en coverlip, og brug den brede ende af en pipette spids til at lægge pres på coverlip at flade silikone fedt til at skabe en silikone ring interiør til diaset. Overfør de bedøvede kvindelige fluer til dissekeringsbrønden, der indeholder 150 mikroliter af billedmediet.Til dissekering af kvinden skal du bruge pincet til at få fat i brystkassen og klemme ryglivets neglebånd med et andet par pincet. Fjern forsigtigt livmoderen, ovidukten og muskelskeden. Isoler og løsrive par æggestokke synlige på neglebånd åbning.Placer en dråbe på 10 til 15 mikroliter af billeddiagnostik medium på æggestokkene, og overføre en æggestok til billedbehandling kammer. Til adskillelse af ovariolerne skal du bruge nålen til at holde den bageste ende af æggestokken. Brug en anden nål til forsigtigt at trække germarium til at drille ovariolerne fra hinanden.Hold skeden med en nål og træk ovariolen gennem de større kamre med en anden nål for at fjerne den resterende muskelskede på æggekamrene. Lad den uopvarmede ovariol synke og kontakte coverlip. Fjern de sene stadier og resten af æggestokkene fra mikrochamber ved hjælp af pincet.Brug nåle til omhyggeligt at distancere ovariolerne for at lette erhvervelsen. Skær en lille 10 med 10 millimeter kvadrat af den gennemtrængelige membran. Påfør forsigtigt membranen på toppen af billedmediet for at udvise eventuelle luftbobler.Derefter forsegler hermetisk kammeret med et tyndt lag halocarbonolie rundt om brønden på membranens kontur. Placer billedopsætningen på diasholderen på det omvendte mikroskop, og brug et 40X mål. Migrationen af oocytkernen i et vildt ægkammer af vild type blev fanget ved hjælp af levende billeddiagnostisk mikroskopi.Kernen når enten den forreste plasmamembran eller den laterale plasmamembran, før den glider langs forløbene for at nå sin endelige position ved skæringspunktet mellem de to plasmamembraner. Membran deformiteter, uorganiserede follikulære celler, forkrøblede celler, og indskrumpet kerner er de første tegn på døende æg kamre. Den degenererede oocyt før otte timers billeddannelse opdages normalt ikke.Men sjældne tilfælde af tidlig degeneration skyldes problemer under dissektion eller montering trin. At skade æggekamrene kompromitterer deres overlevelse. Så delikat hånd præcis dissektion og forberedelse af mikrochamber er altafgørende.Denne procedure gjorde det muligt for os at visualisere, at oocytkernen kan tage tre forskellige baner under dens migration, og forskellige organeller regulerer disse baner inden for oocytten.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Optimering af såret Scratch-analysen til at påvise ændringer i murine Mesenchymale stromacelle Migration efter skade ved Opløselig Cigaret røgekstrakt

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Funktionel kloning ved anvendelse af en<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyt Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering til sammenligning genekspression domæner i<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryoner

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Methods to Study Mrp4-containing Macromolecular Complexes in the Regulation of Fibroblast Migration

Metoder til at studere Mrp4-holdige Makromolekylær Komplekser i forordningen af ​​fibroblast Migration

Multidrug resistance protein 4 (MRP4) is a member of the ATP-binding cassette family of membrane transporters and is an endogenous efflux transporter of ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Metoder til at undersøge lymfeknuder kirtel og hæmocytter i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Funktionel Manipulation af Maternal Gene produkter ved hjælp af<em&gt; In vitro</em&gt; Oocytmodning i Zebrafisk

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion og immunfluorescent farvning af champignon krop og fotoreceptor neuroner i voksen Drosophila melanogaster hjerner

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Celle sammenlægning Assays til at evaluere bindingen af Drosophila Notch med Trans-ligander og dens hæmning af Cis-ligander

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Visualisering af Tangential celle Migration i den udviklende Chick optiske Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Optøning, dyrkning og Cryopreserving Drosophila cellelinjer

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...