Name: nuclear migration in the drosophila oocyte
Uploaded: 2021-05-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte at JoVE.com

Nous sommes extrêmement reconnaissants à Jean-Antoine Lepesant et Nicolas Tissot qui ont développé le protocole à l’origine et partagé avec nous quelques éléments graphiques de la Figure 3. Nous remercions Fanny Roland-Gosselin qui a pris les photos de la figure 4. Nous remercions également les autres membres du laboratoire pour les discussions utiles qui ont contribué à l’amélioration de cette technique et Nathaniel Henneman pour ses commentaires qui ont contribué à améliorer ce manuscrit. Nous reconnaissons l’installation centrale ImagoSeine de l’Institut Jacques Monod, membre de France-BioImaging (ANR-10-INBS-04). Maëlys Loh est soutenu par une bourse de doctorat du ministère de la Recherche de l’Français (MESRI). Antoine Guichet et Fred Bernard ont été soutenus par l’ARC (Grant PJA20181208148), l’Association des Entreprises contre le Cancer (Grant Gefluc 2020 #221366) et par une bourse Emergence d’IdEx Université de Paris (ANR-18-IDEX-0001).

1. Préparation du milieu d’imagerie
<ol><li>Préparez des supports frais le jour de l’utilisation. Pipette 200 μL de milieu Schneider (contenant de la L-Glutamine et 0,40 g/L de NaHCO3 complétée par 10 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur, 100 U/mL de pénicilline et 100 mg/mL de streptomycine).</li>
	<li>Compléter avec 30 μL d’insuline 10 mg/mL.</li>
	<li>Ajouter 4 μL de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur.</li>
</ol>2. Préparation de la chambre ...

<ol>
	<li>Merkle, J. A., Wittes, J., Sch&#252;pbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+between+somatic+follicle+cells+and+the+germline+patterns+the+egg+and+embryo+of+Drosophila.">Signaling between somatic follicle cells and the germline patterns the egg and embryo of Drosophila.</a> Current Topics in Developmental Biology. 140, 55-86 (2020).</li><li>Roth, S., Lynch, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetry+breaking+during+drosophila+oogenesis.">Symmetry breaking during drosophila oogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 001891 (2009).</li><li>Bernard, F., Lepesant, J. -. A., Guichet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleus+positioning+within+Drosophila+egg+chamber.">Nucleus positioning within Drosophila egg chamber.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 82, 25-33 (2017).</li><li>Koch, E. A., Spitzer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+effects+of+colchicine+on+oogenesis+in+Drosophila:+Induced+sterility+and+switch+of+potential+oocyte+to+nurse-cell+developmental+pathway.">Multiple effects of colchicine on oogenesis in Drosophila: Induced sterility and switch of potential oocyte to nurse-cell developmental pathway.</a> Cell and Tissue Research. 228 (1), 21-32 (1983).</li><li>Januschke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrosome-nucleus+complex+and+microtubule+organization+in+the+Drosophila+oocyte.">The centrosome-nucleus complex and microtubule organization in the Drosophila oocyte.</a> Development. 133, 129-139 (2006).</li><li>Tissot, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+molecular+cues+ensure+a+robust+microtubule-dependent+nuclear+positioning+in+the+Drosophila+oocyte.">Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte.</a> Nature Communications. 8, 15168 (2017).</li><li>Cetera, M., Horne-Badovinac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round+and+round+gets+you+somewhere:+collective+cell+migration+and+planar+polarity+in+elongating+Drosophila+egg+chambers.">Round and round gets you somewhere: collective cell migration and planar polarity in elongating Drosophila egg chambers.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 32, 10-15 (2015).</li><li>Hudson, A. M., Petrella, L. N., Tanaka, A. J., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mononuclear+muscle+cells+in+Drosophila+ovaries+revealed+by+GFP+protein+traps.">Mononuclear muscle cells in Drosophila ovaries revealed by GFP protein traps.</a> Developmental Biology. 314, 329-340 (2008).</li><li>Gervais, L., Claret, S., Januschke, J., Roth, S., Guichet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP5K-dependent+production+of+PIP2+sustains+microtubule+organization+to+establish+polarized+transport+in+the+Drosophila+oocyte.">PIP5K-dependent production of PIP2 sustains microtubule organization to establish polarized transport in the Drosophila oocyte.</a> Development. 135 (23), 3829-3838 (2008).</li><li>Vill&#225;nyi, Z., Debec, A., Timinszky, G., Tiri&#225;n, L., Szabad, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+persistence+of+importin-+b+explains+extended+survival+of+cells+and+zygotes+that+lack+the+encoding+gene+'+n+Villa.">Long persistence of importin- b explains extended survival of cells and zygotes that lack the encoding gene ' n Villa.</a> Mechanisms of Development. 3-4 (125), 196-206 (2008).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging.">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), (2012).</li><li>Chanet, S., Huynh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+sorting+requires+contractile+cortical+waves+in+germline+cells.">Collective cell sorting requires contractile cortical waves in germline cells.</a> Current Biology. 30 (21), 4213-4226 (2020).</li><li>Zhao, T., Graham, O. S., Raposo, A., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+microtubules+push+the+oocyte+nucleus+to+polarize+the+drosophila+dorsal-ventral+axis.">Growing microtubules push the oocyte nucleus to polarize the drosophila dorsal-ventral axis.</a> Science. 336 (6084), 999-1003 (2012).</li><li>Legent, K., Tissot, N., Guichet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+7+Oogenesis+using+fixed+and+live+imaging.">Chapter 7 Oogenesis using fixed and live imaging.</a> Drosophila Oogenesis: Methods and Protocols. 1328, 99-112 (2015).</li></ol>

