Name: nuclear migration in the drosophila oocyte
Uploaded: 2021-05-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte at JoVE.com

Vi är oerhört tacksamma mot Jean-Antoine Lepesant och Nicolas Tissot som ursprungligen utvecklade protokollet och delade några grafiska element i figur 3 med oss. Vi tackar Fanny Roland-Gosselin som tog bilderna på figur 4. Vi tackar också andra labbmedlemmar för hjälpsamma diskussioner som bidrog till förbättringen av denna teknik och Nathaniel Henneman för hans kommentarer som hjälpte till att förbättra detta manuskript. Vi erkänner ImagoSeine kärnanläggningen vid institutet Jacques Monod, medlem av France-BioImaging (ANR-10-INBS-04). Maëlys Loh stöds av ett doktorandstipendium från det franska forskningsministeriet (MESRI). Antoine Guichet och Fred Bernard stöddes av ARC (Grant PJA20181208148), Association des Entreprises contre le Cancer (Grant Gefluc 2020 #221366) och av ett Emergence-bidrag från IdEx Université de Paris (ANR-18-IDEX-0001).

1. Förberedelse av bildmedium
<ol><li>Förbered nya medier på användningsdagen. Pipett 200 μL Schneider medium (innehållande L-glutamin och 0,40 g/L NaHCO3 kompletterad med 10% värmeinaktiverat fosterkalvserum, 100 U/ml penicillin och 100 mg/ml streptomycin).</li>
	<li>Tillägg med 30 μL insulin 10 mg/ml.</li>
	<li>Tillsätt 4 μL värmeinaktiverat fosterkalvserum.</li>
</ol>2. Förberedelse av observationskammare
<ol><li>Applicera en liten mängd silikonfett runt hålet på ...

<ol>
	<li>Merkle, J. A., Wittes, J., Sch&#252;pbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+between+somatic+follicle+cells+and+the+germline+patterns+the+egg+and+embryo+of+Drosophila.">Signaling between somatic follicle cells and the germline patterns the egg and embryo of Drosophila.</a> Current Topics in Developmental Biology. 140, 55-86 (2020).</li><li>Roth, S., Lynch, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetry+breaking+during+drosophila+oogenesis.">Symmetry breaking during drosophila oogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 001891 (2009).</li><li>Bernard, F., Lepesant, J. -. A., Guichet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleus+positioning+within+Drosophila+egg+chamber.">Nucleus positioning within Drosophila egg chamber.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 82, 25-33 (2017).</li><li>Koch, E. A., Spitzer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+effects+of+colchicine+on+oogenesis+in+Drosophila:+Induced+sterility+and+switch+of+potential+oocyte+to+nurse-cell+developmental+pathway.">Multiple effects of colchicine on oogenesis in Drosophila: Induced sterility and switch of potential oocyte to nurse-cell developmental pathway.</a> Cell and Tissue Research. 228 (1), 21-32 (1983).</li><li>Januschke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrosome-nucleus+complex+and+microtubule+organization+in+the+Drosophila+oocyte.">The centrosome-nucleus complex and microtubule organization in the Drosophila oocyte.</a> Development. 133, 129-139 (2006).</li><li>Tissot, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+molecular+cues+ensure+a+robust+microtubule-dependent+nuclear+positioning+in+the+Drosophila+oocyte.">Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte.</a> Nature Communications. 8, 15168 (2017).</li><li>Cetera, M., Horne-Badovinac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round+and+round+gets+you+somewhere:+collective+cell+migration+and+planar+polarity+in+elongating+Drosophila+egg+chambers.">Round and round gets you somewhere: collective cell migration and planar polarity in elongating Drosophila egg chambers.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 32, 10-15 (2015).</li><li>Hudson, A. M., Petrella, L. N., Tanaka, A. J., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mononuclear+muscle+cells+in+Drosophila+ovaries+revealed+by+GFP+protein+traps.">Mononuclear muscle cells in Drosophila ovaries revealed by GFP protein traps.</a> Developmental Biology. 314, 329-340 (2008).</li><li>Gervais, L., Claret, S., Januschke, J., Roth, S., Guichet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP5K-dependent+production+of+PIP2+sustains+microtubule+organization+to+establish+polarized+transport+in+the+Drosophila+oocyte.">PIP5K-dependent production of PIP2 sustains microtubule organization to establish polarized transport in the Drosophila oocyte.</a> Development. 135 (23), 3829-3838 (2008).</li><li>Vill&#225;nyi, Z., Debec, A., Timinszky, G., Tiri&#225;n, L., Szabad, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+persistence+of+importin-+b+explains+extended+survival+of+cells+and+zygotes+that+lack+the+encoding+gene+'+n+Villa.">Long persistence of importin- b explains extended survival of cells and zygotes that lack the encoding gene ' n Villa.</a> Mechanisms of Development. 3-4 (125), 196-206 (2008).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging.">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), (2012).</li><li>Chanet, S., Huynh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+sorting+requires+contractile+cortical+waves+in+germline+cells.">Collective cell sorting requires contractile cortical waves in germline cells.</a> Current Biology. 30 (21), 4213-4226 (2020).</li><li>Zhao, T., Graham, O. S., Raposo, A., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+microtubules+push+the+oocyte+nucleus+to+polarize+the+drosophila+dorsal-ventral+axis.">Growing microtubules push the oocyte nucleus to polarize the drosophila dorsal-ventral axis.</a> Science. 336 (6084), 999-1003 (2012).</li><li>Legent, K., Tissot, N., Guichet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+7+Oogenesis+using+fixed+and+live+imaging.">Chapter 7 Oogenesis using fixed and live imaging.</a> Drosophila Oogenesis: Methods and Protocols. 1328, 99-112 (2015).</li></ol>

