Name: nuclear migration in the drosophila oocyte
Uploaded: 2021-05-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte at JoVE.com

Мы чрезвычайно благодарны Жану-Антуану Лепесанту и Николя Тиссо, которые первоначально разработали протокол и поделились с нами некоторыми графическими элементами рисунка 3. Мы благодарим Фанни Роланд-Госселин, которая сделала фотографии рисунка 4. Мы также благодарим других членов лаборатории за полезные обсуждения, которые способствовали улучшению этой техники, и Натаниэля Хеннемана за его комментарии, которые помогли улучшить эту рукопись. Мы выражаем признательность за базовую установку ImagoSeine Института Жака Моно, члена France-BioImaging (ANR-10-INBS-04). Маэли Ло поддерживается стипендией PhD от Министерства исследований Франции (MESRI). Антуан Гише и Фред Бернар были поддержаны ARC (Grant PJA20181208148), Ассоциацией предприятий против рака (Grant Gefluc 2020 #221366) и грантом Emergence от IdEx Université de Paris (ANR-18-IDEX-0001).

1. Подготовка среды визуализации
<ol><li>Приготовьте свежие средства в день использования. Пипетка 200 мкл среды Schneider (содержащая L-глютамин и 0,40 г/л NaHCO3, дополненная 10% термоинактивированной сывороткой для телят плода, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина).</li>
	<li>Добавка с 30 мкл ...

<ol>
	<li>Merkle, J. A., Wittes, J., Sch&#252;pbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+between+somatic+follicle+cells+and+the+germline+patterns+the+egg+and+embryo+of+Drosophila.">Signaling between somatic follicle cells and the germline patterns the egg and embryo of Drosophila.</a> Current Topics in Developmental Biology. 140, 55-86 (2020).</li><li>Roth, S., Lynch, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetry+breaking+during+drosophila+oogenesis.">Symmetry breaking during drosophila oogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 001891 (2009).</li><li>Bernard, F., Lepesant, J. -. A., Guichet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleus+positioning+within+Drosophila+egg+chamber.">Nucleus positioning within Drosophila egg chamber.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 82, 25-33 (2017).</li><li>Koch, E. A., Spitzer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+effects+of+colchicine+on+oogenesis+in+Drosophila:+Induced+sterility+and+switch+of+potential+oocyte+to+nurse-cell+developmental+pathway.">Multiple effects of colchicine on oogenesis in Drosophila: Induced sterility and switch of potential oocyte to nurse-cell developmental pathway.</a> Cell and Tissue Research. 228 (1), 21-32 (1983).</li><li>Januschke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrosome-nucleus+complex+and+microtubule+organization+in+the+Drosophila+oocyte.">The centrosome-nucleus complex and microtubule organization in the Drosophila oocyte.</a> Development. 133, 129-139 (2006).</li><li>Tissot, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+molecular+cues+ensure+a+robust+microtubule-dependent+nuclear+positioning+in+the+Drosophila+oocyte.">Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte.</a> Nature Communications. 8, 15168 (2017).</li><li>Cetera, M., Horne-Badovinac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round+and+round+gets+you+somewhere:+collective+cell+migration+and+planar+polarity+in+elongating+Drosophila+egg+chambers.">Round and round gets you somewhere: collective cell migration and planar polarity in elongating Drosophila egg chambers.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 32, 10-15 (2015).</li><li>Hudson, A. M., Petrella, L. N., Tanaka, A. J., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mononuclear+muscle+cells+in+Drosophila+ovaries+revealed+by+GFP+protein+traps.">Mononuclear muscle cells in Drosophila ovaries revealed by GFP protein traps.</a> Developmental Biology. 314, 329-340 (2008).</li><li>Gervais, L., Claret, S., Januschke, J., Roth, S., Guichet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP5K-dependent+production+of+PIP2+sustains+microtubule+organization+to+establish+polarized+transport+in+the+Drosophila+oocyte.">PIP5K-dependent production of PIP2 sustains microtubule organization to establish polarized transport in the Drosophila oocyte.</a> Development. 135 (23), 3829-3838 (2008).</li><li>Vill&#225;nyi, Z., Debec, A., Timinszky, G., Tiri&#225;n, L., Szabad, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+persistence+of+importin-+b+explains+extended+survival+of+cells+and+zygotes+that+lack+the+encoding+gene+'+n+Villa.">Long persistence of importin- b explains extended survival of cells and zygotes that lack the encoding gene ' n Villa.</a> Mechanisms of Development. 3-4 (125), 196-206 (2008).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging.">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), (2012).</li><li>Chanet, S., Huynh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+sorting+requires+contractile+cortical+waves+in+germline+cells.">Collective cell sorting requires contractile cortical waves in germline cells.</a> Current Biology. 30 (21), 4213-4226 (2020).</li><li>Zhao, T., Graham, O. S., Raposo, A., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+microtubules+push+the+oocyte+nucleus+to+polarize+the+drosophila+dorsal-ventral+axis.">Growing microtubules push the oocyte nucleus to polarize the drosophila dorsal-ventral axis.</a> Science. 336 (6084), 999-1003 (2012).</li><li>Legent, K., Tissot, N., Guichet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+7+Oogenesis+using+fixed+and+live+imaging.">Chapter 7 Oogenesis using fixed and live imaging.</a> Drosophila Oogenesis: Methods and Protocols. 1328, 99-112 (2015).</li></ol>