D’autres protocoles décrivent comment préparer et mettre en culture des chambres d’œufs de drosophile ex vivo pour un essai d’imagerie vivante12,13. La nouveauté de ce protocole est l’utilisation d’une chambre d’imagerie construite à l’aide d’une lame en aluminium évidée, d’un couvercle et d’une membrane perméableO2 / CO2. Le principal avantage de cette configuration est de limiter le mouvement en Z sans ...

Depuis plusieurs années, l’ovocyte de la drosophile est devenu un système modèle pour étudier la migration nucléaire. L’ovocyte de la drosophile se développe dans une structure multicellulaire appelée chambre à œufs. Les chambres à ovules englobent 16 cellules germinales (15 cellules nourricières et l’ovocyte) entourées d’une couche épithéliale de cellules somatiques folliculaires. Le développement de la chambre à ovules a été subdivisé en 14 étapes(Figure 1A),au cours desquelles l’ovocyte se développera et accumulera les réserves nécessaires au développement précoce de l’embryon. Au cours du développement, lors de la réorganisation des microtubules et du transport asymétrique des déterminants maternels, l’ovocyte se polarise le long des axes antéro-dorsal et dorso-ventral. Ces axes déterminent les axes de polarité ultérieurs de l’embryon et de l’adulte résultant de la fécondation de cet ovocyte1. Au cours de l’oogenèse, le noyau adopte une position asymétrique dans l’ovocyte. Au stade 6, le noyau est centré dans la cellule. Sur un signal encore à identifier émis par les cellules folliculaires postérieures qui est reçu par l’ovocyte, le noyau migre vers l’intersection entre les membranes plasmiques antérieure et latérale au stade 7 (Figure 1B)2,3. Cette position asymétrique est nécessaire pour induire la détermination de l’axe dorso-ventral.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62688/62688fig1v2.jpg"> Figure 1: Chambres à œufs de Drosophila melanogaster. (A) Ovariole fixe de mouches transgéniques exprimant Fs(2)Ket-GFP qui marque les enveloppes nucléaires et ubi-PH-RFP qui marque les membranes plasmiques. L’ovariole est composée de chambres à œufs en développement à différents stades. La maturation augmente le long de l’axe antéro-postérieur avec le germarium à l’extrémité antérieure (à gauche) où réside la cellule souche germinale et le stade plus ancien à l’extrémité postérieure (à droite). (B) Projection Z de la chambre à œufs vivante par microscopie confocale à disque rotatif au stade 6 de l’oogenèse (à gauche), dans laquelle le noyau est centré dans l’ovocyte. Le noyau migrera pour adopter une position asymétrique au stade 7 (à droite) au contact de la membrane plasmique antérieure (entre l’ovocyte et la cellule nourricière) et de la membrane plasmique latérale (entre l’ovocyte et les cellules folliculaires). Cette position induira la détermination de la face dorsale et, par conséquent, de l’axe dorso-ventral de la chambre à œufs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62688/62688fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Pendant de nombreuses décennies, cette migration nucléaire a été étudiée sur des tissus fixes par immunocoloration. Cette approche a notamment permis de démontrer que ce procédé dépend d’un réseau dense de microtubules4,5. Plus récemment, nous avons développé un protocole proposant des conditions compatibles avec l’imagerie en direct de l’ovocyte pendant plusieurs heures permettant d’étudier ce processus dynamiquement6.
