Name: nuclear migration in the drosophila oocyte
Uploaded: 2021-05-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte at JoVE.com

We zijn Jean-Antoine Lepesant en Nicolas Tissot zeer dankbaar die het protocol oorspronkelijk ontwikkelden en enkele grafische elementen van figuur 3 met ons deelden. We danken Fanny Roland-Gosselin die de foto's van figuur 4 heeft gemaakt. We danken ook andere lableden voor nuttige discussies die hebben bijgedragen aan de verbetering van deze techniek en Nathaniel Henneman voor zijn opmerkingen die hebben bijgedragen aan het verbeteren van dit manuscript. We erkennen de ImagoSeine kernfaciliteit van het Instituut Jacques Monod, lid van France-BioImaging (ANR-10-INBS-04). Maëlys Loh wordt ondersteund door een doctoraatsbeurs van het Franse ministerie van Onderzoek (MESRI). Antoine Guichet en Fred Bernard werden ondersteund door de ARC (Grant PJA20181208148), de Association des Entreprises contretre le Cancer (Grant Gefluc 2020 #221366) en door een Emergence grant van IdEx Université de Paris (ANR-18-IDEX-0001).

1. Beeldvorming medium voorbereiding
<ol><li>Bereid verse media voor op de dag van gebruik. Pipet 200 μL Schneider medium (met L-Glutamine en 0,40 g/L NaHCO3 aangevuld met 10% warmte-inactief foetale kalfsserum, 100 U/ml penicilline en 100 mg/ml streptomycine).</li>
	<li>Supplement met 30 μL insuline 10 mg/ml.</li>
	<li>Voeg 4 μL warmte-inactief foetale kalfsserum toe.</li>
</ol>2. Voorbereiding observatiekamer
<ol><li>Breng met een pipettip een kleine hoeveelheid siliconenvet aa...

<ol>
	<li>Merkle, J. A., Wittes, J., Sch&#252;pbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+between+somatic+follicle+cells+and+the+germline+patterns+the+egg+and+embryo+of+Drosophila.">Signaling between somatic follicle cells and the germline patterns the egg and embryo of Drosophila.</a> Current Topics in Developmental Biology. 140, 55-86 (2020).</li><li>Roth, S., Lynch, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetry+breaking+during+drosophila+oogenesis.">Symmetry breaking during drosophila oogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 001891 (2009).</li><li>Bernard, F., Lepesant, J. -. A., Guichet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleus+positioning+within+Drosophila+egg+chamber.">Nucleus positioning within Drosophila egg chamber.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 82, 25-33 (2017).</li><li>Koch, E. A., Spitzer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+effects+of+colchicine+on+oogenesis+in+Drosophila:+Induced+sterility+and+switch+of+potential+oocyte+to+nurse-cell+developmental+pathway.">Multiple effects of colchicine on oogenesis in Drosophila: Induced sterility and switch of potential oocyte to nurse-cell developmental pathway.</a> Cell and Tissue Research. 228 (1), 21-32 (1983).</li><li>Januschke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrosome-nucleus+complex+and+microtubule+organization+in+the+Drosophila+oocyte.">The centrosome-nucleus complex and microtubule organization in the Drosophila oocyte.</a> Development. 133, 129-139 (2006).</li><li>Tissot, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+molecular+cues+ensure+a+robust+microtubule-dependent+nuclear+positioning+in+the+Drosophila+oocyte.">Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte.</a> Nature Communications. 8, 15168 (2017).</li><li>Cetera, M., Horne-Badovinac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round+and+round+gets+you+somewhere:+collective+cell+migration+and+planar+polarity+in+elongating+Drosophila+egg+chambers.">Round and round gets you somewhere: collective cell migration and planar polarity in elongating Drosophila egg chambers.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 32, 10-15 (2015).</li><li>Hudson, A. M., Petrella, L. N., Tanaka, A. J., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mononuclear+muscle+cells+in+Drosophila+ovaries+revealed+by+GFP+protein+traps.">Mononuclear muscle cells in Drosophila ovaries revealed by GFP protein traps.</a> Developmental Biology. 314, 329-340 (2008).</li><li>Gervais, L., Claret, S., Januschke, J., Roth, S., Guichet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP5K-dependent+production+of+PIP2+sustains+microtubule+organization+to+establish+polarized+transport+in+the+Drosophila+oocyte.">PIP5K-dependent production of PIP2 sustains microtubule organization to establish polarized transport in the Drosophila oocyte.</a> Development. 135 (23), 3829-3838 (2008).</li><li>Vill&#225;nyi, Z., Debec, A., Timinszky, G., Tiri&#225;n, L., Szabad, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+persistence+of+importin-+b+explains+extended+survival+of+cells+and+zygotes+that+lack+the+encoding+gene+'+n+Villa.">Long persistence of importin- b explains extended survival of cells and zygotes that lack the encoding gene ' n Villa.</a> Mechanisms of Development. 3-4 (125), 196-206 (2008).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging.">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), (2012).</li><li>Chanet, S., Huynh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+sorting+requires+contractile+cortical+waves+in+germline+cells.">Collective cell sorting requires contractile cortical waves in germline cells.</a> Current Biology. 30 (21), 4213-4226 (2020).</li><li>Zhao, T., Graham, O. S., Raposo, A., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+microtubules+push+the+oocyte+nucleus+to+polarize+the+drosophila+dorsal-ventral+axis.">Growing microtubules push the oocyte nucleus to polarize the drosophila dorsal-ventral axis.</a> Science. 336 (6084), 999-1003 (2012).</li><li>Legent, K., Tissot, N., Guichet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+7+Oogenesis+using+fixed+and+live+imaging.">Chapter 7 Oogenesis using fixed and live imaging.</a> Drosophila Oogenesis: Methods and Protocols. 1328, 99-112 (2015).</li></ol>

