Name: nuclear migration in the drosophila oocyte
Uploaded: 2021-05-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte at JoVE.com

Protokolü geliştiren ve Şekil 3'ün bazı grafik öğelerini bizimle paylaşan Jean-Antoine Lepesant ve Nicolas Tissot'a son derece minnettarız. Şekil 4'ün fotoğraflarını çeken Fanny Roland-Gosselin'e teşekkür ederiz. Ayrıca bu tekniğin iyileştirilmesine katkıda bulunan yararlı tartışmalar için diğer laboratuvar üyelerine ve bu makalenin geliştirilmesine yardımcı olan yorumları için Nathaniel Henneman'a teşekkür ederiz. Fransa-Biyoimaging (ANR-10-INBS-04) üyesi Jacques Monod Enstitüsü'nün ImagoSeine çekirdek tesisini kabul ediyoruz. Maëlys Loh, Fransa Araştırma Bakanlığı'ndan (MESRI) doktora bursu ile desteklenmektedir. Antoine Guichet ve Fred Bernard ARC (Grant PJA20181208148), Association des Entreprises contre le Cancer (Grant Gefluc 2020 #221366) ve IdEx Université de Paris'ten (ANR-18-IDEX-0001) emergence hibesi ile desteklendi.

1. Görüntüleme ortamı hazırlığı
<ol><li>Kullanım gününde taze medya hazırlayın. Pipet 200 μL Schneider ortamı (L-Glutamin ve 0.40 g/L NaHCO3 içeren% 10 ısı inaktive fetal baldır serumu, 100 U / mL penisilin ve 100 mg / mL streptomisin ile tamamlanır).</li>
	<li>30 μL insülin ile takviye 10 mg / mL.</li>
	<li>4 μL ısı inaktive fetal baldır serumu ekleyin.</li>
</ol>2. Gözlem odası hazırlığı
<ol><li>Pipet ucu ile delinmiş slaydın alt tarafındaki deli...

<ol>
	<li>Merkle, J. A., Wittes, J., Sch&#252;pbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+between+somatic+follicle+cells+and+the+germline+patterns+the+egg+and+embryo+of+Drosophila.">Signaling between somatic follicle cells and the germline patterns the egg and embryo of Drosophila.</a> Current Topics in Developmental Biology. 140, 55-86 (2020).</li><li>Roth, S., Lynch, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetry+breaking+during+drosophila+oogenesis.">Symmetry breaking during drosophila oogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 001891 (2009).</li><li>Bernard, F., Lepesant, J. -. A., Guichet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleus+positioning+within+Drosophila+egg+chamber.">Nucleus positioning within Drosophila egg chamber.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 82, 25-33 (2017).</li><li>Koch, E. A., Spitzer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+effects+of+colchicine+on+oogenesis+in+Drosophila:+Induced+sterility+and+switch+of+potential+oocyte+to+nurse-cell+developmental+pathway.">Multiple effects of colchicine on oogenesis in Drosophila: Induced sterility and switch of potential oocyte to nurse-cell developmental pathway.</a> Cell and Tissue Research. 228 (1), 21-32 (1983).</li><li>Januschke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrosome-nucleus+complex+and+microtubule+organization+in+the+Drosophila+oocyte.">The centrosome-nucleus complex and microtubule organization in the Drosophila oocyte.</a> Development. 133, 129-139 (2006).</li><li>Tissot, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+molecular+cues+ensure+a+robust+microtubule-dependent+nuclear+positioning+in+the+Drosophila+oocyte.">Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte.</a> Nature Communications. 8, 15168 (2017).</li><li>Cetera, M., Horne-Badovinac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round+and+round+gets+you+somewhere:+collective+cell+migration+and+planar+polarity+in+elongating+Drosophila+egg+chambers.">Round and round gets you somewhere: collective cell migration and planar polarity in elongating Drosophila egg chambers.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 32, 10-15 (2015).</li><li>Hudson, A. M., Petrella, L. N., Tanaka, A. J., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mononuclear+muscle+cells+in+Drosophila+ovaries+revealed+by+GFP+protein+traps.">Mononuclear muscle cells in Drosophila ovaries revealed by GFP protein traps.</a> Developmental Biology. 314, 329-340 (2008).</li><li>Gervais, L., Claret, S., Januschke, J., Roth, S., Guichet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP5K-dependent+production+of+PIP2+sustains+microtubule+organization+to+establish+polarized+transport+in+the+Drosophila+oocyte.">PIP5K-dependent production of PIP2 sustains microtubule organization to establish polarized transport in the Drosophila oocyte.</a> Development. 135 (23), 3829-3838 (2008).</li><li>Vill&#225;nyi, Z., Debec, A., Timinszky, G., Tiri&#225;n, L., Szabad, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+persistence+of+importin-+b+explains+extended+survival+of+cells+and+zygotes+that+lack+the+encoding+gene+'+n+Villa.">Long persistence of importin- b explains extended survival of cells and zygotes that lack the encoding gene ' n Villa.</a> Mechanisms of Development. 3-4 (125), 196-206 (2008).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging.">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), (2012).</li><li>Chanet, S., Huynh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+sorting+requires+contractile+cortical+waves+in+germline+cells.">Collective cell sorting requires contractile cortical waves in germline cells.</a> Current Biology. 30 (21), 4213-4226 (2020).</li><li>Zhao, T., Graham, O. S., Raposo, A., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+microtubules+push+the+oocyte+nucleus+to+polarize+the+drosophila+dorsal-ventral+axis.">Growing microtubules push the oocyte nucleus to polarize the drosophila dorsal-ventral axis.</a> Science. 336 (6084), 999-1003 (2012).</li><li>Legent, K., Tissot, N., Guichet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+7+Oogenesis+using+fixed+and+live+imaging.">Chapter 7 Oogenesis using fixed and live imaging.</a> Drosophila Oogenesis: Methods and Protocols. 1328, 99-112 (2015).</li></ol>