Ainsi, pour la première fois, nous avons pu décrire que le noyau a des trajectoires préférentielles et caractéristiques lors de sa migration, l’une le long de la membrane plasmique antérieure (APM) et l’autre le long de la membrane plasmique latérale (LPM) de l’ovocyte(Figure 2). Ces derniers résultats soulignent l’importance des protocoles d’imagerie en direct lors de l’étude des processus dynamiques tels que la migration nucléaire.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62688/62688fig02.jpg"> Figure 2: Représentation schématique des différentes voies de migration du noyau. Au stade 6 de l’oogenèse, l’ovocyte est une grande cellule avec un noyau central. A ce stade, l’axe de polarité antéro-postérieur est fixé avec une membrane plasmique postérieure/latérale de l’ovocyte en contact avec les cellules folliculaires et la membrane plasmique antérieure (en jaune) est en contact avec les cellules nourricières2. Nous avons précédemment rapporté que le noyau pouvait migrer soit le long de la membrane plasmique antérieure (APM), le long de la membrane plasmique latérale (LPM), soit à travers le cytoplasme (STAD, directement vers le cortex antéro-dorsal)6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62688/62688fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
La migration du noyau ovocytaire est un phénomène d’environ 3 h6, et jusqu’à présent, l’événement déclenchant le début de la migration réelle est inconnu. Le début de la migration peut également être retardé par les mutants protéiques utilisés pour étudier ce mécanisme. Ces variables inconnues nous ont motivés à acquérir des images sur de longues périodes (10-12 h). Il est donc important de s’assurer que les ovocytes restent vivants. Au fur et à mesure que la chambre à œufs se développe, elle s’allonge le long de l’axe antéro-postérieur d’une forme sphérique à une forme elliptique. Cet allongement est entraîné par la rotation des cellules folliculaires, qui se produit du stade 1 au stade 8, perpendiculairement à l’axe antéro-postérieur7. De plus, une gaine tubulaire de muscle à propriété pulsatile entoure les chambres à œufs. Sa fonction physiologique est de pousser les follicules en développement vers l’oviducte en continu8. Afin de limiter les mouvements qui induisent des oscillations des chambres à œufs après leur dissection, nous avons conçu une micro-chambre d’observation mesurant 150 μm de hauteur(Figure 3A). Cette hauteur est légèrement supérieure à la taille d’un follicule aux stades 10 et 11. Il limite considérablement les mouvements verticaux de l’échantillon tout en préservant la rotation de la chambre à œufs, ce qui entraîne des défauts limités dans le développement des follicules. Nous effectuons ensuite une imagerie en direct pendant 12 h sur des chambres à œufs disséquées par des acquisitions time-lapse multi-positions à l’aide d’un microscope confocal à disque rotatif. Nous décrivons ici notre protocole d’étude de la migration nucléaire des ovocytes entre les stades 6 et 7.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62688/62688fig3v3.jpg"> Figure 3: Représentation schématique de la chambre d’observation. (A) (Vue de dessus) Dimensions précises de la glissière en aluminium avec les hauteurs (A') et les circonférences (A'') du puits foré au milieu de la glissière. (B) (Vue du bas) Un couvercle bloquant le puits est scellé à la glissière avec de la graisse de silicium. (C) (Vue de dessus) Les ovarioles disséqués se développent dans un milieu d’imagerie recouvert d’une membrane perméable aux gaz. L’huile d’halocarbure est utilisée pour stabiliser la membrane. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62688/62688fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Afin de suivre la migration nucléaire et d’évaluer avec précision les trajectoires dans l’ovocyte, des marqueurs pour l’enveloppe nucléaire et la membrane plasmique sont nécessaires. Dans ce but, deux transgènes ayant un rapport signal/bruit élevé et ne s’estompant pas au cours de l’imagerie en direct ont été sélectionnés. Pour étiqueter la membrane plasmique, l’utilisation d’un P[ubi-PH-RFP] qui code le domaine d’homologie de Pleckstrin (PH) de la phospholipase humaine C ∂1 (PLC∂1) fusionnée à la RFP est recommandée. Ce domaine PH se lie au phosphoinositide PI(4,5)P2 distribué le long de la membrane plasmique de l’ovocyte9. Pour l’enveloppe nucléaire, la souche piège protéique P[PPT-un1]Fs(2)Ket-GFP où la GFP est insérée dans le gène codant pour la drosophile ß-importine présente un signal homogène et intense10. Les jeunes mouches (âgées de 1 à 2 jours) sont placées dans des flacons frais contenant de la levure sèche 24 à 48 heures avant la dissection des ovaires.