Andere protocollen beschrijven hoe drosophila-eierkamers ex vivo kunnen worden voorbereid en gekweekt voor live-imaging assay12,13. De nieuwigheid van dit protocol is het gebruik van een beeldvormingskamer die is gebouwd met behulp van een uitgeholde aluminium schuif, een afdeklip en een O2/ CO2 doorlatend membraan. Het belangrijkste voordeel van deze opstelling is om de beweging in Z te beperken zonder druk uit te oefenen op het mo...

Sinds enkele jaren is de Drosophila-oöcyt een modelsysteem om nucleaire migratie te bestuderen. De Drosophila oöcyt ontwikkelt zich in een meercellige structuur genaamd de eikamer. Eikamers omvatten 16 kiemcellen (15 verpleegstercellen en de oöcyt) omgeven door een epitheellaag van folliculaire somatische cellen. De ontwikkeling van de eikamer is onderverdeeld in 14 stadia(figuur 1A),waarin de oöcyt zal groeien en reserves zal opbouwen die nodig zijn voor de vroege ontwikkeling van het embryo. Tijdens de ontwikkeling, bij microtubulireorganisatie en asymmetrisch transport van maternale determinanten, polariseert de oöcyt langs de antero-dorsale en dorso-ventrale assen. Deze assen bepalen de daaropvolgende polariteitsassen van het embryo en de volwassene die voortvloeien uit de bevruchting van deze oöcyt1. Tijdens oogenese neemt de kern een asymmetrische positie in de oöcyt in. In fase 6 is de kern gecentreerd in de cel. Bij een nog te identificeren signaal dat wordt uitgezonden door de achterste folliculaire cellen dat door de oöcyt wordt ontvangen, migreert de kern naar het snijpunt tussen de voorste en laterale plasmamembranen in fase 7 (Figuur 1B)2,3. Deze asymmetrische positie is nodig om de bepaling van de dorso-ventrale as te induceren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62688/62688fig1v2.jpg"> Figuur 1: Drosophila melanogaster eierkamers. (A) Vaste ovariole van transgene vliegen die Fs(2)Ket-GFP uitdrukken die de nucleaire enveloppen en ubi-PH-RFP labelt die de plasmamembranen etiketteert. De ovariole bestaat uit het ontwikkelen van eierkamers in verschillende stadia. De rijping neemt toe langs de antero-posterieure as met het germarium aan de voorste punt (links) waar de kiemstamcel zich bevindt en het oudere stadium aan de achterste punt (rechts). (B) Z-projectie van levende eierkamer door het spinnen van schijf confocale microscopie in stadium 6 van oogenese (links), waarin de kern is gecentreerd in de oöcyt. De kern migreert om een asymmetrische positie in te nemen in stadium 7 (rechts) in contact met het voorste plasmamembraan (tussen de oöcyt en de verpleegkundige cel) en het laterale plasmamembraan (tussen de oöcyt en de folliculaire cellen). Deze positie zal de bepaling van de dorsale kant en dus de dorso-ventrale as van de eierkamer induceren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62688/62688fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
Al vele decennia wordt deze nucleaire migratie bestudeerd op vaste weefsels door immunostaining. Deze aanpak heeft met name aangetoond dat dit proces afhankelijk is van een dicht netwerk van microtubuli4,5. Meer recent hebben we een protocol ontwikkeld met voorwaarden die compatibel zijn met live beeldvorming van de oöcyt gedurende enkele uren, waardoor het mogelijk is om dit proces dynamisch te bestuderen6.