Другие протоколы описывают, как подготовить и культивировать камеры яиц дрозофилы ex vivo для анализа живой визуализации12,13. Новизна этого протокола заключается в использовании камеры визуализации, построенной с использованием полого алюминиевого с?...

В течение нескольких лет ооцит дрозофилы появился в качестве модельной системы для изучения ядерной миграции. Ооцит дрозофилы развивается в многоклеточной структуре, называемой камерой яйцеклетки. Яйцеклетки охватывают 16 половых клеток (15 клеток-кормилиц и яйцеклетку), окруженных эпителиальным слоем фолликулярных соматических клеток. Развитие яичной камеры было подразделено на 14 стадий(рисунок 1А),в ходе которых яйцеклетка будет расти и накапливать запасы, необходимые для раннего развития эмбриона. При развитии, при реорганизации микротрубочек и асимметричном переносе материнских детерминант, ооцит поляризуется по антеродорсальной и дорсо-вентральной осям. Эти оси определяют последующие оси полярности эмбриона и взрослого человека, возникающие в результате оплодотворения этой яйцеклетки1. Во время оогенеза ядро принимает асимметричное положение в ооците. На стадии 6 ядро центрируется в клетке. После еще не идентифицированного сигнала, излучаемого задними фолликулярными клетками, который принимается яйцеклеткой, ядро мигрирует к пересечению передней и боковой плазматических мембран на стадии 7(Рисунок 1B)2,3. Это асимметричное положение требуется для того, чтобы вызвать определение дорсо-вентральной оси.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62688/62688fig1v2.jpg"> Рисунок 1:Камеры яиц Drosophila melanogaster. ( A )Фиксированныйовариол от трансгенных мух, экспрессивляющих Fs(2)Ket-GFP, который маркирует ядерные оболочки и ubi-PH-RFP, который маркирует плазматические мембраны. Овариол состоит из развивающихся яйцеклеток на разных стадиях. Созревание увеличивается вдоль передне-задней оси с гермарием на переднем кончике (слева), где находится зародышевая стволовая клетка, и более старой стадией на заднем кончике (справа). (B)Z-проекция живой яйцеклетки методом вращающейся дисковой конфокальной микроскопии на 6 стадии оогенеза (слева), при которой ядро центрируется в ооците. Ядро будет мигрировать, чтобы принять асимметричное положение на стадии 7 (справа) в контакте с передней плазматической мембраной (между яйцеклеткой и клеткой медсестры) и боковой плазматической мембраной (между яйцеклеткой и фолликулярными клетками). Это положение будет стимулировать определение дорсальной стороны и, таким образом, дорсо-вентральной оси яйцеклеточной камеры. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62688/62688fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
В течение многих десятилетий эта ядерная миграция изучалась на фиксированных тканях путем иммуноокрашивания. Такой подход позволил, в частности, продемонстрировать, что этот процесс зависит от плотной сети микротрубочек4,5. Совсем недавно мы разработали протокол, предлагающий условия, совместимые с живой визуализацией ооцита в течение нескольких часов, что позволяет динамически изучать этот процесс6.
Следовательно, впервые мы смогли описать, что ядро имеет предпочтительные и характерные траектории во время своей миграции, одну вдоль передней плазматической мембраны (APM), а другую вдоль боковой плазматической мембраны (LPM) ооцита(Рисунок 2). Эти последние результаты подчеркивают важность протоколов визуализации в реальном времени при изучении динамических процессов, таких как ядерная миграция.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62688/62688fig02.jpg"> Рисунок 2:Схематическое представление различных путей миграции ядра. На 6 стадии оогенеза яйцеклетка представляет собой крупную клетку с центральным ядром. На этом этапе передне-задняя ось полярности устанавливается с задней/латеральной плазматической мембраной ооцита, контактиим с фолликулярными клетками, а передняя плазматическая мембрана (желтого цвета) контактирует с клетками медсестры2. Ранее мы сообщали, что ядро может мигрировать либо вдоль передней плазматической мембраны (APM), вдоль боковой плазматической мембраны (LPM), либо через цитоплазму (STAD, прямо в антеродоральную кору)6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62688/62688fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Миграция ядра ооцитов представляет собой явление около 3 ч6,и до сих пор событие, вызывающее начало фактической миграции, неизвестно. Начало миграции также может быть отложено белковыми мутантами, используемыми для изучения этого механизма. Эти неизвестные переменные мотивировали нас получать изображения в течение длительных периодов времени (10-12 ч). Поэтому важно обеспечить, чтобы ооциты оставались живыми. По мере развития яичной камеры она удлиняется вдоль антеро-задней оси от сферической до эллиптической формы. Это удлинение обусловлено вращением фолликулярных клеток, которое происходит от стадии 1 до стадии 8, перпендикулярной антеро-задней оси7. Кроме того, трубчатая оболочка мышц с пульсирующим свойством окружает яйцеклетки камеры. Его физиологическая функция заключается в том, чтобы подталкивать развивающиеся фолликулы к яйцеводу непрерывно8. Чтобы ограничить движения, которые вызывают колебания яичных камер после их рассечения, мы разработали наблюдательную микрокамеру высотой 150 мкм(рисунок 3А). Эта высота незначительно превышает размер фолликула на стадиях 10 и 11. Это значительно ограничивает вертикальные движения образца, сохраняя при этом вращение яйцеклеточной камеры, что приводит к ограниченным дефектам в развитии фолликулов. Затем мы выполняем живую визуализацию в течение 12 часов на расчлененных яйцеклетках с помощью многопозиционных покадровых захватов с использованием конфокального микроскопа со вращающимся диском. Здесь мы описываем наш протокол изучения миграции ядер ооцитов между стадиями 6 и 7.