Diğer protokoller, Drosophila yumurta odalarının canlı görüntüleme için ex vivo'nun nasıl hazırlanacağını ve kültüre edilmesini açıklar12,13. Bu protokolün yeniliği, içi boş bir alüminyum kaydırak, bir kapak kılıfı ve bir O2/CO2 geçirgen membran kullanılarak inşa edilen bir görüntüleme odasının kullanılmasıdır. Bu kurulumun ana avantajı, numuneye baskı uygulamadan Z'deki hareketi sınırlamakt?...

Birkaç yıldır, Drosophila oosit nükleer göçü incelemek için bir model sistem olarak ortaya çıkmıştır. Drosophila oosit yumurta odası adı verilen çok hücreli bir yapıda gelişir. Yumurta odaları, foliküler somatik hücrelerin epitel tabakası ile çevrili 16 mikrop hücresini (15 hemşire hücresi ve oosit) kapsar. Yumurta odası gelişimi, oositin büyüyeceği ve embriyonun erken gelişimi için gerekli rezervleri biriktireceği 14 aşamaya (Şekil 1A) ayrılmıştır. Gelişim sırasında, maternal determinantların mikrotübül reorganasyonu ve asimetrik taşınması üzerine, oosit antero-dorsal ve dorso-ventral eksenler boyunca polarize eder. Bu eksenler embriyonun ve yetişkinin bu oositin döllenmesinden kaynaklanan sonraki polarite eksenlerini belirler1. Oogenez sırasında çekirdek oositte asimetrik bir pozisyon benimsemiştir. Evre 6'da çekirdek hücrede ortalanır. Oosit tarafından alınan arka foliküler hücreler tarafından yayılan henüz tanımlanmış bir sinyal üzerine, çekirdek aşama 7'de ön ve lateral plazma membranları arasındaki kavşağa doğru göç eder (Şekil 1B)2,3. Bu asimetrik pozisyon, dorso-ventral eksenin belirlenmesini sağlamak için gereklidir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62688/62688fig1v2.jpg"> Şekil 1: Drosophila melanogaster yumurta odaları. (A) Plazma zarlarını etiketleyen nükleer zarfları ve ubi-PH-RFP'yi etiketleyen Fs(2)Ket-GFP'yi ifade eden transgenik sineklerden kaynaklanan yumurtalık düzeltildi. Yumurtalık, farklı aşamalarda gelişmekte olan yumurta odalarından oluşur. Olgunlaşma, mikrop kök hücresinin bulunduğu ön uçta (solda) germarium ve arka uçta (sağda) eski aşama ile antero-posterior eksen boyunca artar. (B) Çekirdeğin oositte ortaladığı oogenezin 6. Çekirdek, ön plazma zarı (oosit ve hemşire hücresi arasında) ve lateral plazma zarı (oosit ve foliküler hücreler arasında) ile temas halinde 7. Bu pozisyon, dorsal tarafın ve dolayısıyla yumurta odasının dorso-ventral ekseninin belirlenmesine neden olacaktır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62688/62688fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Uzun yıllar boyunca, bu nükleer göç immünostaining ile sabit dokular üzerinde çalışılmıştır. Bu yaklaşım özellikle bu sürecin yoğun bir mikrotübül ağına bağlı olduğunu göstermeyi mümkün kıldı4,5. Daha yakın zamanda, bu sürecin dinamik olarak incelenmesini mümkün hale getiren birkaç saat boyunca oosit canlı görüntüleme ile uyumlu koşullar sunan bir protokol geliştirdik6.
Bu nedenle, ilk kez, çekirdeğin göçü sırasında, biri ön plazma membranı (APM) ve diğeri oosit lateral plazma membranı (LPM) boyunca tercihli ve karakteristik yörüngelere sahip olduğunu tanımlayabildik (Şekil 2). Bu son sonuçlar, nükleer göç gibi dinamik süreçleri incelerken canlı görüntüleme protokollerinin öneminin altını çiziyor.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62688/62688fig02.jpg"> Şekil 2: Çekirdeğin farklı geçiş yollarının şematik gösterimi. Oogenezin 6. Bu aşamada, antero-arka polarite ekseni foliküler hücrelerle temas eden oositin arka/lateral plazma zarı ile ayarlanır ve ön plazma zarı (sarı) hemşire hücreleri ile temas halindedir2. Çekirdeğin ön plazma zarı (APM), lateral plazma zarı (LPM) boyunca veya sitoplazma (STAD, doğrudan antero-dorsal korteks)6boyunca göç edebileceğini daha önce bildirmiştik. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62688/62688fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Oosit çekirdek göçü yaklaşık 3 h6fenomenidir ve şimdiye kadar gerçek geçişin başlangıcını tetikleyen olay bilinmemektedir. Göçün başlangıcı, bu mekanizmayı incelemek için kullanılan protein mutantları tarafından da geciktirilebilir. Bu bilinmeyen değişkenler bizi uzun zaman dilimlerinde (10-12 saat) görüntü almaya motive etti. Bu nedenle, oositlerin hayatta kalmasını sağlamak önemlidir. Yumurta odası geliştikçe, antero-posterior eksen boyunca küresel bir şekilde eliptik bir şekle geçer. Bu uzama,1. Ek olarak, pulsatile özelliğine sahip tübüler bir kas kılıfası yumurta odalarını çevreler. Fizyolojik işlevi, gelişmekte olan folikülleri sürekli olarak yumurta kanalına doğru itmektir8. Yumurta odalarının diseksiyondan sonra salınımlarını teşvik eden hareketleri sınırlamak için, yüksekliği 150 μm olan bir gözlem mikro odası tasarladık (Şekil 3A). Bu yükseklik, 10 ve 11. Yumurta odasının dönüşünü korurken numunenin dikey hareketlerini önemli ölçüde sınırlar, böylece folikül gelişiminde sınırlı kusurlara neden olur. Daha sonra eğirme diski konfokal mikroskobu kullanarak çok konumlu zaman atlamalı alımlarla parçalanmış yumurta odalarında 12 saat boyunca canlı görüntüleme gerçekleştiriyoruz. Burada 6 ve 7.