Daarom hebben we voor het eerst kunnen beschrijven dat de kern tijdens zijn migratie voorkeurs- en karakteristieke trajecten heeft, een langs het voorste plasmamembraan (APM) en een andere langs het laterale plasmamembraan (LPM) van de oöcyt (figuur 2). Deze laatste resultaten onderstrepen het belang van live-imaging protocollen bij het bestuderen van dynamische processen zoals nucleaire migratie.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62688/62688fig02.jpg"> Figuur 2: Schematische weergave van de verschillende migratiepaden van de kern. In stadium 6 van de oogenese is de oöcyt een grote cel met een centrale kern. In dit stadium wordt de antero-posterieure polariteitsas ingesteld met een posterieure/laterale plasmamembraan van de oöcyt in contact met de folliculaire cellen en het voorste plasmamembraan (in geel) staat in contact met de verpleegkundige cellen2. We hebben eerder gemeld dat de kern kan migreren langs het voorste plasmamembraan (APM), langs het laterale plasmamembraan (LPM), of via het cytoplasma (STAD, rechtstreeks naar de antero-dorsale cortex)6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62688/62688fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
De oöcytkernmigratie is een fenomeen van ongeveer 3 h6, en tot nu toe is de gebeurtenis die het begin van de daadwerkelijke migratie veroorzaakt onbekend. Het begin van de migratie kan ook worden vertraagd door eiwitmutanten die worden gebruikt om dit mechanisme te bestuderen. Deze onbekende variabelen motiveerden ons om beelden te verwerven over lange periodes (10-12 uur). Het is daarom belangrijk om ervoor te zorgen dat de oöcyten in leven blijven. Naarmate de eierkamer zich ontwikkelt, verlengt deze langs de voorste-posterieure as van een bolvormige naar een elliptische vorm. Deze rek wordt aangedreven door de rotatie van folliculaire cellen, die plaatsvindt van stadium 1 tot stadium 8, loodrecht op de voorste-posterieure as7. Bovendien omringt een buisvormige spierschede met pulsatile eigenschap de eierkamers. Zijn fysiologische functie is om de ontwikkelende follikels naar de eileider onophoudelijk te duwen8. Om de bewegingen te beperken die na hun dissectie oscillaties van de eierkamers veroorzaken, hebben we een observatiemicrokamer ontworpen van 150 μm hoog (figuur 3A). Deze hoogte is marginaal hoger dan de grootte van een follikel in fase 10 en 11. Het beperkt de verticale bewegingen van het monster aanzienlijk met behoud van de rotatie van de eikamer, wat resulteert in beperkte defecten in de follikelontwikkeling. Vervolgens voeren we gedurende 12 uur live beeldvorming uit op ontleedde eierkamers door time-lapse-acquisities met meerdere standen met behulp van een confocale microscoop met spinschijf. Hier beschrijven we ons protocol voor het bestuderen van de oöcyt nucleaire migratie tussen fase 6 en 7.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62688/62688fig3v3.jpg"> Figuur 3: Schematische weergave van de observatiekamer. (A) (Bovenaanzicht) Precieze afmetingen van de aluminium glijbaan met de hoogten (A') en omtrek (A'') van de put die in het midden van de glijbaan is geboord. (B) (Onderste weergave) Een afdeklip die de put blokkeert, wordt met siliciumvet op de glijbaan afgedicht. (C) (Bovenaanzicht) Ontlede ovarioles ontwikkelen zich in een beeldvormingsmedium dat wordt bedekt door een gasdoorlatend membraan. Halocarbon olie wordt gebruikt om het membraan te stabiliseren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62688/62688fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
Om de nucleaire migratie te volgen en trajecten in de oöcyt nauwkeurig te beoordelen, zijn markers nodig voor zowel de nucleaire envelop als het plasmamembraan. Met dit doel zijn twee transgenen geselecteerd die een hoge signaal/ruisverhouding hebben en niet vervagen in de loop van live beeldvorming. Om het plasmamembraan te labelen, wordt het gebruik van een P[ubi-PH-RFP] dat codeert voor het Pleckstrin Homology (PH) domein van de Human Phospholipase C ∂1 (PLC∂1) gefuseerd met RFP aanbevolen. Dit PH-domein bindt aan het phosphoinositide PI(4,5)P2 verdeeld over het plasmamembraan van de oöcyt9. Voor de nucleaire enveloppe geeft de P[PPT-un1]Fs(2)Ket-GFP eiwitvalstam waarbij GFP wordt ingevoegd in het gen dat codeert voor de Drosophila ß-importine een homogeen en intens signaalweer 10. Jonge vliegen (1-2 dagen oud) worden 24-48 uur voor eierstokdissectie in verse flesjes met droge gist geplaatst.