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62688/62688fig3v3.jpg"> Рисунок 3:Схематическое изображение камеры наблюдения. (A) (Вид сверху) Точные размеры алюминиевой горки с высотой (A') и окружностью (A'') скважины, пробуренной в середине слайда. (B) (Вид снизу) Крышка, блокирующая скважину, герметизирована к слайду силиконовой смазкой. (C)(Вид сверху) Рассеченные яриоли развиваются в среде визуализации, которая покрыта газопроницаемой мембраной. Галогенуглеродное масло используется для стабилизации мембраны. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62688/62688fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Чтобы проследить за ядерной миграцией и точно оценить траектории в ооците, необходимы маркеры как для ядерной оболочки, так и для плазматической мембраны. С этой целью были выбраны два трансгена, которые имеют высокое соотношение сигнал/шум и не исчезают в ходе живой визуализации. Для маркировки плазматической мембраны рекомендуется использовать P[ubi-PH-RFP], который кодирует домен гомологии Плекстрина (PH) фосфолипазы человека C ∂1 (PLC∂1), слитой с RFP. Этот домен PH связывается с фосфоинозитидом PI(4,5)P2, распределенным вдоль плазматической мембраны ооцита9. Для ядерной оболочки штамм P[PPT-un1]Fs(2)Ket-GFP, где GFP вставлен в ген, кодирующий Drosophila ß-importin, отображает однородный и интенсивный сигнал10. Молодых мух (1-2 дня) помещают в свежие флаконы, содержащие сухие дрожжи, за 24-48 ч до рассечения яичники.
Для этого анализа в реальном времени кусок алюминия толщиной 1 мм, который не является реактивным для образца, был разрезан на размеры слайда микроскопии. Он имеет отверстие диаметром 16 мм в центре затвора, которое было уравнёно до 0,85 мм. Этот контрбор имеет дополнительное отверстие диаметром 6 мм глубиной 150 мкм(рисунок 3А). Крышка наклеивается силиконовой смазкой (инертной для образца) на дно алюминиевой камеры(рисунок 3B). После помещения образцов в заполненную средой скважину над средой помещают мембрану, проницаемую для обменаO2/CO2 и окружают галогенуглеродным маслом(рис. 3С).
Для рассечения рекомендуется использовать щипцы из нержавеющей стали с размером наконечника 0,05 х 0,02 мм и иглы диаметром 0,20 мм для разделения яриолов(рис. 4В,С). Мигрирующие ядра визуалируются на вращающийся диск конфокального инвертированного микроскопа CSU-X1, оснащенного камерой. Многопозиционные изображения были получены с помощью покадровой съемки каждые 15 минут при 24 °C. Интервал в 15 минут позволяет выполнять многопозиционные захваты с ограниченным фотоотбеливанием флуоресцентных белков и фототоксичностью для образцов. Кроме того, более короткий интервал не даст гораздо более информативных данных для отслеживания ядерных траекторий. Фильмы обрабатываются и анализируются с помощью программного обеспечения Fiji11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthetize CO2 pad</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>789060</td>
			<td>Anesthetize flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip (24x50 mm)</td>
			<td>Knittel Glass</td>
			<td>VD12450Y100A</td>
			<td>Observation-chamber preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Dumont #5</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K342.1</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel needles</td>
			<td>Entosphinx</td>
			<td>20</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated fetal calf serum</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>F7524</td>
			<td>Imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin solution bovine pancreas</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>10516 - 5ml</td>
			<td>Imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/Streptomycin solution</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P0781</td>
			<td>Imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permeable membrane</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11521746</td>
			<td>Observation-chamber preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider Medium</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P04-91500</td>
			<td>Imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon grease</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>335148</td>
			<td>Observation-chamber preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disk confocal</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td>Nuclear migration observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltalef oil 10S</td>
			<td>VWR</td>
			<td>24627 - 188</td>
			<td>Observation-chamber preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nuclear migration in the drosophila oocyte