Andra protokoll beskriver hur man förbereder och odlar Drosophila äggkammare ex vivo för live-imaging assay12,13. Nyheten med detta protokoll är användningen av en bildkammare konstruerad med hjälp av en ihålig aluminiumrutschbana, ett täckglas och ett O2/ CO2 genomsläppligt membran. Den största fördelen med denna uppsättning är att begränsa rörelsen i Z utan att utöva tryck på provet. Således kan äggcellen fortfa...

I flera år har Drosophila-äggoiden dykt upp som ett modellsystem för att studera nukleär migration. Drosophila oocyte utvecklas i en multicellulär struktur som kallas äggkammaren. Äggkammare omfattar 16 könsceller (15 sjuksköterskeceller och oocyt) omgivna av ett epiteliallager av follikulära somatiska celler. Äggkammarutvecklingen har delats in i 14 steg (figur 1A), under vilken äggcellen kommer att växa och ackumulera reserver som är nödvändiga för embryots tidiga utveckling. Under utvecklingen, vid mikrotubule omorganisering och asymmetrisk transport av moderns bestämningsfaktorer, polariseras oocyten längs antero-dorsala och dorso-ventrala axlar. Dessa axlar bestämmer embryots och den vuxnas efterföljande polaritetsaxlar som härrör från befruktningen av denna oocyt1. Under oogenes antar kärnan en asymmetrisk position i äggcellen. I steg 6 är kärnan centrerad i cellen. Vid en ännu inte identifierad signal som avges av de bakre follikulära cellerna och som tas emot av äggcellen migrerar kärnan mot skärningspunkten mellan de främre och laterala plasmamembranen i steg 7 (figur 1B)2,3. Denna asymmetriska position krävs för att inducera bestämningen av dorso-ventralaxeln.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62688/62688fig1v2.jpg"> Figur 1: Drosophila melanogaster äggkammare. (A) Fast ovariole från transgena flugor som uttrycker Fs(2)Ket-GFP som märker de nukleära kuvert och ubi-PH-RFP som märker plasmamembranen. Ovariolen består av att utveckla äggkammare i olika stadier. Mognad ökar längs den antero-bakre axeln med pelargonen vid den främre spetsen (vänster) där bakteriestamcellen bor och det äldre stadiet vid den bakre spetsen (höger). B)Z-projektion av levande äggkammare genom att snurra diskkonfokal mikroskopi i steg 6 av oogenes (vänster), där kärnan är centrerad i äggcellen. Kärnan migrerar för att anta en asymmetrisk position i steg 7 (höger) i kontakt med det främre plasmamembranet (mellan äggcellen och sjuksköterskans cell) och det laterala plasmamembranet (mellan äggcellen och follikulära cellerna). Denna position kommer att inducera bestämningen av dorsala sidan och därmed äggkammarens dorso-ventrala axel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62688/62688fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
I många årtionden har denna nukleära migration studerats på fasta vävnader genom immunostaining. Detta tillvägagångssätt har särskilt gjort det möjligt att visa att denna process beror på ett tätt nätverk av mikrotubuli4,5. Mer nyligen utvecklade vi ett protokoll som erbjuder villkor som är kompatibla med live imaging av äggcellen under flera timmar vilket gör det möjligt att studera denna process dynamiskt6.
Därför har vi för första gången kunnat beskriva att kärnan har förmånliga och karakteristiska banor under sin migration, en längs det främre plasmamembranet (APM) och en annan längs äggcellens laterala plasmamembran (LPM) i äggcellen (figur 2). Dessa senaste resultat understryker vikten av live-imaging protokoll när man studerar dynamiska processer såsom kärnmigration.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62688/62688fig02.jpg"> Figur 2: Schematisk representation av kärnans olika migreringsbanor. I steg 6 av oogenesen är oocyten en stor cell med en central kärna. I detta skede ställs den antero-bakre polaritetsaxeln in med ett bakre/laterala plasmamembran av oocytet i kontakt med follikulära celler och det främre plasmamembranet (i gult) är i kontakt med sjuksköterskans celler2. Vi har tidigare rapporterat att kärnan kan migrera antingen längs det främre plasmamembranet (APM), längs det laterala plasmamembranet (LPM), eller genom cytoplasman (STAD, direkt till antero-dorsala cortex)6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62688/62688fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
Oocytkärnan migration är ett fenomen på ca 3 h6, och hittills är händelsen som utlöser början av den faktiska migreringen okänd. Starten av migreringen kan också försenas av proteinmutanter som används för att studera denna mekanism. Dessa okända variabler motiverade oss att förvärva bilder under långa tidsperioder (10-12 h). Det är därför viktigt att se till att äggcellerna förblir vid liv. När äggkammaren utvecklas sträcker den sig längs den antero-bakre axeln från en sfärisk till en elliptisk form. Denna förlängning drivs av rotationen av follikulära celler, som uppstår från steg 1 till steg 8, vinkelrätt mot antero-bakre axeln7. Dessutom omger en rörformig muskelstel med pulsatil egenskap äggkamrarna. Dess fysiologiska funktion är att driva de utvecklande folliklarna mot ovidukten kontinuerligt8. För att begränsa de rörelser som inducerar svängningar i äggkamrarna efter deras dissekering konstruerade vi en observationsmikrokammare som mäter 150 μm i höjd (figur 3A). Denna höjd är marginellt högre än storleken på en follikel i steg 10 och 11. Det begränsar avsevärt provets vertikala rörelser samtidigt som äggkammarens rotation bevaras, vilket resulterar i begränsade defekter i follikelutvecklingen. Vi utför sedan live imaging i 12 h på dissekerade äggkammare genom flerpositions timelapse förvärv med hjälp av en spinning-disk confocal mikroskop. Här beskriver vi vårt protokoll för att studera oocyt nukleär migration mellan steg 6 och 7.