Voor deze live-imaging test is een 1 mm dik stuk aluminium, dat niet reactief is voor het monster, in de afmetingen van een microscopieschuif gesneden. Het heeft een gat met een diameter van 16 mm in het midden van de glijbaan dat is tegengeplaatst tot 0,85 mm. Deze counterbore heeft een extra gat met een diameter van 6 mm met een diepte van 150 μm (figuur 3A). Aan de onderkant van de aluminiumkamer wordt een afdeklip gelijmd met siliconenvet (inert voor het monster) (afbeelding 3B). Na het plaatsen van de monsters in de medium gevulde put wordt een membraan doorlaatbaar tot O2/CO2-uitwisseling over het medium geplaatst en omgeven door halokoolstofolie (figuur 3C).
Voor de dissectie wordt aanbevolen om roestvrijstalen tangen met een tipmaat van 0,05 x 0,02 mm en naalden met een diameter van 0,20 mm te gebruiken voor de scheiding van de ovarioles(figuur 4B, C). De migrerende kernen worden afgebeeld op een spin-schijf confocale omgekeerde microscoop CSU-X1 uitgerust met een camera. Multi-position beelden werden verkregen door time-lapse elke 15 minuten bij 24 °C. Een interval van 15 minuten maakt het mogelijk om multipositie-acquisities uit te voeren met beperkte fotobleaching van de fluorescerende eiwitten en fototoxiciteit voor de monsters. Bovendien zou een korter interval niet veel meer informatieve gegevens opleveren om de nucleaire trajecten te volgen. De films worden verwerkt en geanalyseerd via Fiji software11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthetize CO2 pad</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>789060</td>
			<td>Anesthetize flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip (24x50 mm)</td>
			<td>Knittel Glass</td>
			<td>VD12450Y100A</td>
			<td>Observation-chamber preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Dumont #5</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K342.1</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel needles</td>
			<td>Entosphinx</td>
			<td>20</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated fetal calf serum</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>F7524</td>
			<td>Imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin solution bovine pancreas</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>10516 - 5ml</td>
			<td>Imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/Streptomycin solution</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P0781</td>
			<td>Imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permeable membrane</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11521746</td>
			<td>Observation-chamber preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider Medium</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P04-91500</td>
			<td>Imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon grease</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>335148</td>
			<td>Observation-chamber preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disk confocal</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td>Nuclear migration observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltalef oil 10S</td>
			<td>VWR</td>
			<td>24627 - 188</td>
			<td>Observation-chamber preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nuclear migration in the drosophila oocyte