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62688/62688fig3v3.jpg"> Şekil 3: Gözlem odasının şematik gösterimi. (A) (Üst görünüm) Alüminyum kaydırağın hassas boyutları, slaydın ortasında açılan kuyunun yükseklikleri (A') ve çevresi (A'') ile. (B) (Alt görünüm) Kuyuyu tıkayan bir kapak kapağı silikon gresle kaydırağa kapatılır. (C) (Üst görüş) Diseksiyonlu ovarioles, gaz geçirgen bir membranla kaplı bir görüntüleme ortamında gelişir. Halokarbon yağı zarı stabilize etmek için kullanılır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62688/62688fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Nükleer göçü takip etmek ve oositteki yörüngeleri hassas bir şekilde değerlendirmek için hem nükleer zarf hem de plazma zarı için işaretleyicilere ihtiyaç vardır. Bu amaçla, sinyal/gürültü oranı yüksek olan ve canlı görüntüleme boyunca solmayan iki transgene seçilmiştir. Plazma membranını etiketlemek için, RFP ile kaynaşmış İnsan Fosfolipaz C ∂1'in (PLC∂1) Pleckstrin Homology (PH) etki alanını kodlayan bir P[ubi-PH-RFP] kullanılması önerilir. Bu PH etki alanı, oosit9'unplazma zarı boyunca dağıtılan fosfoinositid PI(4,5)P2'ye bağlanır. Nükleer zarf için, P[PPT-un1]Fs(2)GFP'nin Drosophila ß-importin'i kodlayan gen içine yerleştirildiği Ket-GFP protein kapanı suşu homojen ve yoğun bir sinyalgörüntüler 10. Genç sinekler (1-2 günlük) yumurtalık diseksiyonu öncesinde 24-48 saat kuru maya içeren taze şişelere yerleştirilir.
Bu canlı görüntüleme tahlil için, numune için tepkisel olmayan 1 mm kalınlığında bir alüminyum parçası, bir mikroskopi kaydırağı boyutlarına kesilmiştir. Slaytın ortasında 0,85 mm'ye karşı kontrabordlanmış 16 mm çapında bir deliğe sahiptir. Bu karşıbore, 150 μm derinliğe sahip ek bir 6 mm çapında deliğe sahiptir (Şekil 3A). Alüminyum haznenin alt kısmına silikon gres (numune için atıl) ile bir kapak saplanır(Şekil 3B). Numuneleri orta dolgulu kuyuya yerleştirdikten sonra, O2/CO2 değişimine geçirgen bir membran ortamın üzerine yerleştirilir ve halokarbon yağı ile çevrilidir (Şekil 3C).
Diseksiyon için, 0,05 x 0,02 mm uç boyutuna sahip paslanmaz çelik forseps ve yumurtalıkların ayrılması için 0,20 mm çapında iğneler kullanılması önerilir (Şekil 4B,C). Göç eden çekirdek, bir kamera ile donatılmış dönen disk konfokal ters mikroskop CSU-X1 üzerinde görüntülenir. Çok konumlu görüntüler, 24 °C'de her 15 dakikada bir zaman atlamalı olarak elde edildi. 15 dakikalık bir aralık, floresan proteinlerin sınırlı fotobleachingi ve numuneler için fototoksiklik ile çok pozisyonlu alımların gerçekleştirilmesini sağlar. Ayrıca, daha kısa bir aralık nükleer yörüngeleri takip etmek için çok daha bilgilendirici veriler sağlamaz. Filmler Fiji yazılımı11 aracılığıyla işlenir ve analiz edilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthetize CO2 pad</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>789060</td>
			<td>Anesthetize flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip (24x50 mm)</td>
			<td>Knittel Glass</td>
			<td>VD12450Y100A</td>
			<td>Observation-chamber preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Dumont #5</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K342.1</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel needles</td>
			<td>Entosphinx</td>
			<td>20</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated fetal calf serum</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>F7524</td>
			<td>Imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin solution bovine pancreas</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>10516 - 5ml</td>
			<td>Imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/Streptomycin solution</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P0781</td>
			<td>Imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permeable membrane</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11521746</td>
			<td>Observation-chamber preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider Medium</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P04-91500</td>
			<td>Imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon grease</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>335148</td>
			<td>Observation-chamber preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disk confocal</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td>Nuclear migration observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltalef oil 10S</td>
			<td>VWR</td>
			<td>24627 - 188</td>
			<td>Observation-chamber preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nuclear migration in the drosophila oocyte