Визуализация живых клеток особенно необходима для понимания клеточных и молекулярных механизмов, которые регулируют движения органелл, перестройки цитоскелетов или паттерны полярности внутри клеток. При изучении позиционирования ядра ооцита методы визуализации в реальном времени необходимы для захвата динамических событий этого процесса. Яичная камера дрозофилы представляет собой многоклеточную структуру и отличную модельную систему для изучения этого явления из-за ее большого размера и наличия многочисленных генетических инструментов. Во время среднего оогенеза дрозофилы ядро мигрирует из центрального положения в ооците, чтобы принять асимметричное положение, опосредованное силами, генерируемыми микротрубочами. Такая миграция и позиционирование ядра необходимы для определения осей полярности эмбриона и последующей взрослой мухи. Одной из характеристик этой миграции является то, что она происходит в трех измерениях (3D), создавая необходимость для живой визуализации. Таким образом, для изучения механизмов, регулирующих ядерную миграцию, мы разработали протокол культивирования расчлененных яйцеклеток и выполнения живой визуализации в течение 12 ч путем покадровых приобретений с использованием конфокальной микроскопии со спиннинговым диском. В целом, наши условия позволяют нам сохранять яйцеклетки дрозофилы живыми в течение длительного периода времени, тем самым позволяя визуализировать завершение ядерной миграции в большом количестве образцов в 3D.

До миграции ядро является динамичным и колеблется вокруг центрального положения в течение периода, определяемого как предмиграции. Эти небольшие движения отражают баланс толкающих и тянущих сил, которые поддерживают равновесие в середине ооцита. Количественно измещая траектории яде...

Watch this Scientific Journal Video about Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte at JoVE.com

Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte

При дрозофилеядро ооцита подвергается микротрубочезависимой миграции во время оогенеза. Здесь мы описываем протокол, который был разработан для отслеживания миграции путем выполнения живой визуализации на камерах яиц ex-vivo. Наша процедура поддерживает яйцеклетки живыми в течение 12 часов для получения многопозиционных 3D-покадровых фильмов с использованием конфокальной микроскопии с вращающимся диском.

Ядерная миграция в ооците дрозофилы

Live cell imaging is particularly necessary to understand the cellular and molecular mechanisms that regulate organelle movements, cytoskeleton ...