Pour ce test d’imagerie en direct, un morceau d’aluminium de 1 mm d’épaisseur, qui n’est pas réactif pour l’échantillon, a été découpé dans les dimensions d’une lame de microscopie. Il a un trou de 16 mm de diamètre au centre de la glissière qui a été contre-alésé à 0,85 mm. Ce contre-alésage a un trou supplémentaire de 6 mm de diamètre avec une profondeur de 150 μm(Figure 3A). Un couvercle est collé avec de la graisse de silicone (inerte pour l’échantillon) au fond de la chambre en aluminium(Figure 3B). Après avoir placé les échantillons dans le puits rempli de milieu, une membrane perméable à l’échange O2/CO2 est placée sur le milieu et entourée d’huile halocarbonée(Figure 3C).
Pour la dissection, il est recommandé d’utiliser des pinces en acier inoxydable d’une dimension de pointe de 0,05 x 0,02 mm et des aiguilles de 0,20 mm de diamètre pour la séparation des ovarioles (Figure 4B, C). Les noyaux migrateurs sont imagés sur un microscope confocal inversé à disque rotatif CSU-X1 équipé d’une caméra. Les images multi-positions ont été acquises par time-lapse toutes les 15 minutes à 24 °C. Un intervalle de 15 minutes permet d’effectuer des acquisitions multi-positions avec un photobleachage limité des protéines fluorescentes et une phototoxicité pour les échantillons. En outre, un intervalle plus court ne fournirait pas beaucoup plus de données informatives pour suivre les trajectoires nucléaires. Les films sont traités et analysés via le logiciel Fidji11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthetize CO2 pad</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>789060</td>
			<td>Anesthetize flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip (24x50 mm)</td>
			<td>Knittel Glass</td>
			<td>VD12450Y100A</td>
			<td>Observation-chamber preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Dumont #5</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K342.1</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel needles</td>
			<td>Entosphinx</td>
			<td>20</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated fetal calf serum</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>F7524</td>
			<td>Imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin solution bovine pancreas</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>10516 - 5ml</td>
			<td>Imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/Streptomycin solution</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P0781</td>
			<td>Imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permeable membrane</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11521746</td>
			<td>Observation-chamber preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider Medium</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P04-91500</td>
			<td>Imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon grease</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>335148</td>
			<td>Observation-chamber preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disk confocal</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td>Nuclear migration observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltalef oil 10S</td>
			<td>VWR</td>
			<td>24627 - 188</td>
			<td>Observation-chamber preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nuclear migration in the drosophila oocyte