Canlı hücre görüntüleme, özellikle organel hareketleri, sitoskeleton yeniden düzenlemelerini veya hücre içindeki polarite desenlerini düzenleyen hücresel ve moleküler mekanizmaları anlamak için gereklidir. Oosit çekirdek konumlandırmasını incelerken, bu sürecin dinamik olaylarını yakalamak için canlı görüntüleme teknikleri gereklidir. Drosophila yumurta odası, çok hücreli bir yapıdır ve çok sayıda genetik aletin büyüklüğü ve mevcudiyeti nedeniyle bu fenomeni incelemek için mükemmel bir model sistemidir. Drosophila orta-oogenez sırasında çekirdek, mikrotübül tarafından oluşturulan kuvvetlerin aracılık ettiği asimetrik bir pozisyonu benimsemek için oosit içindeki merkezi bir konumdan göç eder. Çekirdeğin bu göçü ve konumlandırılması, embriyonun ve sonraki yetişkin sineğinin polarite eksenlerini belirlemek için gereklidir. Bu geçişin bir özelliği, canlı görüntüleme için bir gereklilik yaratan üç boyutta (3D) gerçekleşmesidir. Böylece, nükleer göçü düzenleyen mekanizmaları incelemek için, parçalanmış yumurta odalarını kültüre etmek ve iplik disk konfokal mikroskopi kullanarak zaman atlamalı alımlarla 12 saat boyunca canlı görüntüleme yapmak için bir protokol geliştirdik. Genel olarak, koşullarımız Drosophila yumurta odalarını uzun süre canlı tutmamıza izin verir, böylece nükleer göçün tamamlanmasının 3D olarak çok sayıda örnekte görselleştirilmesini sağlar.