Этот метод позволяет наблюдать длительные биологические процессы в расццененных камерах яйцеклеток дрозофилы, такие как миграция ядер ооцитов, с помощью живой визуализационной микроскопии. Этот протокол описывает, как поддерживать рассеченные яйцеклетки живыми в течение 12 часов для выполнения микроскопии в реальном времени. Для начала пипетка 200 микролитров Schneider Medium и дополнение 30 микролитров по 10 миллиграммов на миллилитр инсулина, затем добавляют четыре микролитра инактивированной теплой икроножной сыворотки плода.Используйте наконечник пипетки, чтобы нанести небольшое количество силиконовой смазки по всему отверстию на нижней стороне проколотого слайда. Расположите крышку и используйте широкий конец наконечника пипетки, чтобы оказать давление на крышку, чтобы сгладить силиконовую смазку для создания силиконового кольца внутри слайда. Перенесите обезболенную самку мух в рассекающий колодец, содержащий 150 микролитров среды визуализации.Для рассечения самки используйте щипцы, чтобы схватить грудную клетку и зажать дорсальную кутикулу живота второй парой щипцов. Осторожно удалите матку, яйцевод и мышечную оболочку. Изолируйте и отсоедините пару яичников, видимых на отверстии кутикулы.Поместите каплю от 10 до 15 микролитров среды визуализации на яичники и перенесите один яичник в камеру визуализации. Для отделения яриолов используйте иглу, чтобы удерживать задний конец яичники. Используйте другую иглу, чтобы осторожно вытащить гермарий для поддразнивания яриолов.Удерживайте оболочку одной иглой и протяните овариол через более крупные камеры другой иглой, чтобы удалить оставшуюся мышечную оболочку на яйцеклетках. Позвольте овариолу без обшивки опуститься и соприкоснуться с крышкой. Удалите поздние стадии и остальную часть яичников из микрокамеры с помощью щипцов.Используйте иглы, чтобы тщательно дистанцировать овариоли, чтобы облегчить приобретение. Вырежьте небольшой квадрат проницаемой мембраны 10 на 10 миллиметров. Осторожно нанесите мембрану на верхнюю часть среды визуализации, чтобы изгнать любые пузырьки воздуха.Затем герметично запечатайте камеру тонким слоем галокарбонового масла вокруг скважины по контуру мембраны. Поместите настройку визуализации на держатель слайда перевернутого микроскопа и используйте объектив 40X. Миграция ядра яйцеклетки дикого типа была зафиксирована с помощью живой визуализационной микроскопии.Ядро достигает либо передней плазматической мембраны, либо боковой плазматической мембраны, прежде чем скользить по траекториям, чтобы достичь своего конечного положения на пересечении двух плазматических мембран. Деформации мембран, дезорганизованные фолликулярные клетки, задержка в прорастая клетках и сморщенные ядра являются первыми признаками умирания яйцеклеток. Дегенерированная яйцеклетка до восьми часов визуализации обычно не обнаруживается.Однако редкие случаи ранней дегенерации обусловлены проблемами во время рассечения или монтажных этапов. Повреждение яичных камер ставит под угрозу их выживание. Поэтому тонкая рука, точное рассечение и подготовка микрокамеры имеют первостепенное значение.Эта процедура позволила нам визуализировать, что ядро ооцита может принимать три разные траектории во время своей миграции, и разные органеллы регулируют эти траектории внутри ооцита.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Оптимизация раны царапинам анализе для обнаружения изменений в мышиной мезенхимальных стромальных клеток миграции после повреждения по растворимый экстракт сигаретного дыма

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Функциональная Клонирование Использование<em&gt; Xenopus</em&gt; Ооцитов выражение системы

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Мульти-целевой Хромогенный Всего монтажа<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация для сравнения экспрессии генов доменов в<em&gt; Drosophila</em&gt; Эмбрионы

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Methods to Study Mrp4-containing Macromolecular Complexes in the Regulation of Fibroblast Migration

Методы исследования Mrp4 содержащих макромолекулярных комплексов в регуляции миграции фибробластов

Multidrug resistance protein 4 (MRP4) is a member of the ATP-binding cassette family of membrane transporters and is an endogenous efflux transporter of ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Методы Изучить лимфа железой и гемоцитах в<em&gt; Drosophila</em&gt; личинки

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Функциональная Манипуляция материнских генных продуктов с помощью<em&gt; In Vitro</em&gt; Созревание ооцитов в данио рерио

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Рассечение и Immunofluorescent окрашивание гриб тело и фоторецепторных нейронов в мозге взрослого Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Сотовый агрегации анализов для оценки привязки дрозофилы паз с транс-лигандов и его ингибирование СНГ-лигандами

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Визуализация тангенциальная клеток миграции в развивающихся куриных оптические Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Размораживание, культивирования и Cryopreserving дрозофила клеточных линий

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...