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62688/62688fig3v3.jpg"> Figur 3:Schematisk representation av observationskammaren. (A) (Överst) Exakta dimensioner på aluminiumrutschbanan med höjderna (A') och omkretsarna (A'') på brunnen som borras i mitten av bilden. (B) (Nederkant) Ett täckglas som blockerar brunnen förseglas till diabilden med silikonfett. (C) (Top view) Dissekerade ovarioler utvecklas i ett bildmedium som täcks av ett gaspermeabelt membran. Halokarbonolja används för att stabilisera membranet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62688/62688fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
För att följa nukleär migration och exakt bedöma banor i äggcellen behövs markörer för både kärnhöljet och plasmamembranet. Med detta syfte har två transgener som har ett högt signal-/brusförhållande och inte bleknar under loppet av live-avbildning valts. För att märka plasmamembranet rekommenderas användning av en P[ubi-PH-RFP] som kodar pleckstrin Homology (PH) domänen för humanfosfolipas C ∂1 (PLC∂1) som smälts till RFP. Denna PH-domän binder till fosfoinositide PI(4,5)P2 fördelad längs plasmamembranet i äggcellen9. För kärnhöljet visar P[PPT-un1]Fs(2)Ket-GFP proteinfälla stam där GFP sätts in i genen kodning Drosophila ß-importin en homogen och intensiv signal10. Unga flugor (1-2 dagar gamla) placeras i färska injektionsflaskar som innehåller torr jäst 24-48 h före äggstocksdesektion.
För denna levande avbildningsanalys har en 1 mm tjock bit aluminium, som inte är reaktiv för provet, skurits i dimensionerna av en mikroskopibild. Den har ett hål med diametern 16 mm i mitten av diabilden som har kontraborerats till 0,85 mm. Denna räknare har ytterligare ett hål med diametern 6 mm med ett djup på 150 μm (figur 3A). Ett täckglas limmas med silikonfett (inert för provet) längst ner i aluminiumkammaren (Figur 3B). Efter att proverna placerats i den medelfyllda brunnen placeras ettmembransom är genomsläppligt till O 2 /CO2-utbytet över mediet och omges av halokarbonolja (figur 3C).
För dissekeringen rekommenderas att använda rostfria tångar med en spetsdimension på 0,05 x 0,02 mm och nålar med diametern 0,20 mm för separation av ovariolerna(figur 4B,C). De migrerande kärnorna avbildas på ett konvertiskt inverterat mikroskop med spinnskiva som är utrustat med en kamera. Flerpositionsbilder förvärvades genom timelapse var 15: e minut vid 24 °C. Ett intervall på 15 minuter gör det möjligt att utföra flerpositionsförvärv med begränsad fotoblekning av fluorescerande proteiner och fototoxicitet för proverna. Dessutom skulle ett kortare intervall inte ge mycket mer informativa uppgifter för att följa kärnkraftsbanorna. Filmerna bearbetas och analyseras via Fiji programvara11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthetize CO2 pad</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>789060</td>
			<td>Anesthetize flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip (24x50 mm)</td>
			<td>Knittel Glass</td>
			<td>VD12450Y100A</td>
			<td>Observation-chamber preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Dumont #5</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K342.1</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel needles</td>
			<td>Entosphinx</td>
			<td>20</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated fetal calf serum</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>F7524</td>
			<td>Imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin solution bovine pancreas</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>10516 - 5ml</td>
			<td>Imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/Streptomycin solution</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P0781</td>
			<td>Imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permeable membrane</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11521746</td>
			<td>Observation-chamber preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider Medium</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P04-91500</td>
			<td>Imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon grease</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>335148</td>
			<td>Observation-chamber preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disk confocal</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td>Nuclear migration observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltalef oil 10S</td>
			<td>VWR</td>
			<td>24627 - 188</td>
			<td>Observation-chamber preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nuclear migration in the drosophila oocyte