Göç öncesi, çekirdek dinamiktir ve göç öncesi olarak tanımlanan bir dönemde merkezi bir konum etrafında salınır. Bu küçük hareketler, oosit ortasında dengeyi koruyan itme ve çekme kuvvetleri dengesini yansıtır. Çekirdeklerin yörüngelerini ölçerek, APM ve LPM yörüngelerinin benzer oranlara sahip olduğunu gösterdik. Yörüngenin doğasını çekirdek ve plazma zarı arasındaki ilk temasla tanımlıyoruz6. Böylece, çekirdek, iki plazma zarının kesişimindeki son konum...

Watch this Scientific Journal Video about Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte at JoVE.com

Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte

Drosophila'da, oosit çekirdeği oogenez sırasında mikrotübül bağımlı göçe uğrar. Burada, yumurta odaları ex-vivo üzerinde canlı görüntüleme yaparak göçü takip etmek için geliştirilen bir protokolü açıklıyoruz. Prosedürümüz, iplik disk konfokal mikroskopi kullanarak çok konumlu 3D hızlandırılmış filmler elde etmek için yumurta odalarını 12 saat boyunca canlı tutar.

Drosophila Oosyte'de Nükleer Göç

Live cell imaging is particularly necessary to understand the cellular and molecular mechanisms that regulate organelle movements, cytoskeleton ...