Live cell imaging is vooral nodig om de cellulaire en moleculaire mechanismen te begrijpen die organelbewegingen, cytoskeletherschikkingen of polariteitspatronen in de cellen reguleren. Bij het bestuderen van de positionering van oöcytenkernen zijn livebeeldvormingstechnieken essentieel om de dynamische gebeurtenissen van dit proces vast te leggen. De Drosophila-eierkamer is een meercellige structuur en een uitstekend modelsysteem om dit fenomeen te bestuderen vanwege de grote omvang en beschikbaarheid van tal van genetische hulpmiddelen. Tijdens Drosophila mid-oogenese migreert de kern vanuit een centrale positie binnen de oöcyt om een asymmetrische positie aan te nemen die wordt gemedieerd door microtubuli-gegenereerde krachten. Deze migratie en positionering van de kern zijn nodig om de polariteitsassen van het embryo en de daaropvolgende volwassen vlieg te bepalen. Een kenmerk van deze migratie is dat het plaatsvindt in drie dimensies (3D), waardoor een noodzaak voor live beeldvorming ontstaat. Om de mechanismen te bestuderen die nucleaire migratie reguleren, hebben we een protocol ontwikkeld om de ontlede eierkamers te cultuleren en live beeldvorming uit te voeren gedurende 12 uur door time-lapse-acquisities met behulp van confocale microscopie met spin-schijf. Over het algemeen stellen onze omstandigheden ons in staat om drosophila-eierkamers lange tijd in leven te houden, waardoor de voltooiing van nucleaire migratie in een groot aantal monsters in 3D kan worden gevisualiseerd.