L’imagerie des cellules vivantes est particulièrement nécessaire pour comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires qui régulent les mouvements des organites, les réarrangements du cytosquelette ou les modèles de polarité dans les cellules. Lors de l’étude du positionnement du noyau ovocytaire, les techniques d’imagerie en direct sont essentielles pour capturer les événements dynamiques de ce processus. La chambre à œufs de la drosophile est une structure multicellulaire et un excellent système modèle pour étudier ce phénomène en raison de sa grande taille et de la disponibilité de nombreux outils génétiques. Au cours de la mi-oogenèse de la drosophile, le noyau migre d’une position centrale dans l’ovocyte pour adopter une position asymétrique médiée par des forces générées par des microtubules. Cette migration et ce positionnement du noyau sont nécessaires pour déterminer les axes de polarité de l’embryon et de la mouche adulte suivante. L’une des caractéristiques de cette migration est qu’elle se produit en trois dimensions (3D), ce qui crée une nécessité pour l’imagerie en direct. Ainsi, pour étudier les mécanismes qui régulent la migration nucléaire, nous avons développé un protocole pour mettre en culture les chambres à œufs disséquées et effectuer une imagerie en direct pendant 12 h par acquisitions time-lapse à l’aide de la microscopie confocale à disque rotatif. Dans l’ensemble, nos conditions nous permettent de préserver les chambres à œufs de la drosophile vivante pendant une longue période, permettant ainsi de visualiser l’achèvement de la migration nucléaire dans un grand nombre d’échantillons en 3D.