Bu teknik, canlı görüntüleme mikroskopisi kullanılarak oosit nükleer göçü gibi parçalanmış Drosophila yumurta odalarında uzun biyolojik süreçleri gözlemlemeyi mümkün kılar. Bu protokol, canlı görüntüleme mikroskopisi yapmak için parçalanmış yumurta odalarının 12 saat boyunca nasıl canlı tutulamayacağını açıklar. Başlamak için, pipet 200 mikrolitre Schneider Medium ve mililitre insülin başına 10 miligram 30 mikrolitre ile takviye, sonra ısı inaktive fetal baldır serum dört mikrolitre ekleyin.Delinmiş slaydın alt tarafındaki deliğin etrafına az miktarda silikon gres uygulamak için pipet ucu kullanın. Bir kapak kılıfı yerleştirin ve kaydırağa silikon halka iç kısım oluşturmak için silikon gresi düzleştirmek için kapak ucuna basınç uygulamak için pipet ucunun geniş ucunu kullanın. Uyuşturulduğu dişi sinekleri görüntüleme ortamının 150 mikrolitresini içeren diseksiyon kuyusuna aktarın.Dişiyi kesmek için, toraksı kapmak ve dorsal karın manikülini ikinci bir çift forsepsle sıkıştırmak için forseps kullanın. Uterus, yumurta kanalı ve kas kılımını dikkatlice çıkarın. Manikür açıklığı sırasında görülebilen yumurtalık çiftini izole edin ve ayırın.Görüntüleme ortamının 10 ila 15 mikrolitresini yumurtalıklara yerleştirin ve bir yumurtalığı görüntüleme odasına aktarın. Yumurtalıkları ayırmak için, yumurtalığın arka ucunun tutulması için iğneyi kullanın. Yumurtalıkları ayırmak için germarium'ı dikkatlice çekmek için başka bir iğne kullanın.Kılıfi bir iğneyle tutun ve yumurta odalarında kalan kas kılıfi çıkarmak için yumurtalığı başka bir iğneyle daha büyük odalardan çekin. Duyulmamış yumurta boylarının batmasına ve kapakla temas etmesine izin verin. Geç aşamaları ve yumurtalıkların geri kalanınıps kullanarak mikro şarampolden çıkarın.Kazanımı kolaylaştırmak için yumurtalıkları dikkatlice uzaklaştırmak için iğneler kullanın. Geçirgen zarın 10 milimetre karesine küçük bir 10 kesin. Herhangi bir hava kabarcığı çıkarmak için membranı görüntüleme ortamının üstüne dikkatlice uygulayın.Daha sonra odayı membran konturu üzerindeki kuyunun etrafında ince bir halokarbon yağı tabakası ile hermetik olarak kapatın. Görüntüleme kurulumunu ters mikroskobun slayt tutucusuna yerleştirin ve 40X hedefi kullanın. Yabani tip yumurta odasının oosit çekirdeğinin göçü canlı görüntüleme mikroskopisi kullanılarak yakalandı.Çekirdek, iki plazma zarının kesişimindeki son konumuna ulaşmak için yörüngeler boyunca kaymadan önce ön plazma zarı veya lateral plazma zarı ile ulaşır. Membran deformiteleri, dağınık foliküler hücreler, bodur hücreler ve küçülmüş çekirdekler ölmekte olan yumurta odalarının ilk belirtileridir. Sekiz saatlik görüntülemeden önce dejenere olan oosit genellikle saptılmamıştır.Bununla birlikte, nadir görülen erken dejenerasyon vakaları diseksiyon veya montaj adımları sırasındaki sorunlardan kaynaklanmaktadır. Yumurta odalarına zarar vermek hayatta kalmalarını tehlikeye atmaktadır. Bu yüzden hassas el hassas diseksiyonu ve mikro şarampole hazırlanması her şeyden önemlidir.Bu prosedür, oosit çekirdeğinin göçü sırasında üç farklı yörünge alabileceğini ve farklı organellerin oosit içindeki bu yörüngeleri düzenlediğini görselleştirmemizi sağladı.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Yara Scratch Testi optimizasyonu Çözünür Sigara Duman Özü ile Hasar sonrası Fare Mezenkimal Stromal Hücre Göç Değişiklik Algılama

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Gelişim Biyolojisi

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Bir kullanılması Fonksiyonel Klonlama<em&gt; Xenopus</em&gt; Oosit ekspresyon sistemi

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Çoklu hedef Kromojenik Tüm montaj<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme Gen İfade Etki karşılaştırılması için<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Methods to Study Mrp4-containing Macromolecular Complexes in the Regulation of Fibroblast Migration

Yöntemler Fibroblast Göç Yönetmeliği Mrp4 içeren makromoleküler kompleksler Eğitim için

Multidrug resistance protein 4 (MRP4) is a member of the ATP-binding cassette family of membrane transporters and is an endogenous efflux transporter of ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Yöntemler Lenf Bezi ve Hemocytes içinde incelemek için<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Kullanılması Anne Gen Ürünlerinin Fonksiyonel Manipülasyonu<em&gt; İn Vitro</emZebra balığı&gt; Oosit Olgunlaştırma

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Hücre toplama Trans Drosophila çentikle bağlama değerlendirmek için deneyleri-ligandlar ve onun inhibisyon CIStarafından-ligandlar

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Görselleştirme teğet hücre göç gelişmekte olan piliç optik Tectum içinde

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Çözdürme, kültür ve Drosophila hücre hatları Cryopreserving

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...