Levande celltomografi är särskilt nödvändigt för att förstå de cellulära och molekylära mekanismer som reglerar organellrörelser, cytoskeletonomorganiseringar eller polaritetsmönster i cellerna. När man studerar oocytkärna positionering, live-imaging tekniker är avgörande för att fånga de dynamiska händelserna i denna process. Drosophila äggkammare är en multicellulär struktur och ett utmärkt modellsystem för att studera detta fenomen på grund av dess stora storlek och tillgänglighet av många genetiska verktyg. Under Drosophila mid-oogenesis migrerar kärnan från en central position inom äggoiden för att anta en asymmetrisk position medierad av mikrotubule-genererade krafter. Denna migration och positionering av kärnan är nödvändiga för att bestämma embryots polaritetsaxlar och den efterföljande vuxna flugan. En egenskap hos denna migrering är att den förekommer i tre dimensioner (3D), vilket skapar en nödvändighet för live-avbildning. För att studera mekanismerna som reglerar nukleär migration har vi därför utvecklat ett protokoll för att odla de dissekerade äggkamrarna och utföra levande avbildning i 12 timmar genom timelapse-förvärv med spinndiskkonfokal mikroskopi. Sammantaget tillåter våra förhållanden oss att bevara Drosophila äggkammare levande under en lång tid, vilket gör det möjligt att slutföra nukleär migration i ett stort antal prover i 3D.

Före migreringen är kärnan dynamisk och svänger runt en central position under en period som definieras som förmigrering. Dessa små rörelser återspeglar en balans mellan att trycka och dra krafter som upprätthåller jämvikt i mitten av äggcellen. Genom att kvantifiera kärnornas banor har vi visat att APM- och LPM-banorna hade liknande proportioner. Vi definierar banans natur genom den första kontakten mellan kärnan och plasmamembranet6. Således når kärnan antingen APM eller LPM in...

Watch this Scientific Journal Video about Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte at JoVE.com

Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte

I Drosophilagenomgår oocytekärnan mikrotubuleberoende migration under oogenes. Här beskriver vi ett protokoll som utvecklades för att följa migreringen genom att utföra levande avbildning på äggkammare ex-vivo. Vår procedur upprätthåller äggkammare levande i 12 h för att förvärva flerpositions 3D-timelapse-filmer med spinndiskkonfokal mikroskopi.

Nukleär migration i Drosophila Oocyte

Live cell imaging is particularly necessary to understand the cellular and molecular mechanisms that regulate organelle movements, cytoskeleton ...