Avant la migration, le noyau est dynamique et oscille autour d’une position centrale pendant une période définie comme pré-migration. Ces petits mouvements reflètent un équilibre de forces de poussée et de traction qui maintiennent l’équilibre au milieu de l’ovocyte. En quantifiant les trajectoires des noyaux, nous avons montré que les trajectoires APM et LPM avaient des proportions similaires. On définit la nature de la trajectoire par le premier contact entre le noyau et la membraneplas...

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Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte

Chez la drosophile,le noyau de l’ovocyte subit une migration dépendante des microtubules au cours de l’oogenèse. Ici, nous décrivons un protocole qui a été développé pour suivre la migration en effectuant une imagerie en direct sur des chambres d’œufs ex-vivo. Notre procédure maintient les chambres à œufs en vie pendant 12 h pour acquérir des films time-lapse 3D multi-positions en utilisant la microscopie confocale à disque rotatif.

Migration nucléaire dans l’ovocyte de la drosophile

Live cell imaging is particularly necessary to understand the cellular and molecular mechanisms that regulate organelle movements, cytoskeleton ...

Cette technique permet d’observer de longs processus biologiques dans des chambres à œufs de drosophile disséquées, tels que la migration nucléaire des ovocytes, en utilisant la microscopie d’imagerie vivante. Ce protocole décrit comment maintenir les chambres à œufs disséquées en vie pendant 12 heures pour effectuer une microscopie d’imagerie en direct. Pour commencer, pipettez 200 microlitres de Schneider Medium et complétez avec 30 microlitres de 10 milligrammes par millilitre d’insuline, puis ajoutez quatre microlitres de sérum de veau fœtal inactivé à la chaleur.Utilisez une pointe de pipette pour appliquer une petite quantité de graisse de silicone tout autour du trou sur la face inférieure de la glissière perforée. Positionnez un couvercle et utilisez l’extrémité large d’une pointe de pipette pour appliquer une pression sur le couvercle afin d’aplatir la graisse de silicone afin de créer un anneau en silicone à l’intérieur de la glissière. Transférer les mouches femelles anesthésiées dans le puits de dissection contenant 150 microlitres du milieu imageur.Pour disséquer la femelle, utilisez la pince pour saisir le thorax et pincer la cuticule de l’abdomen dorsal avec une deuxième paire de pinces. Retirez soigneusement l’utérus, l’oviducte et la gaine musculaire. Isolez et détachez la paire d’ovaires visible sur l’ouverture de la cuticule.Placez une goutte de 10 à 15 microlitres du milieu imageur sur les ovaires et transférez un ovaire dans la chambre d’imagerie. Pour séparer les ovarioles, utilisez l’aiguille pour maintenir l’extrémité postérieure de l’ovaire. Utilisez une autre aiguille pour tirer soigneusement le germarium pour taquiner les ovarioles.Tenez la gaine avec une aiguille et tirez l’ovariole à travers les plus grandes chambres avec une autre aiguille pour enlever la gaine musculaire restante sur les chambres à œufs. Laissez l’ovariole non gainée couler et entrer en contact avec le couvercle. Retirez les derniers stades et le reste des ovaires de la microchambre à l’aide d’une pince.Utilisez des aiguilles pour éloigner soigneusement les ovarioles afin de faciliter l’acquisition. Coupez un petit carré de 10 par 10 millimètres de la membrane perméable. Appliquez soigneusement la membrane sur le dessus du support d’imagerie pour expulser les bulles d’air.Ensuite, scellez hermétiquement la chambre avec une fine couche d’huile d’halocarbure autour du puits sur le contour de la membrane. Placez la configuration d’imagerie sur le support de diapositive du microscope inversé et utilisez un objectif 40X. La migration du noyau ovocytaire d’une chambre à œufs de type sauvage a été capturée à l’aide de la microscopie d’imagerie vivante.Le noyau atteint soit la membrane plasmique antérieure, soit la membrane plasmique latérale avant de glisser le long des trajectoires pour atteindre sa position finale à l’intersection des deux membranes plasmiques. Les déformations membranaires, les cellules folliculaires désorganisées, les cellules rabougries et les noyaux rétrécis sont les premiers signes de la mort des chambres à œufs. L’ovocyte dégénéré avant huit heures d’imagerie n’est généralement pas détecté.Cependant, de rares cas de dégénérescence précoce sont dus à des problèmes lors des étapes de dissection ou de montage. Endommager les chambres à œufs compromet leur survie. La dissection délicate à la main précise et la préparation de la microchambre sont donc primordiales.Cette procédure nous a permis de visualiser que le noyau de l’ovocyte peut prendre trois trajectoires différentes lors de sa migration et que différents organites régulent ces trajectoires au sein de l’ovocyte.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Optimisation du dosage Blessure Scratch pour détecter les changements dans murin mésenchymateuses stromales migration cellulaire Après Dommages par Soluble Extrait Cigarette Smoke

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

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Manipulation fonctionnelle du gène maternel Produits utilisant<em&gt; In vitro</em&gt; Ovocyte Maturation en Zebrafish

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection et immunofluorescence souillant de champignon corps et photorécepteur de neurones dans le cerveau adulte Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cellule des épreuves d’agrégation pour évaluer la liaison de l’encoche de la drosophile avec Trans-Ligands et son Inhibition par Cis-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Visualisation de la Migration cellulaire tangentielle dans le Tectum optique de poussin en développement

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Dégel, cultivant et cryoconservation des lignées de cellules de drosophile

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...