Vóór de migratie is de kern dynamisch en oscilleert rond een centrale positie gedurende een periode die is gedefinieerd als pre-migratie. Deze kleine bewegingen weerspiegelen een evenwicht van duwende en trekkende krachten die het evenwicht in het midden van de oöcyt handhaven. Door de trajecten van de kernen te kwantificeren, hebben we aangetoond dat de APM- en LPM-trajecten vergelijkbare verhoudingen hadden. We definiëren de aard van het traject door het eerste contact tussen de kern en het plasmamembraan<sup class...

Watch this Scientific Journal Video about Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte at JoVE.com

Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte

In Drosophilaondergaat de oöcytkern microtubuli-afhankelijke migratie tijdens oogenese. Hier beschrijven we een protocol dat is ontwikkeld om de migratie te volgen door live beeldvorming uit te voeren op eierkamers ex-vivo. Onze procedure houdt de eierkamers 12 uur in leven om multi-position 3D time-lapse films te verkrijgen met behulp van spinning-disk confocale microscopie.

Nucleaire migratie in de Drosophila Oocyte

Live cell imaging is particularly necessary to understand the cellular and molecular mechanisms that regulate organelle movements, cytoskeleton ...

Deze techniek maakt het mogelijk om lange biologische processen in ontlede Drosophila-eierkamers, zoals oöcyt nucleaire migratie, te observeren met behulp van live imaging microscopie. Dit protocol beschrijft hoe de ontlede eierkamers 12 uur in leven kunnen blijven om live beeldvormende microscopie uit te voeren. Om te beginnen, pipetteer 200 microliter Schneider Medium en vul aan met 30 microliter van 10 milligram per milliliter insuline, voeg vervolgens vier microliter warmte-inactivated foetale kalfsserum toe.Gebruik een pipettip om een kleine hoeveelheid siliconenvet aan te brengen rondom het gat aan de onderkant van de doorboorde glijbaan. Plaats een afdeklip en gebruik het brede uiteinde van een pipetpunt om druk uit te oefenen op de afdeklip om het siliconenvet af te vlakken voor het creëren van een siliconenringinterieur op de glijbaan. Breng de verdoofde vrouwelijke vliegen over naar de ontleedput met 150 microliter van het beeldvormingsmedium.Voor het ontleden van het vrouwtje, gebruik de tang om de thorax te grijpen en de dorsale buiksparel te knijpen met een tweede paar tangen. Verwijder voorzichtig de baarmoeder, eileider en spierschede. Isoleer en maak het paar eierstokken zichtbaar op de nagelriemopening los.Plaats een druppel van 10 tot 15 microliters van het beeldvormingsmedium op de eierstokken en breng één eierstok over naar de beeldvormingskamer. Gebruik voor het scheiden van de eitjes de naald om het achterste uiteinde van de eierstok vast te houden. Gebruik een andere naald om het germarium voorzichtig uit elkaar te trekken om de ovarioles uit elkaar te plagen.Houd de huls met één naald vast en trek de ovariole met een andere naald door de grotere kamers om de resterende spierschede op de eierkamers te verwijderen. Laat de onverwarmde ovariole zinken en neem contact op met de hoeslip. Verwijder de late stadia en de rest van de eierstokken uit de microkamer met behulp van een tang.Gebruik naalden om voorzichtig afstand te nemen van de ovarioles om de verwerving te vergemakkelijken. Snijd een klein vierkant van 10 bij 10 millimeter van het doorlatende membraan. Breng het membraan voorzichtig aan op de bovenkant van het beeldvormingsmedium om eventuele luchtbellen te verdrijven.Sluit vervolgens de kamer hermetisch af met een dunne laag halokoolstofolie rond de put op de contour van het membraan. Plaats de beeldvormingsopstelling op de diahouder van de omgekeerde microscoop en gebruik een 40X-objectief. De migratie van de oöcytkern van een eikamer van het wilde type werd vastgelegd met behulp van live beeldvormende microscopie.De kern bereikt het voorste plasmamembraan of het laterale plasmamembraan voordat het langs de trajecten glijdt om zijn definitieve positie op het snijpunt van de twee plasmamembranen te bereiken. Membraanmisvormingen, ongeorganiseerde folliculaire cellen, onvolgroeide cellen en gekrompen kernen zijn de eerste tekenen van stervende eikamers. De ontaarde oöcyt vóór acht uur beeldvorming wordt meestal niet gedetecteerd.Zeldzame gevallen van vroege degeneratie zijn echter te wijten aan problemen tijdens de dissectie of montagestappen. Het beschadigen van de eierkamers brengt hun overleving in gevaar. Zo delicaat hand nauwkeurige dissectie en voorbereiding van de microchamber zijn van het grootste belang.Deze procedure stelde ons in staat om te visualiseren dat de oöcytkern tijdens zijn migratie drie verschillende trajecten kan nemen en dat verschillende organellen deze trajecten binnen de oöcyt reguleren.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Optimalisatie van de wond Scratch Assay om veranderingen in muizen mesenchymale Stromal Cell Migratie Detect Na Schade door Oplosbare sigarettenrook Extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Functionele klonen behulp van een<em&gt; Xenopus</em&gt; Eicel Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogene Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie voor het vergelijken van genexpressie Domeinen in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Methods to Study Mrp4-containing Macromolecular Complexes in the Regulation of Fibroblast Migration

Methoden om-MRP4 bevattende macromoleculaire complexen studie in de verordening van fibroblast migratie

Multidrug resistance protein 4 (MRP4) is a member of the ATP-binding cassette family of membrane transporters and is an endogenous efflux transporter of ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methoden om Onderzoek de lymfeklier en Hemocytes in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Functionele Manipulatie van Maternal Gene producten met behulp van<em&gt; In Vitro</em&gt; Maturatie van zebravis

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissectie en immunefluorescentie kleuring van Mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cel aggregatie testen om te evalueren van de Binding van de Drosophila inkeping met Trans-liganden en haar remming door Cis-liganden

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Visualisatie van tangentiële cel migratie in de ontwikkelingslanden Chick Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Ontdooien, kweken en Cryopreserving van Drosophila cellijnen

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...