Denna teknik gör det möjligt att observera långa biologiska processer i dissekerade Drosophila äggkammare, såsom oocyte nukleär migration, med hjälp av levande bildmikroskopi. Detta protokoll beskriver hur man upprätthåller de dissekerade äggkamrarna levande i 12 timmar för att utföra levande bildmikroskopi. Till att börja med, pipett 200 mikroliter Schneider Medium och komplettera med 30 mikroliter på 10 milligram per milliliter insulin, tillsätt sedan fyra mikroliter värme inaktiverat fetala kalvserum.Använd en pipettspets för att applicera en liten mängd silikonfett runt hålet på undersidan av den punkterade bilden. Placera ett täckskydd och använd den breda änden av en pipettspets för att trycka på täckslippen för att platta silikonfettet för att skapa en silikonringsinredning på bilden. Överför de sövda honflugorna till dissekeringsbrunnen som innehåller 150 mikroliter av bildmediet.För dissekering av honan, använd tången för att ta tag i bröstkorgen och nypa dorsal buken nagelband med ett andra par tång. Ta försiktigt bort livmodern, ovidukten och muskelsymanten. Isolera och lossa äggstockarna som är synliga på nagelbandsöppningen.Placera en droppe på 10 till 15 mikroliter av bildmediet på äggstockarna och överför en äggstock till bildkammaren. För att separera ovariolerna, använd nålen för att hålla den bakre änden av äggstocken. Använd en annan nål för att försiktigt dra isär pelargonen för att reta ovariolerna.Håll mantlen med en nål och dra ovariolen genom de större kamrarna med en annan nål för att ta bort den återstående muskelsenan på äggkamrarna. Låt den ouppvärmda ovariolen sjunka och kontakta täcket. Ta bort de sena stadierna och resten av äggstockarna från mikrochambern med tång.Använd nålar för att försiktigt distansera ovariolerna för att underlätta förvärvet. Skär en liten 10 med 10 millimeter kvadrat av det genomsläppliga membranet. Applicera försiktigt membranet på toppen av bildmediet för att driva ut eventuella luftbubblor.Försegla sedan kammaren med ett tunt lager halokarbonolja runt brunnen på membranets kontur. Placera bildinställningen på glidhållaren på det inverterade mikroskopet och använd ett 40X-mål. Migrationen av oocyte kärnan av en vild typ ägg kammaren fångades med hjälp av levande bild mikroskopi.Kärnan når antingen det främre plasmamembranet eller det laterala plasmamembranet innan den glider längs banorna för att nå sin slutliga position i skärningspunkten mellan de två plasmamembranen. Membrandeformiteter, oorganiserade follikulära celler, hämmade celler och krympta atomkärnor är de första tecknen på döende äggkammare. Degenererade äggceller före åtta timmars avbildning upptäcks vanligtvis inte.Sällsynta fall av tidig degenerering beror dock på problem under dissekerings- eller monteringsstegen. Att skada äggkamrarna äventyrar deras överlevnad. Så delikat hand exakt dissekering och förberedelse av mikrochambern är av största vikt.Detta förfarande tillät oss att visualisera att oocyte kärnan kan ta tre olika banor under dess migration och olika organeller reglera dessa banor inom äggcellen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Optimering av sår Scratch analys för att upptäcka förändringar i Murine Mesenkymala Stromal Cell Migration Efter Skador av lösliga cigarett rökextrakt

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Funktionell kloning med hjälp av en<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyte Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-mål Kromogent Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering för jämförelse Gene Expression domäner i<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryon

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Methods to Study Mrp4-containing Macromolecular Complexes in the Regulation of Fibroblast Migration

Metoder för att studera Mrp4 innehållande Makromolekylär i regleringen av Fibroblast Migration

Multidrug resistance protein 4 (MRP4) is a member of the ATP-binding cassette family of membrane transporters and is an endogenous efflux transporter of ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Metoder för att undersöka lymfkörtel och hemocyter i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Funktionell Manipulering av Maternal Gene produkter Använda<em&gt; In Vitro</em&gt; Oocytmognad i Zebrafish

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion och Immunofluorescerande färgning av svamp kropp och ljusmätare nervceller i vuxen Drosophila melanogaster hjärnor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation analyser att utvärdera bindningen av Drosophila skåran med Trans-ligander och dess hämning av Cis-ligander

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Visualisering av tangentiella cellmigration i den framkallande Chick fiberoptiska Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Upptining, odling och bevarandet Drosophila cellinjer

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...